枯草芽孢杆菌实验报告.pdf

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1、微生物技术综合实验年级：13 级生物工程（专升本）班级：01学号：26姓名：徐红贞指导老师：刘凤霞教授日期：二零一三十月五号目目录录1 实验目的及原理1实验的 1实验理 12 实验材料1实验器 1实验剂 1培基 22.3.1生长培基22.3.2鉴定培基22.3.3摇瓶培基23 试验方法2目原仪试养养养养仪器的备 2培养基的置 2初步筛选及定 23.3.1采集样33.3.2富集养33.3.3稀释分离、化33.3.4筛3复筛及定43.4.1革兰色4酶活力的定43.5.1摇瓶养4准配鉴土培纯初鉴染测培3.5.2酶液释43.5.3酶液定44 结果分析 5平板涂布离5平板划线离5初筛5复筛5摇瓶养6酶活

2、力定65 参考资料76 附录8稀测分分培测微生物上游技术综合实验枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定1.1.实验目的及原理实验目的及原理实验目的实验目的（1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。（2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。（4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。（5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。实验原理实验原理选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物

3、。将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。2.2.实验材料实验材料实验仪器实验仪器枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平 三角瓶烧杯 试管酒精灯 擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌锅玻璃珠 显微镜无菌铲胶头滴管记

4、号笔试管架棉塞牛皮纸报纸 细绳无菌纸袋电炉 搪瓷缸 分光光度计 恒温水浴锅 白瓷皿等。实验试剂实验试剂1 碘液储备液：称取碘化钾溶于约 300mL 水中，加入碘，搅拌溶液，移入 500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。2 碘液使用液：称取碘化钾，溶于约 300mL 水中，移入 500mL 容量瓶中，准确加入碘液储备液，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每天配制一次）。3 20g/L 可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉于 250mL 烧杯中，用少量水调成糊状，在搅拌下加入约 80mL 沸水，继续加热煮沸至透明（20min），冷却后用水定容至 100mL（此溶液需当天配制，存放冰箱备用

5、）4 磷酸缓冲溶液：称取磷酸氢二钠，柠檬酸，用水溶解定容至1000mL，配好后用酸度计校正其 pH 至5 L 盐酸溶液：量取浓盐酸，用水稀释定容至 1000mL。草酸铵结晶紫 番红 碘液 95%酒精无菌水香柏油 吸水纸 擦镜纸培养基培养基2.3.12.3.1 斜面培养基斜面培养基牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g 琼脂 1520g，自来水 1000ml，pH 2.3.22.3.2 鉴定培养基鉴定培养基可溶性淀粉 20g,硝酸钾 1g，磷酸氢二钾,氯化钠,硫酸镁，硫酸亚铁，琼微生物上游技术综合实验脂 20 g,自来水 1000ml，校正 pH 至,2.3.32.3.3 摇瓶培养基摇瓶培

6、养基玉米粉 2g，黄豆饼粉，氯化钙，硫酸镁，氯化钠，磷酸氢二钾，磷酸氢二钠，柠檬酸钠，硫酸铵,(溶解后加)，校正 pH 值3.3.实验方法实验方法仪器的准备仪器的准备准备试管若干支，洗净晾干，其中 7 支各装 9 毫升蒸馏水（或自来水），上塞，10 支一捆 121 度高压灭菌 20-30 分钟。培养皿若干个并洗净晾干，每 5 个一包，高压灭菌。移液管洗净塞上脱脂棉，用报纸条包好、捆扎高压灭菌。准备一个三角瓶装入自来水 300-400 毫升，上棉塞并用纸包好高压灭菌。培养基的配置培养基的配置按各培养基配方配置培养基，并将生长培养基分装 6 支试管，上棉塞，放入大烧杯中待灭菌。其余的培养基分装入三

7、角瓶内，上棉塞，包扎灭菌。初步筛选及鉴定初步筛选及鉴定3.3.13.3.1 采集土样采集土样用无菌铲铲去表层 5-10 厘米，用无菌器具规范采取 50-100 克，装入无菌纸袋中并记录采集的时间、地点及植被情况等等。3.3.23.3.2 富集培养富集培养将采集的土样称取 5 克，放入装有 45 毫升无菌水的三角瓶中，放入恒温振荡培养箱中于 37 度下培养 10-20 分钟。3.3.33.3.3 稀释分离、纯化稀释分离、纯化枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定取装有 9 毫升无菌水试管 5 支，用记号笔编上 10、10、10、10、10、10 取已稀释成 10 土壤液，振荡后静置 30 秒，用无

8、菌的移液管吸取 1 毫升土壤悬液加入 10 的无菌水试管中，并在试管内轻轻反复吸数次，使之充分混匀，即成 10-2土壤稀释液。同法从 10-2的试管中吸取 1 毫升稀释液加入编号为 10-3的无菌水试管中，混匀后即为 10-3土壤稀释液，依次连续稀释为 10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。并做 9 个平板，每个稀释度做 3 个。用一支新的无菌移液管，由低浓度开始（10,10,10），从各试管土壤稀释液中各吸取 1ml，对号注入生长培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃棒涂匀，每个浓度做三个平板（重复），倒置于 37温箱中培养 24 到 48 小时。培养后，挑选 10-5梯度上的单菌

9、落进行平板划线分离，共划四个平板，并进行编号 1、2、3 号，于 37倒置培养 24h。3.3.43.3.4 初筛初筛透明圈实验将疑枯草芽孢杆菌用平板划线法接种于鉴定培养基上，在 37恒温培养箱中培养 24-48h 后，用胶头滴管将碘液直接滴于菌落周围，观察现象。阳性反应（淀粉被分解）菌落周围出现透明圈，呈紫色；阴性反应则无透明环，呈深蓝色。（透明圈的大小可初步判断该菌水解能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低）。复筛及鉴定复筛及鉴定革兰氏染色：（1）涂片：左手持培养皿，右手持接种环，用接种环从培养皿中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一滴无菌水于载玻片中央，

10、用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，-3-4-5-2-7-1-2-3-4-5-6微生物上游技术综合实验涂成一薄层。（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。（3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动 34 次，共约34 秒。要求玻片温度不超过60，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。（4）染色1 初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗至流下的水无色为准。2 媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗至流下的水无色为准。3 脱色：将载玻片上的水用吸水纸吸干，并衬以白背景，用

11、 95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约 2030 秒，立即用水冲净酒精，至流下的水为无色为准。4 复染：吸水纸吸干，后用番红液染 12 分钟，水洗至流下的水为无色为准。（5）.镜检：干燥后，置显微镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。酶活力的测定酶活力的测定3.5.13.5.1 摇瓶培养摇瓶培养选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于 5 毫升无菌生理盐水中吸取此液体加入液体培养液中，30 度摇瓶培养 72 小时。枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定3.5.23.5.2 酶液稀释酶液稀释取发酵液进行

12、4000r/min 离心 5 分钟，取上清夜，用磷酸缓冲液稀释酶活力为 6570U/ml，便于准确测定。3.5.33.5.3 酶液测定酶液测定1 吸取 20g/L 可溶性淀粉溶液和磷酸缓冲溶液于大试管中，在 60恒温水浴中预热平衡 5min。2 加入待测酶液，立即摇匀并用秒表计时，准确反应 5min。3 立即用结晶干燥的吸管吸取上述反应液至预先盛有 L HCl 溶液和碘液使用液的 10mL 具塞比色管中，摇匀。4以 LHCl 溶液碘液使用液和磷酸缓冲溶液的混合溶液做空白，于 660nm 波长下，用 1cm 比色皿迅速测定其吸光度，根据吸光度查附录“吸光度与测试-淀粉酶酶浓度对照表”，求得测试溶

13、液的浓度 C。4.4.结果分析结果分析平板涂布分离平板涂布分离经 48h 培养后，结果见表 4-1表表 4-14-1平板涂布菌落状况平板涂布菌落状况123菌落形态菌体成片生长，菌体成片生长，菌落充满整个有 3 个单菌落有 1 个单菌落10-3平板，有 5 个单有褶皱，表面光菌落滑，湿润呈圆形乳白色10-4平板四周有菌菌体充满整个生长-5平板，无单菌落10有 2 个单菌落微生物上游技术综合实验有杂菌生长，并有单菌落有杂菌生长充满平板有 1 个单菌落经分析，由于操作不熟练导致 10-4、10-5梯度有少量菌体生长，10-6梯度中菌体少且培养时为倒置培养从而导致无菌落生长。平板划线分离平板划线分离挑

14、选 10-5梯度的菌落进行平板划线分离，经 48h 培养后，每平板最大菌落结果见表 4-2表表 4-24-2平板划线菌落状况平板划线菌落状况1 号2 号3 号4 号大小cm形态表面光滑，有褶皱呈乳白色或淡黄色圆形经分析，由于菌体为野生菌而各自的生长能力不同，从而导致菌落大小不同。初筛初筛培养 24h 后，结果见表 4-3表表 4-34-3透明圈大小透明圈大小1 号2 号3 号4 号透明圈大小经分析，菌落周伟产生透明圈，可判断该菌可以产生淀粉酶，由于菌体本身枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定利用淀粉的能力不同，而导致透明圈直径各异。复筛复筛在显微镜下观察，发现菌体成杆状且呈现蓝紫色，初步判断其

15、为杆菌且为阳性菌。摇瓶培养摇瓶培养培养 52h 后，用碘液检验，结果见表 4-4表表 4-4 24h4-4 24h 碘液检验碘液检验1 号深蓝色2 号深蓝色3 号焦糖色4 号棕色颜色表表 4-5 72h4-5 72h 碘液检验碘液检验1 号深蓝色2 号深蓝色3 号棕黄色4 号棕黄色颜色经分析，3 号、4 号摇瓶中的菌产生淀粉酶的能力较强，故对其进行淀粉酶活力测定。酶活力测定酶活力测定在 660nm 波长下，吸光度见表 4-6表表 4-64-6吸光度吸光度123吸光度A根据附录表可知，当吸光度为时，相对应的酶浓度为mL，当吸光度为时，相微生物上游技术综合实验对应的酶浓度为 mL，则其平均浓度为

16、u/mL。-淀粉酶活力：X=cn=1=u/mL式中：X样品的酶活力，u/g(u/mL)；c测试酶液平均浓度，u/mL；n样品的稀释倍数5.5.参考资料参考资料1徐颖 高产-淀粉酶生产菌的筛选鉴定及其酶学性质研究 D-四川大学20072刘雅琴.陈海魁.李瑞雪-淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究 J-安徽农业科学 2010(34)3刘雅琴.陈海魁.孔令全-淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育 J-畜牧与饲料科学 2010(94刘雅琴.乌日娜.段金华 耐酸性-淀粉酶产生菌的发酵条件优化 J-安徽农业科学 2010(35)5卢福芝.钱丰.杨琴.劳斌 淀粉酶产生菌的分离筛选 J-河池学院学报2012(2)6 潘康成 产酶芽孢杆菌的筛选、鉴定及对肉鸡的微生态效应研究 D-四川农业大学 20097?张建军 淀粉酶产生菌的筛选及-淀粉酶在米曲霉中的同源表达 D?-福枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定建师范大学 20098 李力 高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢杆菌的选育及酶基因阳性克隆的筛选D?-新疆农业大学 2009附录：附录：吸光度与测试吸光度与测试-淀粉酶酶浓度对照表淀粉酶酶浓度对照表吸光度（A）酶浓度（c）吸光度（A）酶浓度（c）吸光度（A）酶浓度（c）u/mLu/mLu/mL微生物上游技术综合实验枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定