《微生物学教学课件》第七章微生物遗传变异.ppt

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1、上节内容回顾上节内容回顾n影响常规加压灭菌的因素影响常规加压灭菌的因素n抗代谢药物的定义及磺胺的治疗传染性疾抗代谢药物的定义及磺胺的治疗传染性疾病的原理病的原理n抗生素的定义及分类抗生素的定义及分类n变异和饰变的定义变异和饰变的定义第七章第七章微生物的遗传、变异和微生物的遗传、变异和育种育种相关定义相关定义第一节第一节遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础第二节第二节基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种第三节第三节基基因因重重组组第四节第四节基因工程基因工程相关定义相关定义n遗传型：又称基因型，指某一生物个体所含有的全遗传型：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因的总和。部遗传因子

2、即基因的总和。n表型：指某一生物所具有的一切外表特征及内在特表型：指某一生物所具有的一切外表特征及内在特性的总和。遗传型在一定环境下的表现性的总和。遗传型在一定环境下的表现n变异：生物体在某种外因或内因的作用下所变异：生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。传型的改变。n饰变：指不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、饰变：指不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、转译水平上的表型变化。转译水平上的表型变化。第一节第一节遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础n一一经典试验经典试验n二二原核生物的质粒原核生物的质粒n一一经典试

3、验：证明核酸是遗传信息的载体经典试验：证明核酸是遗传信息的载体n1、转转化化实实验验：1928年年，Griffith等等分分别别用用肺肺炎炎R型型/S型型肺肺炎炎双双球球菌菌感感染染小小鼠鼠，得得出出S型型肺肺炎炎双双球球菌菌可可以以将将具具有有遗遗传传功功能能的的物物质质传传递给递给R型肺炎双球菌的结论。型肺炎双球菌的结论。（1）动物实验）动物实验对小鼠注射活对小鼠注射活R型菌或死型菌或死S型菌型菌小鼠小鼠存活存活对小鼠注射活对小鼠注射活S型菌型菌小鼠死亡小鼠死亡对小鼠注射活对小鼠注射活R型菌和热死型菌和热死S型菌型菌小小鼠死亡，抽取心血分离到活的鼠死亡，抽取心血分离到活的S型菌型菌（2）细

4、菌培养）细菌培养实验实验（3）S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验热死热死S型菌型菌不生长（无菌落）不生长（无菌落）活活R型型菌菌长出长出R型菌型菌活活R型型菌热死菌热死S型菌型菌长出大量长出大量R型型菌和菌和10-6S型菌型菌活活R菌菌+S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液长出大量长出大量R菌和少量菌和少量S菌菌平皿培养平皿培养以上实验说明：加热杀死的以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变型细胞获得稳定的遗传性状，转变为为S型细胞。型细胞。

5、n1944年年，在在以以上上基基础础上上等等又又将将S型型菌菌的的各各组组分分分分别别与与R型型菌菌共共同同培培养养，得得出出结结论论S型型菌菌传传递递给给R型型菌菌的的不不是是性性状状本本身身而而是是遗遗传物质基础。传物质基础。n加加S菌菌DNAn加加S菌菌DNA及及DNA酶以酶以外的酶外的酶n加加S菌的菌的DNA和和DNA酶酶n加加S菌的菌的RNAn加加S菌的蛋白质菌的蛋白质n加加S菌的荚膜多糖菌的荚膜多糖活活R菌菌长出长出S菌菌只有只有R菌菌只只有有S型型细细菌菌的的DNA才才能能将将S.pneumoniae的的R型型转转化化为为S型型。且且DNA纯纯度度越越高高，转转化化效效率率也也越

6、越高高。说明说明S型菌株转移给型菌株转移给R型菌株的是遗传因子型菌株的是遗传因子(DNA)。2噬菌体感染试验噬菌体感染试验：将噬菌体分别培养在具有将噬菌体分别培养在具有32P及及35S同位素的培同位素的培养基中，得到噬菌体粒子后再去感染细菌，养基中，得到噬菌体粒子后再去感染细菌，10分分钟后离心进行分析，发现侵入细菌细胞的是钟后离心进行分析，发现侵入细菌细胞的是DNA而不是蛋白，并且可以繁殖得到子代噬菌体粒子。而不是蛋白，并且可以繁殖得到子代噬菌体粒子。得出结论得出结论DNA是物质基础。是物质基础。nA.D.Hershey和和M.Chase，1952年年（1）含）含32P-DNA的一组：放射性

7、的一组：放射性85%在沉淀中在沉淀中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含15%放射性放射性沉淀中含沉淀中含85%放射性放射性沉淀中含沉淀中含25%放射性放射性n（2）含）含35S-蛋白质的一组：放射性蛋白质的一组：放射性75%在上清液中在上清液中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含75%放射性放射性3植

8、物病毒重建实验植物病毒重建实验：将将TMV（烟草花叶病毒）及烟草花叶病毒）及HRV（霍氏车前花霍氏车前花叶病毒）用酚溶液进行分离，后将两者的叶病毒）用酚溶液进行分离，后将两者的RNA及及蛋白交叉重建，重新感染烟草及车前，得出结论蛋白交叉重建，重新感染烟草及车前，得出结论RNA也是遗传物质基础。也是遗传物质基础。MTVHRVHRVMTV二二遗传物质在细胞内的存在部位和方式遗传物质在细胞内的存在部位和方式（一）七个水平：（一）七个水平：1、细细胞胞水水平平：几几乎乎全全部部DNA都都集集中中在在细细胞胞核核或或核质体（原核微生物）核质体（原核微生物）2、细胞核水平：、细胞核水平：原核微生物：原核微

9、生物：无核膜包被，并含有貭粒无核膜包被，并含有貭粒 真核微生物：真核微生物：真正的细胞核（有核膜）、线粒体、真正的细胞核（有核膜）、线粒体、叶绿体、中心体等亦含叶绿体、中心体等亦含DNA 染色体外的遗传物质：染色体外的遗传物质：1）细胞质遗传物质细胞质遗传物质线粒体或叶绿体线粒体或叶绿体2）共生生物）共生生物卡巴颗粒，草履虫的共生生物，卡巴颗粒，草履虫的共生生物，15mm大，具有双膜，内有大，具有双膜，内有DNA、RNA、酶、细、酶、细胞色素等。细胞内含有几个至几百个不等。胞色素等。细胞内含有几个至几百个不等。3）2质粒质粒酵母菌细胞核中染色体外的酵母菌细胞核中染色体外的DNA，长长2m m

10、4 4）质粒）质粒细菌细胞中游离于核染色体外或吸附细菌细胞中游离于核染色体外或吸附于其上的闭合双链于其上的闭合双链DNADNA。n3、染染色色体体水水平平：不不同同细细胞胞染染色色体体的的数数目目不不同同，染色体的套数亦不同。染色体的套数亦不同。n4、核核酸酸水水平平：绝绝大大多多数数遗遗传传物物质质为为DNA，只只有部分病毒的遗传物质为有部分病毒的遗传物质为RNAn基基因因组组（genome）是是指指存存在在于于细细胞胞或或病病毒毒中中的的所所有有基基因因，实实际际上上是是指指细细胞胞中中基基因因以以及及非非基基因的因的DNA序列组成的总称。序列组成的总称。几种代表微生物的基因组几种代表微生

11、物的基因组生物基因数基因组大小/bpMS2噬菌体33*103T4噬菌体505*104枯草芽孢杆菌37004.2*106大肠杆菌41004.7*1065、基因水平：、基因水平：基因的物质基础是一个具有特定基因的物质基础是一个具有特定功能的核酸片段功能的核酸片段6、密码子水平：、密码子水平：3 3个核苷酸决定一个密码子个核苷酸决定一个密码子7、核苷酸水平：、核苷酸水平：核苷酸是最低突变单位或交换核苷酸是最低突变单位或交换单位单位（二）（二）原核生物的质粒原核生物的质粒n质质粒粒上上携携带带着着某某些些染染色色体体上上所所没没有有的的基基因因，使使细细菌菌等等原原核核生生物物被被赋赋予予了了某某些些

12、对对其其生生存存并并非非必必不不可可少少的的特特殊殊功功能能（如如接接合合、产产毒毒、抗抗药药固固氮氮、产产特特殊酶或降解毒物等）殊酶或降解毒物等）1质粒的分类质粒的分类严紧型：与核染色体的复制进行同步复制。严紧型：与核染色体的复制进行同步复制。松松弛弛型型：独独立立进进行行复复制制，与与核核染染色色体体复复制制不不同步，拷贝数较多。同步，拷贝数较多。2 2 质质粒粒的的优优点点：体体积积小小，便便于于使使用用；呈呈环环状状，不不易易被被破破坏坏；能能够够独独立立复复制制；拷拷贝贝数数多多，可可以以大大量量积积累物质；有选择标记。累物质；有选择标记。3质粒的提取：裂解细胞质粒的提取：裂解细胞去

13、除细胞中的蛋白和去除细胞中的蛋白和RNA分离染色体分离染色体DNA得质粒得质粒利用电子显微镜，琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺利用电子显微镜，琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来鉴定质粒。凝胶电泳来鉴定质粒。4质粒不能共存于同一细胞中的性质称为不亲和性。质粒不能共存于同一细胞中的性质称为不亲和性。属于许多不亲和群属于许多不亲和群。DNA的三种存在形式的三种存在形式5常见质粒举例常见质粒举例1）F因因子子：62106Dal94.5kb(为为94个个中中等等大大小小的的多肽进行编码多肽进行编码)2）R因因子子：最最早早在在痢痢疾疾志志贺贺氏氏菌菌中中发发现现，抗抗性性转转移移因因子子（含含调调节节DNA

14、复复制制和和拷拷贝贝数数的的基基因因及及转转移基因）抗性决定子构成移基因）抗性决定子构成3）Col因因子子：产产大大肠肠杆杆菌菌素素的的因因子子，使使其其他他原原核核生物致死的蛋白质类生物致死的蛋白质类ColE1：5106Dal无接合作用无接合作用多拷贝多拷贝ColE2：80106Dal接接合合转转移移、严严紧紧型型控控制制，1-2个拷贝个拷贝4）毒性质粒：）毒性质粒：许多致病菌的致病性是由其所携带许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因5）降解性质粒：）降解性质粒：这类质粒上携带有能降解某些基这类质粒上携带有能降解某些基质

15、的酶的基因，含有这类基因的细菌，特别是假单质的酶的基因，含有这类基因的细菌，特别是假单胞菌，能将复杂的有机化合物降解成能被其利用的胞菌，能将复杂的有机化合物降解成能被其利用的碳源和能源利用的简单形式。如，芳香族化合物、碳源和能源利用的简单形式。如，芳香族化合物、农药等。农药等。6）隐秘质粒：）隐秘质粒：不显示任何表型效应，但具可检测不显示任何表型效应，但具可检测的遗传型。的遗传型。抗生素的定义及分类抗生素的定义及分类变异和饰变的定义变异和饰变的定义质粒的分类质粒的分类上节内容回顾上节内容回顾第二节第二节基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种n一一基因突变基因突变n二二突变与育种突变与育种n一一基

16、因突变基因突变n突突变变：变变异异的的一一种种，指指生生物物体体内内遗遗传传物物质质的的分分子子结结构构突突然然发发生生的的可可遗遗传传的的变变化化（10106 610109 9）（一）（一）突变类型突变类型 1、选选择择性性突突变变株株：凡凡能能选选择择性性培培养养、快快速速选选择择出来的突变型。出来的突变型。1 1）营营养养缺缺陷陷型型（auxotrophauxotroph）：丧丧失失合合成成一一种种或或几几种种生生长长因因子子的的能能力力而而无无法法在在基基本本培培养基上正常生长繁殖的变异类型。养基上正常生长繁殖的变异类型。2）抗性突变型（）抗性突变型（resistentmutant）：

17、对）：对某化学药物或致死物理因子抗性的变异类型某化学药物或致死物理因子抗性的变异类型n3）条件致死突变型（）条件致死突变型（conditionallethalmutant）：在某种条件下可正常生长、）：在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一种条件下却繁殖并实现其表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖的突变型（如：温度敏感无法生长、繁殖的突变型（如：温度敏感突变株）突变株）2、非选择性突变株：、非选择性突变株：n1)1)形形态态突突变变型型（morphological morphological mutantmutant）：由由于于突突变变而而产产生生的的个个体体或或菌菌落落形形态态

18、发发生生变变化化的非选择性变异。的非选择性变异。n2)2)抗抗原原突突变变型型（antigenic antigenic mutantmutant）：抗抗原结构发生变异的突变类型。原结构发生变异的突变类型。n 3)3)产量突变型：产量高于原始菌株的突变产量突变型：产量高于原始菌株的突变株称为正变株；否则为负变株。株称为正变株；否则为负变株。1突突变变率率：每每一一细细胞胞在在每每一一世世代代中中发发生生某某一一性性状状突突变变的的几几率率或或每每一一单单位位群群体体在在每每一一世代中产生突变株的数目来表示。世代中产生突变株的数目来表示。2测定方法：回复突变测定方法：回复突变 抗药性突变抗药性突变

19、（二）（二）突变率突变率n菌名菌名 突变性状突变性状突变率突变率nE.coliE.coli抗抗T T1 1噬菌体噬菌体3 103 1088nE.coliE.coli抗抗T T3 3噬菌体噬菌体1 101 1077 nE.coliE.coli不发酵乳糖不发酵乳糖1 101 101010nE.coliE.coli 抗紫外线抗紫外线1 101 1055nStaphylococcus aureusStaphylococcus aureus 抗青霉素抗青霉素1 101 1077nS.aureusS.aureus 抗链霉素抗链霉素1 101 1099 nSalmonella typhiSalmonella

20、 typhi抗抗2525 g/Lg/L链霉素链霉素1 101 1066 nBacillus megateriumBacillus megaterium 抗异烟肼抗异烟肼5 105 1055 若干细菌某一性状的自发突变率若干细菌某一性状的自发突变率n（三）（三）微生物突变的特点微生物突变的特点1不不对对应应性性：突突变变的的性性状状与与突突变变原原因因之之间间无无直直接的对应关系接的对应关系；2自自发发性性：突突变变可可以以在在没没有有人人为为诱诱变变因因素素处处理理下自发地产生下自发地产生；3稀有性：稀有性：突变率低且稳定突变率低且稳定；4独立性：独立性：各种突变独立发生，不会互相影响各种突变

21、独立发生，不会互相影响5诱变性：诱变性：诱变剂可提高突变率诱变剂可提高突变率；6稳定性：稳定性：变异性状稳定可遗传变异性状稳定可遗传；7可可逆逆性性：从从原原始始的的野野生生型型基基因因到到变变异异株株的的突突变变称称为为正正向向突突变变，从从突突变变株株回回到到野野生生型型的的过过程程则称为回复突变或回变则称为回复突变或回变（四）基因突变的自发性和不对应性的证明（四）基因突变的自发性和不对应性的证明1、变变量量实实验验（fluctuation fluctuation testtest）,又又称称波波动实验或彷徨试验动实验或彷徨试验1943年年取取两两试试管管装装有有10mL对对噬噬菌菌体体敏

22、敏感感的的大大肠杆菌菌液肠杆菌菌液1）培培养养后后，涂涂布布于于50个个含含有有噬噬菌菌体体的的平平板板上上，抗抗性菌落数目差异不大。性菌落数目差异不大。2）分分成成50个个小小管管培培养养后后涂涂布布于于平平板板上上，抗抗性性菌菌落落数目差异很大。数目差异很大。变量试验变量试验fluctuationtest变变量量试试验验说说明明：细细菌菌是是在在接接触触噬噬菌菌体体之之前前发发生生突突变变的的，即即抗抗噬噬菌菌体体性性状状的的产产生生，并并非非环环境境因因素素诱诱导导的的，而而是是自自发发产产生的。生的。n2、涂布试验、涂布试验1949年年，取取12个个培培养养皿皿在在固固体体培培养养基基

23、上上涂涂以以相相同同数数目目的的对对噬噬菌菌体体敏敏感感的的大大肠肠杆杆菌菌进进行行培培养养。其其中中，6个个平平皿皿培培养养5小小时时后后直直接接喷喷上上噬噬菌菌体体T1，出现，出现28个抗性菌落。个抗性菌落。另另外外6个个平平皿皿培培养养5小小时时后后，用用灭灭菌菌的的涂涂布布棒棒涂涂布后喷上噬菌体布后喷上噬菌体T1，却出现，却出现353个抗性菌落个抗性菌落涂布试验再次证明，抗噬菌体性状再次证明，抗噬菌体性状发生在与噬菌体接触之前发生在与噬菌体接触之前3、平板影印试验（、平板影印试验（replicaplating）影影印印培培养养法法：一一系系列列培培养养皿皿的的相相同同位位置置上上出出现

24、现遗遗传型相同菌落的接种培养方法传型相同菌落的接种培养方法1952年年，将将对对链链霉霉素素敏敏感感的的大大肠肠杆杆菌菌涂涂布布于于不不含含链链霉霉素素的的固固体体培培养养基基上上，形形成成小小菌菌落落后后，将将其其分分别别影影印印于于含含链链霉霉素素和和不不含含链链霉霉素素的的固固体体培培养养基基上上，培培养养后后在在加加有有链链霉霉素素的的固固体体培培养养基基上上有有菌菌落落形形成成；取取抗抗性性菌菌落落周周围围的的菌菌株株进进行行液液体体培培养养，涂涂布布于于不不含含链链霉霉素素的的固固体体培培养养基基上上，将将培培养养基基上上的的菌菌落落分分别别影影印印于于含含链链霉霉素素的的固固体体

25、培培养养基基及及不不含含链链霉霉素素的的固固体体培培养养基基上上，在在含含链链霉霉素素的的培培养养基基上上形形成成的的菌菌落落数数目有所增加。目有所增加。平板影印培养法平板影印培养法在在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。是起到了一种检出作用。平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。而

26、且在育种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。（五）基因突变的机制（五）基因突变的机制1 1、诱发突变、诱发突变 简简称称诱诱变变，指指通通过过人人为为的的方方法法，利利用用物物理理、化化学学或或生生物物因因素素显显著著提提高高基基因因突突变变频频率率的的手手段。段。凡能提高突变率的理化因子均称为诱变剂。凡能提高突变率的理化因子均称为诱变剂。nn1)诱变机制诱变机制碱基置换：一对碱基被另一对碱基所取代。碱基置换：一对碱基被另一对碱基所取代。转换（转换（transitiontransition）嘌呤）嘌呤嘌呤嘌呤;嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶 颠换（颠换（transversiontransversion

27、）嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶a直接引起置换的诱变剂：直接引起置换的诱变剂：亚亚硝硝酸酸、羟羟胺胺和和各各种种烷烷化化剂剂(包包括括硫硫酸酸二二乙乙脂脂、甲甲基基磺磺酸酸乙乙脂脂、N-甲甲基基-N-硝硝基基-N-亚亚硝硝基基胍胍（NTG）及环氧乙酸等）及环氧乙酸等）亚硝酸：亚硝酸：AHGCUTGX次黄嘌呤次黄嘌呤黄嘌呤黄嘌呤亚硝酸引起的亚硝酸引起的AT-GC转换细节转换细节亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。HNO2胞嘧啶（胞嘧啶（C）尿嘧啶（尿嘧啶（U）HNO2腺嘌呤（腺嘌呤（A）次黄嘌呤（次黄嘌呤（H）HNO2鸟嘌呤（鸟嘌呤（G）黄嘌呤（黄嘌呤（X）这些反应及形成物均可

28、在这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。主要是使碱基对发生转换。碱基转换的分子机制碱基转换的分子机制以亚硝酸为例以亚硝酸为例羟胺引起羟胺引起CGTA的机制的机制 b间接引起置换的诱变剂：间接引起置换的诱变剂：碱碱基基类类似似物物，如如5-BU、5-AU、8-NG、2-AP等等5-BU引起的转换引起的转换移码突变（移码突变（frameframeshift mutationshift mutation）诱诱变变剂剂引引起起DNADNA分分子子中中的的1 1个个或或少少数数几几个个核核苷苷酸酸的的增增添添（插插入入）或或缺缺失失从从而而使使该该部部位位后

29、后面面的的全全部部遗遗传传密密码码发发生生转转录录和和转转译译错误的一类突变。错误的一类突变。如如吖吖啶啶黄黄 原原黄黄素素、吖吖啶啶橙橙和和氨氨基基吖吖啶啶等等吖啶类染料。吖啶类染料。ABCABCABCABCABCABCABCAB+CABCABCABCBCABCABCABCABCAB+CAB+CAB+CABCABCACABCABABCACABCABC染染色色体体畸畸变变：由由于于电电离离辐辐射射、烷烷化化剂剂等等作作用用引引起起DNA大的损失。大的损失。分分为为：缺缺失失(deletion)重重复复（duplication）插插入入（insertion）易易位位（translation）倒倒

30、位位（inversion）及染色体数目的变化）及染色体数目的变化染色体畸变染色体畸变n转转座座：DNADNA序序列列通通过过非非同同源源重重组组的的方方式式，从从染染色色体体某某一一部部位位转转移移到到同同一一染染色色体体的的不不同同部位或是其他染色体某一部位的现象。部位或是其他染色体某一部位的现象。n倒倒位位：片片段段旋旋转转180度度，重重新新插插入入到到原原来来染色体的位置上（顺序相反）染色体的位置上（顺序相反）n易易位位：片片段段顺顺向向或或逆逆向向地地插插入入到到同同一一条条染染色体的其他部位上。色体的其他部位上。转转座座因因子子：染染色色体体组组中中或或染染色色体体间间能能改改变变

31、自自身身位位置置的的一一段段DNA顺顺序序，也也称称作作跳跳越越基基因或可移动基因。包括：因或可移动基因。包括：插插入入序序列列（IS：insertionsequence）分分子子量量小小（0.71.4kb）只只能能引引起起转转座座效效应应，而而不不含其他任何基因。含其他任何基因。n转转座座子子（Tn：transporson）又又称称易易位位子子，除除转转座座作作用用外外，还还含含有有抗抗药药性性基基因因或或乳乳糖糖发发酵酵基基因因等其他基因等其他基因nMu噬噬菌菌体体（即即mutastorphage）转转座座噬噬菌菌体体，温和噬菌体的一种，但其没有一定的整合位置温和噬菌体的一种，但其没有一定

32、的整合位置2 2 自发突变机制：自发突变机制：1 1）背背景景辐辐射射和和环环境境因因素素的的诱诱变变。低低剂剂量量诱诱变因素反复作用变因素反复作用2 2）微生物自身有害产物的诱变效应）微生物自身有害产物的诱变效应 如过氧化氢等内源性诱变剂如过氧化氢等内源性诱变剂3 3）互变异构效应（酮式、烯醇式的互变）互变异构效应（酮式、烯醇式的互变）4 4）转座作用导致部分）转座作用导致部分DNADNA环出环出A-TG(-OH)-TG-CA:G（六）（六）紫外线对紫外线对DNA的损伤及其修复的损伤及其修复n紫紫外外线线的的主主要要作作用用是是使使DNA链链上上的的相相邻邻嘧嘧啶啶间间形形成成共共价价结结合

33、合的的胸胸腺腺嘧嘧啶啶二二聚聚体体（双双链扭曲变形，不能正常配对）链扭曲变形，不能正常配对）修复机制：修复机制：a.a.光复活作用（光复活作用（reactixlationreactixlation）定定义义:紫紫外外线线照照射射后后的的微微生生物物立立即即暴暴露露于于可见光下，可明显降低死亡率的现象。可见光下，可明显降低死亡率的现象。机机制制:光光复复活活酶酶（photo photo reactivating reactivating enzymeenzyme PREPRE）（光光裂裂合合酶酶）与与二二聚聚体体结结合合，在在可可见见光下获得能量，使二聚体解聚。光下获得能量，使二聚体解聚。b.b

34、.切除作用（切除作用（excision repairexcision repair）（又称暗修复）（又称暗修复）不不但但可可以以修修复复紫紫外外线线损损伤伤的的DNA，还还可可以以修修复复一一些些诱诱变变剂剂（如如烷烷化化剂剂、x射射线线、射射线线）损伤的损伤的DNA切除修复作用切除修复作用1、由、由核酸内切酶核酸内切酶切开二聚体切开二聚体的的5末端，形成末端，形成3-OH和和5-P的单链缺口的单链缺口2、核酸外切酶核酸外切酶从从5-P到到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。方向切除二聚体，并扩大缺口。3、DNA聚合酶聚合酶以另一条互补以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的链为模板，从原有链上

35、暴露的3-OH端起合成缺失片段。端起合成缺失片段。4、连接酶连接酶将新合成的将新合成的3-OH与原有的与原有的5-P相连接。相连接。上节内容回顾上节内容回顾基因突变的定义基因突变的定义突变率的定义突变率的定义突变类型突变类型诱变及诱变剂的定义诱变及诱变剂的定义点突变的诱变机制（直接诱变剂、间接诱变剂及移点突变的诱变机制（直接诱变剂、间接诱变剂及移码突变诱变剂）码突变诱变剂）自发突变的机制自发突变的机制二二突变与育种突变与育种（一）自发突变与育种（一）自发突变与育种1、从生产中选育：筛选正变菌株、从生产中选育：筛选正变菌株2、定定向向培培育育优优良良品品种种：用用某某一一特特定定因因素素处处理理

36、微微生生物物的的群群体体，同同时时不不断断对对它它们们进进行行移移种种传传代代，以以达达到到累累积积并并选选择择相相应应自自发发突突变株的目的。变株的目的。n（二）诱变育种（二）诱变育种诱诱变变育育种种：利利用用物物理理或或化化学学诱诱变变剂剂处处理理均均匀匀而而分分散散的的微微生生物物细细胞胞群群，在在促促进进其其突突变变率率显显著著提提高高的的基基础础上上，采采用用简简便便、快快速速和和高高效效的的筛筛选选方方法法，从从中中挑挑选选少少数数符符合合育育种种目目的的的的突突变变株株。其其中中，诱诱变变和和筛筛选选为主要环节。为主要环节。诱变育种的基本过程：诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌

37、株选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液制备待处理的菌悬液诱变处理诱变处理筛选筛选保藏和扩大试验保藏和扩大试验n1诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节n高产突变株的选育高产突变株的选育n 2诱变育种的原则诱变育种的原则1）选选择择简简便便有有效效的的诱诱变变剂剂：如如紫紫外外线线、NTG（N甲甲基基N硝硝基基N亚亚硝硝基基胍胍）、EMS（甲甲基磺酸乙脂）、基磺酸乙脂）、DES(硫酸二乙脂）等。硫酸二乙脂）等。凡凡能能改改变变核核酸酸结结构构的的因因素素都都可可影影响响核核酸酸的的生物学功能。生物学功能。“三致三致”物：指的是致突变、致畸变及致癌物：指的是致突变、致畸变及致癌变的物质。变的物质。如

38、黄曲霉素、反应停及二噁英等。如黄曲霉素、反应停及二噁英等。艾姆氏试验艾姆氏试验定义：利用细菌营养缺陷型的回复突变菌定义：利用细菌营养缺陷型的回复突变菌株检测环境或是食品中是否存在致癌剂的株检测环境或是食品中是否存在致癌剂的方法。用于检验食品、饮料、药物及环境方法。用于检验食品、饮料、药物及环境中的致癌物。中的致癌物。试样加入鼠肝匀浆液保温后吸入滤纸置于试样加入鼠肝匀浆液保温后吸入滤纸置于基本培养基上培养，检验致癌物的存在与基本培养基上培养，检验致癌物的存在与否。（要求细菌细胞应是否。（要求细菌细胞应是DNA修复酶缺陷修复酶缺陷的营养缺陷型）的营养缺陷型）Ames testAmes test：对

39、化学诱变剂做检测：对化学诱变剂做检测菌种：鼠菌种：鼠伤寒沙寒沙门氏菌氏菌（his-）；）；原理：原理：his-在基本培养基在基本培养基上不上不长；而；而发生回生回复突复突变则长。Ames test Ames test 方法示意方法示意图2）挑选优良的出发菌株：）挑选优良的出发菌株：a.自发变异菌株；自发变异菌株；b.具有利性状的菌株；具有利性状的菌株；c.已发生变异的菌株；已发生变异的菌株；d.对诱变剂比较敏感的增变菌株；对诱变剂比较敏感的增变菌株；3）处理单细胞或单孢子悬液）处理单细胞或单孢子悬液为为使使细细胞胞均均匀匀接接触触诱诱变变剂剂，要要求求作作诱诱变变的的菌菌株株必必须须以以均均匀

40、匀而而分分散散的的单单细细胞胞（孢孢子子）悬液状态存在。悬液状态存在。表表型型延延迟迟：由由于于有有些些细细胞胞为为多多核核，且且大大部部分分细细胞胞的的DNA为为双双链链，所所以以只只有有经经过过DNA的的复复制制和和细细胞胞分分裂裂后后，这这一一变变异异才才会会在在表表型表达出来。型表达出来。n4）选选用用最最适适剂剂量量：化化学学诱诱变变剂剂剂剂量量以以在在一一定定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。5）充分利用复合处理的协同效应：）充分利用复合处理的协同效应：a.两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的先后使用；b.用一种诱变剂的重复作用；用一

41、种诱变剂的重复作用；c.两种或多种诱变剂的同时使用；两种或多种诱变剂的同时使用；6）利用和创造形态、生理和产量间的相关指标利用和创造形态、生理和产量间的相关指标建立形态与生理、产量的相关性，注意观察建立形态与生理、产量的相关性，注意观察创创造造相相关关性性：碘碘淀淀粉粉水水解解；茚茚三三酮酮氨氨基基酸酸；溴溴甲酚绿甲酚绿柠檬酸柠檬酸7）设计高效筛选方案）设计高效筛选方案初初筛筛（选选取取较较多多有有生生产产潜潜力力的的菌菌株株）、复复筛筛（对对少少量量潜潜力力大大的的菌菌株株的的代代谢谢产产物物量量做做精确测定）精确测定）第一轮：第一轮：一个出发菌株一个出发菌株选出选出200个菌株个菌株选出选

42、出50株株选出选出5株株诱变处理初筛（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：第二轮：5个出发菌株个出发菌株选出选出50株株选出选出5株株40株株40株株40株株40株株40株株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）8）创造新型筛选方法创造新型筛选方法初初筛筛既既可可在在琼琼脂脂平平板板上上完完成成，也也可可利利用用摇摇瓶完成；瓶完成；复筛一般采用摇瓶或是小型发酵罐完成复筛一般采用摇瓶或是小型发酵罐完成 3 3 三类突变株的筛选方法三类突变株的筛选方法 (1)(1)营养缺陷菌株的筛选营养缺陷菌株的筛选 遗传型个体：遗传型个体：a.a.野野生生型型（wild wild typetype）：未未发发生

43、生营营养养缺缺陷陷突突变前的菌株。变前的菌株。b.b.营营养养缺缺陷陷型型（auxotrophauxotroph）丧丧失失某某种种酶酶合合成成能能力力的的突突变变株株，因因而而只只能能在在加加有有该该酶酶合合成成产产物的培养基中才能生长物的培养基中才能生长.如如E.coli（lys-）c.c.原原养养型型（prototrophprototroph）缺缺陷陷型型经经回回复复突突变变或重组后产生的菌株或重组后产生的菌株 培养基类型：培养基类型：a.a.基基本本培培养养基基（MMMM）：仅仅能能满满足足某某微微生生物物的的野野生生型型菌菌株株生生长长需需要要的的最最低低成成分分组组合合的的培培养养基

44、。基。b.b.完完全全培培养养基基（CMCM）：凡凡可可以以满满足足一一切切营营养养缺缺陷陷型型菌菌株株营营养养需需要要的的天天然然或或半半组组合合培培养养基基（添加蛋白胨、酵母膏等）（添加蛋白胨、酵母膏等）c.c.补充培养基（补充培养基（SMSM）：凡只能满足相应的营）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基（养缺陷型生长需要的组合培养基（MMMM不能不能合成的代谢物）合成的代谢物）营养缺陷型的筛选过程：营养缺陷型的筛选过程：a.a.诱变处理；诱变处理；b.b.淘汰野生型：抗生素法或菌丝过滤法；淘汰野生型：抗生素法或菌丝过滤法；c.检出缺陷型：检出缺陷型：夹夹层层培培养养法法：MM+

45、含含菌菌的的MM+MM，长长出出小小菌菌落作上标记后落作上标记后+CM，之后长出的是营养缺陷型。，之后长出的是营养缺陷型。限限量量培培养养法法：诱诱变变后后的的细细胞胞放放在在含含微微量量某某种种物质的培养基上培养，挑出小的菌落。物质的培养基上培养，挑出小的菌落。影影印印接接种种法法：先先接接种种到到CM上上，接接着着转转到到MM上，寻找上，寻找MM上不生长的。上不生长的。逐逐个个检检出出法法：分分别别接接种种到到MM、CM上上，在在MM上上不长而在不长而在CM上生长的为缺陷型上生长的为缺陷型 d.d.鉴定缺陷型：鉴定缺陷型：生生长长谱谱法法：培培养养基基和和菌菌液液混混合合铺铺平平板板，分分

46、区区域域添添加加微微量量的的氨氨基基酸酸、维维生生素素、嘌嘌呤呤等等生生长长因因子子，观观察察哪哪个个区区域域长长出出菌菌落落，其其对对应应的的生生长长因因子子则则为为缺缺陷的。陷的。营营养养缺缺陷陷型型突突变变株株的的应应用用：标标记记菌菌株株、解解除反馈抑制作为高产菌株除反馈抑制作为高产菌株纸片纸片1:氨基酸混合液氨基酸混合液;纸片纸片2:维生素混合液维生素混合液;纸片纸片3:核酸水解液核酸水解液;纸片纸片4:酵母水解液酵母水解液 氨基酸缺陷型氨基酸缺陷型氨基酸和维生素氨基酸和维生素缺陷型缺陷型核苷酸缺陷型核苷酸缺陷型(2)抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选对抗代谢药物的抗性突变菌株（对

47、抗代谢药物的抗性突变菌株（通过高产代谢产物来实通过高产代谢产物来实现抵抗作用现抵抗作用）可以利用梯度平板法定向筛选。）可以利用梯度平板法定向筛选。定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产突变株定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产突变株先在培养皿中加入先在培养皿中加入10mL融化的普通琼脂培养基，融化的普通琼脂培养基，皿底倾斜，凝固后放平，倒上含有适度浓度异烟皿底倾斜，凝固后放平，倒上含有适度浓度异烟肼的琼脂培养基，凝固后涂布上大量的诱变菌株，肼的琼脂培养基，凝固后涂布上大量的诱变菌株，培养后，发现随着异烟肼的浓度增加，抗性菌落培养后，发现随着异烟肼的浓度增加，抗性菌落减少。减少。说明抗性菌株是通过产生大量的吡哆醇

48、来说明抗性菌株是通过产生大量的吡哆醇来解除异烟肼的抑制解除异烟肼的抑制梯度平板法梯度平板法方法：梯度平板法（方法：梯度平板法（gradientplate）抗药性突变株的应用：抗药性突变株的应用：u作为菌株的遗传标记作为菌株的遗传标记u作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）(3)产量突变株的筛选产量突变株的筛选琼脂块培养法：将诱变后菌株的单细胞悬液涂布于琼脂块培养法：将诱变后菌株的单细胞悬液涂布于固体培养基上，待长出小菌落后用打孔器将小菌落固体培养基上，待长出小菌落后用打孔器将小菌落琼脂块移至空白培养皿中继续培养琼脂块移至空白培养皿中继续培养45天，消耗天，消耗

49、完所有营养，移至混有供试菌的固体培养基上培养，完所有营养，移至混有供试菌的固体培养基上培养，测定抑菌圈的大小，筛选抗生素高产菌株。测定抑菌圈的大小，筛选抗生素高产菌株。上节回顾上节回顾定向培育的定义定向培育的定义诱变育种及原则诱变育种及原则艾姆氏试验艾姆氏试验野生型、营养缺陷型、原养型？野生型、营养缺陷型、原养型？MMCMSM？营养缺陷型的筛选过程营养缺陷型的筛选过程抗药性突变株的筛选方法抗药性突变株的筛选方法高产突变株的筛选方法高产突变株的筛选方法第三节第三节基基因因重重组组 基基因因重重组组（generecombination）：两两个个不不同同性性状状个个体体内内的的遗遗传传基基因因转转

50、移移到到一一起起，经经过过遗遗传传分子间的重新组合，形成新型个体的方式。分子间的重新组合，形成新型个体的方式。一一原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组（一一）转转化化：受受体体菌菌接接受受供供体体菌菌的的DNADNA片片段段而获得部分新的遗传性状的现象。而获得部分新的遗传性状的现象。脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)酶可以抑制转化作用。酶可以抑制转化作用。感感受受态态：在在一一个个生生长长过过程程中中的的细细菌菌培培养养物物中中只只有有某某一一阶阶段段中中的的细细菌菌才才能能作作为为可可转转化化的的受受体体。能能接接受受转转化化的的这这一一生生理理状状态态称称为为感受态。感受态。