PCR引物流程设计详解.pdf

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1、-PCR 引物设计流程详解本文目的：复制出 IL-4 基因片段一、查找基因序列1、进入 NCBI 主页，下拉选框选择 Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因，即 IL-4，点击搜索2、在搜索结果选择灵长类（Homo sapiens）2、在灵长类 IL-4 基因中选择需要的 mRNA 序列3、查看基因的相关信息外显子区域CDs 区域4、点击 FASTA 格式，并将序列保存到文档二、使用 primer premier 5.0 设计引物1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框2、点击搜索按钮，搜索引物3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知，外显子区域分别为：1-200、2

2、01-248、249-425、426-618，又知在引物设计时引物位置最好跨越一个含子，PCR 产物长度通常为 100-150bp，故设定上游引物位置为201-248，下游引物位置为 249-425，产物长度为 100-150bp）4、确认条件后，显示搜索结果4、双击选中得分最高的引物查看引物情况（上图为上游引物情况，下图为下游引物情况）5、将设计的上下游引物复制出来，保存到文档中.z.-三、使用 oligo 6.0 对设计的引物进行评价1、建立新文件，将从 ki 上获得的 cDNA 复制进输入框，并点击 accept 接收2、接收后显示出该序列的相关信息3、点击 edit 按钮录入用 pri

3、mer 设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击 accept 按钮接收4、同理，录入下游引物5、分析上下游引物二聚体形成情况6、分析上下游引物发卡形成情况7、分析上下游引物 GC%8、检测上下游引物与 PCR 模板其它位置错配情况9、分析 PCR 整体情况四、引物特异性检验（primer blast）1、进入 NCBI 主页，并选择 blast2、选择 primer blast3、在输入框输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击 get primer进行对比4、查看 blast 结果Blast 结果显示，尽管 IL-4 与其它基因有相似区，但是引物的 3端没有完全互补。故设计的引物能特异性的扩增出目的基因.z.