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1、河北大学 2007 届学年论文细胞周期调控的分子机制摘要细胞周期是生命活动中的一个最重要的过程，对它的研究是现代生命科学研究的一个重要内容。细胞周期的动力主要来自于细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)，它的活性则是通过细胞周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)进行调节。关键词：细胞周期分子调控细胞周期蛋白周期蛋白依赖性蛋白激酶1河北大学 2007 届学年论文ABSTRACTABSTRACTCell cycle is one of the most important processes of the life.It is an important contentof the

2、study of modern life science research.The main driving force of the cell cyclecomes from the cyclin-dependent kinase(CDK)and its activity is through the cyclinand cyclin-dependent kinase inhibitor(CKI)to regulate.KeyKey wordswords:Cell cycleMolecular RegulationCyclinkinase2Cyclin-dependent protein河北

3、大学 2007 届学年论文一前言近年来,以 Cyclin-CDK 为中心的细胞周期分子调控机制已经确立并取得了很 大 的 进 展,即 细 胞 周 期 蛋 白(Cyclin)与 细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)结合后通过磷酸化调节一系列靶分子,这些下游分子激发一系列下游事件的贯序发生,最终导致 DNA 的复制和有丝分裂,使细胞周期严格按照 G1-S-G2-M 循环运转。另一方面在细胞周期正常事件受到干扰时,细胞会采取补救措施进行调控,杜绝差错的发生。例如,在哺乳类细胞中,中等剂量 X辐射导致的 DNA 损伤,可以通过 G1/S

4、期关卡点或 G2/M 期关卡点来阻断细胞周期的异常运行,以赢得充分的时间来修复损伤的 DNA。这就是细胞周期关卡调控(checkpoint control)1。关卡调控通过监测细胞分子事件的程序,也即保证细胞周期在上游事件正确完成的前提下,才启动下游事件,确保细胞周期期相转换的正确性,与 Cyclin/CDK 中心控制体系比较,它具有更为特殊的生物学意义2。由于细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)通过控制Cyclin/CDK激酶复合物的有序激活和失活从而抑制细胞分裂并阻滞细胞周期期相的转变,CKI又被视为细胞周期关卡调

5、控元件,对细胞周期进行负调控,特别是在 G1/S 期、G2/M 期、中期/后期转换点起重要作用。对于多细胞真核生物而言,细胞增殖还受机体的整体调控,所以各个细胞增殖的调控除了上述细胞内源性因子的调控以外,还有细胞外源性因子的调控。3河北大学 2007 届学年论文二本论2.1 细胞周期及其中心控制体系2.1.1 细胞周期细胞周期(cell cycle)是保证细胞正确增殖的过程,对一个细胞而言,在分裂过程中获得生存所必需的物质是最关键的环节,尤其是合成遗传所需物质。细胞周期可划分为 4 个时相,即 G1、S、G2 和 M 期。在 G1 期中,细胞不断生长发育。当达到一定体积时,细胞就会进入 DNA

6、 合成(S)期,细胞内遗传物质开始复制,最终形成两套完整的染色体组,细胞便进入有丝分裂前的准备(G2)期。在有丝分裂(M)期,染色体组分离、细胞质分裂,两套染色体平均分配给两个子细胞,从而完成一个细胞周期。2.1.2 细胞周期调控理论的提出生理学家和胚胎学家根据对海底无脊椎动物及两栖类卵细胞的研究结果，认为细胞周期受一种不断在有丝分裂和间期(包括 Gl 期、S 期和 G2 期)之间来回摆动的生化反应机制的控制，称之为时钟。理论家通过对停止在细胞周期特定阶段的酵母突变体的分析，认为细胞周期是一系列依赖性事件准确而有序地进行的过程，即后一事件的起始依赖于前一事件的完成，如有丝分裂的起始必须依赖于D

7、NA 复制的完成，称为骨牌(domino)理论3。两种理论似乎很不一致，但细胞融合实验研究结果发现，将 M 期的细胞与处于间期的任何阶段的细胞融合后，可使处于间期的细胞出现有丝分裂现象，表明有丝分裂和间期的细胞质是不同的，而有丝分裂的细胞质控制所有间期的细胞质的活动，此现象支持时钟理论;另一方面，将处于两个不同间期(如 Gl 和 G2)细胞进行融合，则处于 G2 期的细胞必须等 Gl 期细胞进人 G2 期后才能使细胞周期继续进行，此现象支持骨牌理论。后来就将这两种理论综合起来，认为所有细胞的细胞周期都是受一种以磷酸化一去磷酸化为基础的中心控制体系的调控4。2.1.3 中心控制体系的分子基础中心

8、控制体系是由专门调控细胞周期的一系列基因表达产物所组成，其中以周期素(Cyclin)基因和周期素依赖性蛋白激酶(CDK)基因这两大基因家族最为关键。4河北大学 2007 届学年论文2.1.3.1 周期素(Cyclin)Timothy Hunt(1983)首次发现海胆卵受精后，其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡:在每一轮间期开始合成，G2/M 时达到高峰，M 结束后突然消失，下轮间期时又重新合成，故命名为周期蛋白(Cyclin)5。后来在青蛙、爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况，各类动物来源的细胞周期蛋白mRNA 均能诱导蛙卵的成熟。在高等真核细胞中，Cyclin 分为 A、B

9、、C、D 和 E五类，它们分别在细胞周期的不同时期中合成、积累。CyclinA 由 432 个氨基酸组成，其中210295 位氨基酸为“Cyclin box”(细胞周期蛋白盒)，在 N 末端 47-55 位氨基酸序列称为“destruction box(毁灭盒)，其保守序列RXXLXXIXN可特异性地被泛素识别，在M期可通过泛素途径降解。CyclinA 与 CDK2 结合，在GlS 转变过程中被活化，从而调节细胞增殖。此外，CyclinA 也与 p34cdc2结合，在 G2M 转变过程中与 CyclinB-p34cdc2复合体一起协同作用。CyclinB 在人细胞中包括 Bl 和 B2 两种亚

10、型。CyclinB1 由 433 个氨基酸组成，其 201-288 位氨基酸序列为“Cyclin box。其 N 末端 4250 位氨基酸序列为“毁灭盒”，在 M 期也通过泛素途径降解。CyclinB1 在 S 晚期开始合成，在G1M 转变过程中，CyclinB1 与 p34cdc2结合，通过 p34cdc2上 Thr14 和 Tyr15的脱磷酸化而活化。CyclinC 由 303 个氨基酸组成，其 58-136 位氨基酸为“Cyclinbox”，在其 C 末端存在一个 PEST 序列。CyclinC 可能在 G1 期起作用，但目前尚末分离到与其相对应的 CDK。已发现的 CyclinD 家族

11、包括 D1、D2 和 D3 三个亚型。编码人类 CyclinD1 的基因位于染色体 11q13 上，全长约 15kb，含有 5 个外显子，启动子区域无 TATA盒，但却含有转录因子 SP1 的结合位点，其表达产物由 295 个氨基酸组成。在Gl 中期，向受血清刺激的成纤维细胞中微注射CyclinDl 的反义质粒或抗体可抑制 CyclinD1 的功能，阻止细胞进人 S 期，表明D 型 Cyclin 在 GlS 转变中起重要作用。CyclinD2 和 CyclinD3 分别由 290 和 292个氨基酸组成，在三类 D 型 Cyclin 中的第 56141 位氨基酸均为保守序列，称为“Cyclin

12、 box”。在 CyclinD 的 C 末端存在一个富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基的序列，称为 PEST 序列，该序列在蛋白质降解过程中具有重要作用。CyclinD 的 N 末端则含有一段与 SV40T 抗原和腺病毒 E1A 等病毒 DNA 的原癌蛋白共同的序列:Leu-X-Cys-x-Glu(x 为其它氨基酸残5河北大学 2007 届学年论文基)，该序列是与 Rb 蛋白结合的部位。CyclinE 由 395 个氨基酸组成，其中 128-215位氨基酸序列为“Cyclin box”，在 C 末端也含有一个 PEST 序列。在 Hela 细胞中 C

13、yclinE 的量在 G1 中期上升，G1 晚期或 S 早期达到高峰;在 Gl 晚期，CyclinE可与CDK2结合对于细胞顺利进入S期具有重要作用。射线可使CyclinE-CDK2激酶活性丧失，从而阻滞细胞周期进程。2.1.3.2 CDKs(Cyclin-dependent Kinases)早在 20 世纪 70 年代初期，Johnson 等就曾研究发现当把同步到间期不同时期的 Hela 细胞与 M 期的 Hela 细胞相融合时，会产生早熟染色体凝集的现象，提示着 M 期细胞中存在着一些可诱导间期细胞提前进人分裂期的因子，这种因子被称为 M 期促发因子(M-phase promoting f

14、actor，MPF)，遍存于所有真核生物的 M 期细胞中。同时，在以酵母为材料的研究中发现了一些与细胞周期调控有关的基因，这些基因被称之为细胞分裂周期基因(cell division cycle gene，cdc)。1987 年，纳斯从人体中分离到与酵母 cdc2 同源的基因，并命名为 CDK，该基因的编码产物为周期蛋白依赖性激酶蛋白家族中的一员。CDK 在进化上高度保守，其活性调节由其它蛋白的磷酸化和去磷酸化决定，即磷酸基仅连在蛋白分子上或从蛋白分子上脱落下来6，从而使细胞沿着细胞周期顺序不断地进行分裂。后来发现，MPF 之所以能够诱导期细胞提前进人分裂期，就是因为其具有使多种底物蛋白磷酸化

15、的功能，即属于蛋白激酶，现已研究证实，MPF 是由催化亚基和调节亚基两部分所组成，其催化亚基是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)7。CDK 是细胞周期运转必须的蛋白质。在单细胞真核生物中，负责细胞周期内蛋白质磷酸化的 CDK 通常只有一种，在芽殖酵母中是 cdc28，在裂殖酵母中是 cdc2。在多细胞真核生物中，参与细胞周期的 CDK 有多种。在人体细胞中，控制 Gl 期的主要是 CDK2、CDK4 和 CDK6;S 期和 G2 期依赖于 CDK2;而 M 期主要由 CDK1(相当于裂殖酵母的 CDC2)负责。对 CDK 单体及 CDK-Cyclin 复合体的晶体结构分析表明，CDK 以单体

16、形式存在时，其催化中心被掩盖在内部，因而没有活性，与 Cyclin 的结合导致了 CDK 结构的变化，催化中心暴露出来，形成了有活性的 CDK。2.2 中心控制体系对细胞周期的调控2.2.1 CDK 活性的调节6河北大学 2007 届学年论文由于细胞周期的各个时期内有着不同的事件发生，因此作为推动细胞周期运行的 CDK 的活性受到严格的调节。周期素(Cyclin)在不同时期中合成积累并与相应的 CDK 结合，以调节 CDK 活性。Cyclin 作为蛋白激酶复合体的调节亚基，对 CDKS 起着正性调节作用，即激活CDK 的蛋白激酶活性，促进细胞周期向前运转。在整个细胞周期中，CDK 的量保持恒定

17、，但其调节蛋白。Cyclin 在细胞周期的不同时期中周期性地积累与分解。在细胞周期进程中，存在着两个关键性的转折点，即 Gl-S 和 G2-M，细胞一旦通过了这两个转折点，就开始了 DNA 的复制和细胞的分裂。在 Gl 后期，D型细胞周期蛋白(CyclinD)合成、积累，与蛋白激酶 CDK4 或 CDK6 相结合，激活 CDK4 或 CDK6 的蛋白激酶活性，使 Rb 蛋白磷酸化，导致受 Rb 蛋白调控的转录激活因子 E2F 解阻遏，促使一些与 DNA 复制有关的酶蛋白基因得以表达，从而启动细胞 DNA 的复制。进人S 期后，CyclinD 分解，CyclinE 和 CyclinA 逐渐积累并

18、先后结合 CDK2，激活 CDK2，使 DNA 复制继续进行。进人 G2 期后，CyclinE 分解，CyclinB 合成并与 CDK1(p34cdc2)相结合。p34cdc2属于 Ser-Thr 蛋白激酶家族，其功能结构域中 Tyr15的磷酸化状态决定着 p34cdc2的活性。与 CyclinB之前p34cdc2一直处于磷酸化状态，这是由于weel或mikl基因的表达产物使p34cdc2上的 Tyr15和 Thr14 分别被磷酸化而呈失活状态。在 G2M 转折点处，由 cdc25基因的表达产物(一种蛋白磷酸酶)可将 p34cdc2上 Tyr15或 Thr14 的磷酸基水解下来，活化 p34c

19、dc2。活化的 p34cdc2导致一些与细胞分裂有关的蛋白质磷酸化，如:核纤层蛋白磷酸化，导致核纤层蛋白的溶解和核膜的崩解;组蛋白 H1 被磷酸化，导致染色体凝聚;微管蛋白被磷酸化，导致细胞骨架的重新组合，从而推动了细胞分裂的进程。进人 M 期后，CyclinB 和泛素(ubiquitin)也分别被磷酸化。泛素是真核细胞内约 76 个氨基酸残基的一类小分子蛋白，它可在一种特定的连接酶作用下，与磷酸化的 CyclinB 相连接。然后，在依赖泛素的蛋白水解酶作用下，将泛素连同CyclinB 一同降解掉。CyclinB 的降解使 p34cdc2因失去调节单位而失活，同时被磷酸化8，细胞又处于静止期(

20、G0)。此后，当有新的 CyclinD 合成后，细胞又开始新一轮的细胞周期。2.2.2 CDK 活性的抑制7河北大学 2007 届学年论文CDK 的活性除了受 Cyclin 的正向调节外，还受另外一类蛋白质的负向调节，这类蛋白质被称为依赖蛋白激酶抑制剂(Cyclin-dependent kinase inhibitons，CKIs)9。在芽殖酵母中，已发现 2 种 CKI，Farl 抑制 cdc28-Cln 复合体的活性，Sicl 则通过抑制 Cdc28-Clb5、6 复合物来调节细胞进人 S 期的时间。在裂殖酵母的Gl期，依赖周期蛋白激酶抑制剂 Ruml 结合在cdc2-cdc13复合物上，

21、维持 cdc13蛋白在低水平，以防止不成熟的 M 期出现。哺乳动物细胞中有两类 CKI，一类是 Cip/Kip 家族，它包括 p22、p27 和 p57;另一类是 Ink4 家族，它拥有 p15、p16、p18 和 p19 四种 CKI。前一类主要参与调节 G1 期和 Gl/S 转变中 CDK2 和 CDK4/6与 Cyclin 复合物的活性，后一类则只抑制 CDK4-CyclinD 复合体的活性。8在正常的二倍体成纤维细胞中，p21 的分子量为 21KD，p21 与 Cyclin、CDK、PCNA(增殖细胞核抗原)形成四聚体复合物，能有效抑制多种cyclin-CDK 复合物的活性，其中包括C

22、yclinD-CDK4，CyclinE-CDK2 以及 CyclinA-CDK2 等，这些Cyclin-CDK 复合物都是 Gl-S 期转换中所需要的，所以 p21 可引起细胞在 Gl 期阻滞而不进人 S 期，抑制了哺乳动物细胞过度繁殖。p21 与 Cyclin、CDK 和 PCNA组成四聚体后，CyclinD 上 N 末端的 Leu-X-Cys-X-Glu 序列与 Rb 蛋白的结合被抑制。Rb 蛋白既可与 CyclinD 结合，又可与 E2F 结合。E2F 在许多 DNA 合成和细胞生长调控有关的基因的启动子区域都存在着结合位点，这些基因包括胸苷激酶、二氢叶酸还原酶、DNA 聚合酶、Rb 蛋

23、白、C-myc 和 N-myc 等的编码基因。E2F 可激活这些基因的转录启始，从而促使细胞进人 G0 期或分化。低磷酸化的Rb 蛋白可与 E2F 结合，阻抑E2F 的转录活性。Rb 蛋白与 Cyclin-CDK 结合而被磷酸化，释放 E2F，进而使 E2F 的转录激活作用活化。p21 可通过其 N 端结构域与 Cyclin-CDK 结合，抑制 Cyclin-CDK 磷酸化 Rb 蛋白，阻止细胞进人 S 期。PCNA 是 DNA 聚合酶的功能亚基，当细胞在S 期发生 DNA 损伤时，p21可通过其 C 端结构域与 PCNA 直接结合而抑制 DNA 聚合酶的活性，阻止损伤DNA 长链的复制。但

24、p21 不抑制 DNA 复制起始复合物的形成和 DNA 缺口的填补，所以可保证损伤 DNA 的修复得以正常进行。p21 还可在 CDK 缺乏时借助与DNA 聚合酶的亚单位(PCNA)竞争性结合，从而抑制 DNA 聚合酶的活性或者阻断 DNA 模板的滑动，最终影响 DNA 的复制。此外 p21 基因的启动子区域含有 p53 蛋白的结合位点。当用射线或化学诱变剂引起 DNA 损伤后，可诱导 p538河北大学 2007 届学年论文基因表达，促进 p21 基因转录，使 p21 通过抑制 Cyclin-CDK，而使细胞被阻断在 Gl 期，使损伤的 DNA 有机会得以修复。这样，p21 分别通过对 CDK

25、 和 PCNA的抑制来阻止发生在 S 期以前和 S 期的损伤 DNA 的复制，从而保证了进人子细胞的染色体的完整性。p27、p57 与 p21 一样是 Cyclin-CDK 复合体的抑制剂，它们的过表达均可使细胞阻滞在 G1 期。p27 与 p21 具有同源性，可与 CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2、CyclinD-CDK4 复合物结合，并按化学计量方式抑制其对底物的磷酸化作用，从而使细胞不能发生 Gl-S 期的转换，停滞于 Gl 期。p57 与 G1 期 Cyclin-CDK 复合物结合，强烈抑制 CyclinD-CDK4，CyclinA-CDK2 等复合物的活性，使细胞停

26、滞于 Gl 期，它还与 p21 的功能有重叠，它们协调作用保证细胞走出细胞周期，实现细胞由分裂到分化的转变。p28 可能与 p27 同源，对多种 Cyclin-CDK 复合物有抑制作用。它在 Gl 期活性最大，在 Gl 早、中期可控制 CDK 活化时间。p16的分子量约为 16KD，其编码基因由 3 个外显子组成，并有、两个转录本。转录本编码 16KD 蛋白的完整 mRNA，而转录本的外显子 1 是一个不被转译的开放阅读框(ORF)，故在体外由俘转录本转译的蛋白质仅为 9-10KD。P16 的 N末 端 含 有 一 个 与 细 胞 周 期 蛋 白 盒 的 氨 基 端 同 源 的(MX-ADWL

27、ATAX-RVEEVXLL)(X为其它氨基酸)序列，此外还含有 4 个锚蛋白重复序列。p16 与 CyclinD 竞争性地结合 CDK4 或 CDK6，从而抑制 CDK4 或CDK6 的活性，抑制 Rb 蛋白的磷酸化，阻止细胞由 Gl 期进人 S 期。在由 DNA肿瘤病毒转化的纤维母细胞中，CDK4 与 CyclinD 及 p21 分离，而与 pl6 结合，pl6 特异性结合 CDK4 从而抑制 CyclinD-CDK4 的活性，阻止 Rb 的磷酸化，进而阻滞 Gl-S 期的转变。P15 基因与 pl6 基因的序列有相似性,它同样抑制CyclinD-CDK4 的活性，阻滞 Gl-S 期的转变。

28、p15、p18、plg 与 p16 一样均可通过抑制 CDK4 或 CDK6 活性而影响细胞周期的进程。p18 结构上与 p16 和 p15 有一定的同源性，能牢固地与 CDK6 结合，抑制细胞生长。p24 又叫 CKI1，其 mRNA及蛋白水平在 Gl 后期达峰值。p24 与 CDK2 结合，可能在 G1-S 期转换过程中起作用。p21、pl6 也与多种类型的细胞终末分化有关。MyoD 是生肌因子家族成员之一，具有典型的碱性螺旋-环-螺旋结构域，因而是一种转录激活因子。CyclinD可抑制 MyoD 的转录激活作用，并使 MyoD 磷酸化而阻滞细胞的分化。在肌细9河北大学 2007 届学年论

29、文胞分化的开始，MyoD 就可激活 P21 基因的转录。当将 p21 或 P16 转人处于增殖状态的成肌细胞时，可促进成肌细胞特异性基因(如肌球蛋白基因)的表达。2.3 其他与细胞周期运转密切相关的基因P53 基因与细胞周期运转关系密切。研究表明，p21 基因是 p53 基因产物的靶基因。p53 蛋白诱导产生的 p21 和 Gadd45 可与 PCNA 结合，使损伤的 DNA得到修复。p53 还通过与 RPA(复制蛋白 A)结合进而抑制 RPA与 DNA 复制起始点的结合，在 Gl 后期调节 DNA 复制起始复合物的组装，对细胞进人 S 期进行负调控。Rb 基因编码的 Rb 蛋白处于细胞生长和

30、调控的中心环节10，控制细胞进人生长分裂周期或脱离细胞周期而进人分化状态。Rb 蛋白有磷酸化和去磷酸化两种形式，去磷酸化形式是 Rb 的活性形式。去磷酸化的 Rb 与促进细胞分裂的某些转录因子(E2F，CAB-l 蛋白等)结合，转录因子的活性被抑制，细胞周期停滞在 G1 期。CyclinA、CyclinE、CyclinD2、CyclinD3/CDK 激酶复合体都可使 Rb 磷酸化，其中CyclinD1 直接与 Rb 结合，使Rb 磷酸化而失活，失活的Rb释放 E2F 等转录因子，促使细胞进入 S 期。ATM基因是从人类常染色体隐性遗传病 ATM(运动失调性毛细血管扩张症)患者体内发现的。当 D

31、NA 稍有损伤时，诱导表达产生 ATM 蛋白，进而诱导 p53 的表达，使细胞周期抑制或 DNA 得以及时修复。近年来研究报道了ATM蛋白参与 Gl/S、S、G2/M 的关卡调控，证明ATM 蛋白是 DNA 损伤检测器的成员之一，在细胞周期关卡调控中起着重要作用。10河北大学 2007 届学年论文三结论综上所述我们可以得到一个细胞周期运行的简化图景：Cyclin 负责正调控，与 CDK 的结合引起 CDK 的活化;而 CKI 进行负调控，与 CDK-Cyclin 复合物的结合将抑制其活性。如果把 CDK 视为细胞周期的“引擎”，那么 Cyclin 可以被认为是“油门”，CKI 则是“刹车”。这

32、三者组成了负责细胞周期运行的驱动装置。不过人们已经发现，驱动细胞周期运行的真实情况远远要复杂得多。因此，研究细胞周期运行的驱动装置精细结构以及各组成部分间相互作用的复杂性和多样性是目前细胞周期研究领域的重要内容。细胞周期的正常运转需要 CDK 的正性调控因子 Cyclin 与负性调控因子 CKI的精确协同与平衡。一旦这种平衡失稳就会造成细胞的失控性增殖而发生癌变，例如，编码CyclinD1 的基因就是甲状旁腺瘤基因 PRAD1。在多种肿瘤细胞中均发现有 CyclinD1 基因的扩增，这与 CyclinD1 基因的过表达可促进 Gl/S 转变是相一致的。编码 p21、p16、p53 和 Rb 的

33、基被认为是重要的抑癌基因，这些基因的缺失或突变均可导致细胞的恶性转化细胞周期的调控机制使人类能更加深刻地认识癌症的发病机理，真正找到癌症预防和治疗的切人点。11河北大学 2007 届学年论文参考文献1Murray AW.Creative Blocks:Cell-Cycle Checkpoints and Feedback controls.Nature,1992,359:599604.2Nasmythk.Dams and Sluices.Nature,1993,366:6346353R.J.Sheaff,J.M.Roberts.Regulation of G1 phase.cell cycle

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