《酶和细胞的固定化》PPT课件.ppt

《《酶和细胞的固定化》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《酶和细胞的固定化》PPT课件.ppt（93页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第三章第三章 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化Chapter 3 immobilized enzyme and celll酶酶的的催催化化具具有有高高选选择择性性、高高催催化化活活性性、反反应应条条件件温温和和、环环保保无无污污染染等等特特点点。但但游游离离状状态态的的酶酶对对热热、强强酸酸、强强碱碱、高高离离子子强强度度、有有机机溶溶剂剂等等稳稳定定性性较较差差，易易失失活活，并并且且反反应应后后混混入入底底物物等等物质，物质，纯化困难纯化困难，不能重复使用不能重复使用。历史简介历史简介l1916年年Nelson和和Griffin首首先先发发现现了了酶酶的的固固定定化化现现象象，从从此此科科

2、学学家家就就开开始始了了固固定定化化酶酶的的研研究究工工作作。1969年年日日本本一一家家制制药药公公司司第第一一次次将将固固定定化化的的酰酰化化氨氨基基酸酸水水解解酶酶用用来来从从混混合合氨氨基基酸酸中中生生产产L-氨氨基基酸酸，开开辟辟了了固固定定化化酶酶工工业业化化应应用用的的新新纪元。纪元。l已经显示固定化酶将在现代酶工程以及整个生物工程中占有重要作用，它在应用上和理论上的巨大潜力引起了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子等领域的各类研究人员的广泛关注。主要讲授内容主要讲授内容l一、固定化酶固定化酶(细胞细胞)的制备的制备l二、固定化酶(细胞)的性质和指标l三、固定化酶和固定化细

3、胞的反应器l四、酶工程在医药工业中的应用 一、固定化酶一、固定化酶(细胞细胞)的制备的制备l1.传统的酶固定化方法 l2.新型的酶固定化方法新型的酶固定化方法 l3.固定化细胞的方法固定化细胞的方法 l4.固定化酶常用的载体材料1.传统的固定化酶的方法传统的固定化酶的方法l传统的固定化酶的方法为载体结合法，大致可分为：吸附法 交联法 包埋法 其他方法 载体结合法 l载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。根据结合形式的不同，可分为物物理理吸吸附附法法、离离子子结结合合法法和共共价价结结合合法法三种形式。l物物理理吸吸附附法法：是利用酶和载体间的非特异性物理吸附作用将酶固定在载体表面

4、，这些物理吸附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电作用等。物理吸附法的优缺点物理吸附法的优缺点l优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小。l缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度、离子强度等条件的变化都易使酶酶从从载载体体脱脱落落，并且污染催化反应产物。离子结合法l离离子子结结合合法法是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如DEAE-纤维素、AmberliteCG-50、XE-97和Dowex-50等。DE

5、AE二乙胺基乙基离子结合法的优缺点离子结合法的优缺点l离子结合法优点操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。l缺点是载载体体和和酶酶的的结结合合力力较较弱弱，容容易易受受缓缓冲冲液液种种类类或或pH的的影影响响，在离子强度较高的条件下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。共价结合法共价结合法l共共价价结结合合法法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先用化学方法将载载体体活活化化，再与酶分子表面的某些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价键。共价结合法的优缺

6、点共价结合法的优缺点l共共价价结结合合法法所得的固定化酶与载体结合比较牢固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更加严重。交联法 l交交联联法法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定化酶。l交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法的辅助手段。常用的双功能试剂有戊戊二二醛醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用最广泛的是

7、戊二醛戊二醛。包埋法 l包包埋埋法法是载体与酶溶液混合后，借助引引发发剂剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。该法条件温和，基本上不涉及酶的构象及酶分子的化学变化，因而酶活力回收率较高。包埋法的缺点缺点l但包埋法固定化酶易泄漏，常存在机械强度差、扩散受限制、传质阻力较大等问题，不宜催化大分子底物的反应。常用的载体主要有明胶、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。l包埋法可分为两种：网格型 微囊型l将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网网格格型型，常用的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物，以及淀粉

8、、明胶、海藻胶和角叉菜胶等天然高分子化合物。l将酶和细胞包埋在高分子半透膜中的称为微微囊囊型型，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。l传统的酶固定化方法的缺点：酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴露，而且酶的固定化量降低，因此定定向向固固定定化化酶酶技术将成为今后固定化酶研究的热点。2.新型的酶固定化方法新型的酶固定化方法l新型的酶的固定化方法，要在较为温和的条件下进行，尽量减少或避免酶活力的损失，并提高固定化效率。通过辐射、光、等离子体、电子、“柔性链”等新方法均可制备高活性固定化酶。l如光光偶偶联联法法是以光敏性单体聚合物包埋固定

9、化酶或带带光光敏敏性性基基团团的的载载体体共价固定化酶，由于条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。l等等离离子子体体是高度激发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体，大量的等离子体常在室温下存在。载体材料表面可以用等离子体进行修饰，从而引入活性基团。l偶偶合合（耦耦合合）固固定定化化也是新近发展起来的一种酶固定化方法，基本上能够解决单一固定化方法酶活回收率低、稳定性差、传质阻力大等问题，并具有方法多样、操作简便、技术成熟等特点。l从从较较早早的的吸吸附附交交联联法法、包包埋埋交交联联法法开开始始，偶偶合合固固定定化化技技术术已已经经得得到到越越来来越越多多的的应应用用，先先后后提提出出并并研研究

10、究了了包包埋埋吸吸附附法法、絮絮凝凝吸吸附附法法、吸附吸附交联法交联法、膜膜吸附法吸附法等方法等方法。l无无载载体体固固定定化化酶酶直接利用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶和喷雾干燥酶而形成交联溶解酶、交联酶晶体、交联酶聚集体和交联喷雾干燥酶等4种无载体酶系统。l与传统固定化酶相比，无无载载体体酶酶具具有有以以下下一一些些优优点点：催化活性高，成本低；具备较高的催化剂比表面；可加入多种酶；底物扩散受限较少；在极端条件、有机溶剂和蛋白酶中的稳定性较高。l此外，研究人员还开发了一些定向固定化的方法，如利利用用酶酶和和抗抗体体之之间间的的亲亲和和性性、酶酶和和金金属属离离子子形形成成复复合合物物

11、、通过酶分子上的糖糖基基部部分分固固定化、用分子生物学方法使酶定向固定化等定化、用分子生物学方法使酶定向固定化等。3.固定化细胞的方法固定化细胞的方法l细细胞胞的的固固定定化化主要是活细胞的固定化，是一种不用载体的工艺。通过化学的或物理的手段，使整个细胞彼此附着相连。化学交联化学交联l化化学学交交联联是指细胞体借助双功能或多功能试剂，如醛或胺的共价附着相连。固定含L-天天门门冬冬氨氨酸酸解解氨氨酶酶(天门冬氨酸酶)活性的大肠杆菌细胞，它们是通过应用双功能试剂(戊二醛，以及甲苯二异氰酸酯)来强化细胞壁或细胞膜的交联。物理交联物理交联l用絮絮凝凝法法进进行行细细胞胞的的物物理理交交联联，在固定化细

12、胞的应用中有很大潜力。使用种类不同的絮凝剂，可促进细胞凝聚。这些絮凝剂，包括阳离子聚合电解质和阴离子聚合电解质以及金属化合物。絮凝剂絮凝剂l阳阳离离子子聚聚合合电电解解质质，如聚胺、聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺；阴阴离离子子聚聚合合电电解解质质，如羧基取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯磺酸盐、聚羧酸；以及金金属属化化合合物物，如Mg（II）、Ca（II）、Fe（III）、Mn（II）的氧化物、氢氧化物、硫酸盐、磷酸盐。l除了化学交联法外，还有载体粘合法、凝胶体截留法和金属螫合法等多种。l载载体体粘粘合合法法，是将融合整细胞粘合到支撑体表面，根据整细胞粘合的方式，又可分为吸附、螯合和共价结合三种。用此法

13、固定细胞时，应注意选择载体及粘合方法。载载体体有有有机载体和无机载体两种。粘合方法最常用的是吸附法，它简单、温和、细胞存活率高。l截截留留法法是在一种压紧的结构内将细胞滞留。这种结构牢固得足以阻止细胞漏出，同时能让基质渗入和产物扩散。这种方法与交联法和粘合法的区别，在于生生物物催催化化剂剂本本身身不不和和凝凝胶胶本本体体或或膜膜联联结结。这种方法已广泛应用于截留各种生物大分子、整细胞以及大小不同、性质相异的细胞器。4.常用的固定化酶载体材料常用的固定化酶载体材料l固定化酶载体材料的性能要求 l固定化酶载体材料 固定化酶载体材料的性能要求固定化酶载体材料的性能要求l载体材料对固定化酶的性质影响非

14、常大。尽管到目前为止，人们没有找到一种合适的材料可以担当起所有的固定化载体，但是材料的下述性能可作为选择合适的酶载体材料时的考察要点。l(1)功功能能基基团团：一般来说，载体材料带有能与酶发生反应的官能团，如带有-OH、-COOH、-CHO等反应性基团，则可大大提高载体材料与酶之间的结合力，同时亦可提高固定化酶的操作性和稳定性。l l(2)渗渗透透性性和和比比表表面面积积：好的载体材料应具有大的比表面积和多孔结构，因为具有这样结构的载体材料易和酶相交联，并可提高固定化率。l(3)溶溶解解性性：一般来说，载体材料要求是不溶于水的。这不仅可以防止酶失活，还可以防止酶受到污染。l l(4)机机械械刚

15、刚性性及及稳稳定定性性：这些对载体材料非常重要，由于固定化酶的一个最大的特点是要能重复使用，这就要求载体材料的机械刚性和稳定性都非常好。l(5)组组成成和和粒粒径径：一般来说，材料的孔径越小，其比表面积就越大，与自由酶固定化程度就越高，固定化率也就越高。l(6)对对微微生生物物的的抵抵抗抗性性：在长时间的使用中，载体材料必须要能防止微生物的降解作用，对微生物抵抗性好的载体材料可以长时间的使用。l(7)经经济济性性和和环环保保：来源经济、丰富，无毒、可降解。固定化酶载体材料固定化酶载体材料 l从载体材料的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为高分子载体、无机载体、复合载体以及新型载体等。高分子载

16、体高分子载体l高分子载体又可以分为天然高分子载体和合成高分子载体材料。天然高分子载体材料天然高分子载体材料l天然高分子载体材料如结构性蛋白(角质、胶原蛋白)、球状蛋白以及碳水化合物由于原料易得，都比较适合担当酶的载体材料。此类材料最大的特点是无毒性，传质性能好。l研究得较多的载体是壳壳聚聚糖糖和海海藻藻酸酸钠钠。由于天然高分子材料存在强度较低，在厌氧条件下易被微生物所分解，使用寿命较短，而且天然高分子材料原料来源往往受产地所限，这在一定程度上限制了其应用。合成有机高分子材料合成有机高分子材料l合成有机高分子材料由于其化学、物理性能都有很大的可变性，从理论上来说，可以担当任何一种酶的固定化载体，

17、而且它们对微生物的腐蚀也有较强的抵抗力。另外，与天然高分子材料相比，合成有机高分子凝胶载体还有强度较大的优点。无机载体无机载体l无机载体具有一些有机材料不具备的优点，如稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生物所分解、耐酸碱、成本低、寿命长等。常见的无机载体材料有玻璃、硅凝胶、铝、蒙脱土等。复合载体复合载体 l复合载体是以有机材料和无机材料复合组成的新载体材料。如磁磁性性高高分分子子微微球球，其内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末，从而具有磁响应性。l磁磁性性高高分分子子微微球球可以通过共聚、表面改性等化学反应在微球表面引入多种反应性功能基团，也可以通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生

18、物活性物质，在外加磁场的作用下，进行快速运动或分离。l与其他载体材料相比，磁性高分子微球作为固定化载体具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较低等诸多优点，因此引起了国内外学者的广泛关注。新型载体新型载体 l设计新型载体并结合当代高新技术，是固定化酶研究的一个新方向。如导导电电聚聚合合物物作为酶固定化载体时可用于酶电极类生物传感器的制备。当光光敏敏性性单单体体聚聚合合物物包埋固定化酶或带带光光敏敏性性基基团团的的载载体体共价固定化酶时，反应条件温和，固定化酶的酶活力较高。主要讲授内容主要讲授内容l一、固定化酶(细胞)的制备l二、固定化酶固定化酶(细胞细胞)的性质和指标的性质和指标l三、固

19、定化酶和固定化细胞的反应器l四、酶工程在医药工业中的应用 二、固定化酶二、固定化酶(细胞细胞)的性质和指标的性质和指标l1.固定化后酶活力的改变 l2.固定化对酶稳定性的影响 l3.固定化酶的最适温度变化 l4.固定化酶的最适pH变化 l5.固定化酶的米氏常数(Km)变化 l6.固定化酶(细胞)的指标 l游离的酶经固定化后，酶本身的结构会受到影响。由于它的催化作用由均均相相转转到到非非均均相相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体的分配效应等因素必然影响到酶的性质。1.固定化后酶活力的改变固定化后酶活力的改变l在多数情况下，酶固定化后的活力比天然酶小，其专一性也会发生改变。例如，用羧甲基纤维

20、素做载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪酪蛋蛋白白只显示原酶活力的30，而对低分子底物苯苯酞精氨酸酞精氨酸对硝基酰替苯胺对硝基酰替苯胺的活力保持80。l所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。l在相同测定条件下，固定化酶的活力低于等摩尔原酶的活力，其原因可能是：l 酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；l 固定化后，酶分子空间自由度受到限制(空间位阻)，会直接影响到活性中心对底物的定位作用；l 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；l 包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。l不过也有例外，酶在固定化后反而比原酶活力提高

21、，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的稳定性。2.固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响l稳定性关系到固定化酶能否实际应用。在大多数情况下，酶经过固定化后其稳定性都有所增加，这是十分有利的。l具体表现在以下三个方面：（1）热稳定性提高）热稳定性提高 l作为生物催化剂，酶也和普通化学催化剂一样，温度越高，反应速度越快。但是大多数酶是蛋白质组成的，一般对热不稳定。因此，不能在高温条件下进行反应，而固定化酶耐热性提高，使酶最适温度提高，酶催化反应能在较高温度下进行，加快反应速度，提高酶作用效率。（2）对有机试剂及酶抑制剂的稳定性）对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高提高l酶经

22、过固定化后，提高了对各种有机溶剂的稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。可以预计，今后固定化酶在有机合成中的应用会进一步发展。（3）对）对pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高定性提高 l固定化酶稳定性提高的原因可能有：固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形；酶活力的缓慢释放；抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。3.固定化酶的最适温度变化固定化酶的最适温度变化l酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合体现。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。4

23、.固定化酶的最适固定化酶的最适pH变化变化l酶的催化能力对外部环境特别是pH非常敏感。l酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移。曲线偏移的原因是微环境表面电荷性质的影响。l一般说来，用带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏高。原因的解释原因的解释l这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子，包括H+，使其附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层H+浓度比周围的外部溶液高，即偏酸，这样外部溶液中的pH必须向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使其表现出酶的最大活力。l反之，带正电荷载体(阳离子聚合物)制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏低。使用带正电荷的载体

24、其最适pH向酸性偏移。5.固定化酶的米氏常数固定化酶的米氏常数(Km)变化变化l固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能有一定的变化。l当酶结合于电电中中性性载体时，由由于于扩扩散散限限制制造造成成表观表观Km上升；上升；l但但是带电载体和底物之间的静电作用会引起底物分子在扩散层和整个溶液之间不均一分布。l由于静电作用，与载体电电荷荷性性质质相相反反的的底底物物在固定化酶微环境中的浓度比整体溶液中的高，与与溶溶液液酶酶相相比比，固固定定化化酶酶的的表表观观Km值值低低于于溶溶液的液的Km值值；l而载载体体与与底底物物电电荷荷相相同同，则会造成固定化酶的表观Km值显著增加。l由于高级结构变化及

25、载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。l这种Km变化又受溶液中离了强度影响。离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。6.固定化酶固定化酶(细胞细胞)的指标的指标l游离酶制备成为固定化酶后，其催化功能也由原来的均均相相体体系系反应变为固液相不不均均一一反反应应，酶的催化性质会发生改变。因此制备固定化酶(细胞)后，必须考察它的性质。常用的评估指标包括固定化酶(细胞)的活力、固定化酶(细胞)的偶联率以及相对活力、固定化酶(细胞)的半衰期以及热稳定性。固定化酶固定化酶(细胞细胞)的活力的活力 l是指固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件

26、下它所催化的某一反应的反反应应初初速速度度来表示。固固定定化化酶酶(细细胞胞)的的单单位位可定义为每每毫毫克克干干重重固固定定化化酶酶(细细胞胞)每每分分钟钟转转化化底底物物(或或生生产产产产物物)的的量量，表示为mol/(minmg)。l与游离酶相仿，表示固定化酶的活力一般要注明下列条件：l温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件；温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件；l固定化的原酶含量或蛋白质含量固定化的原酶含量或蛋白质含量l用于固定化酶的原酶的比活力。用于固定化酶的原酶的比活力。l固固定定化化酶酶的的活活力力回回收收是指固定化后的固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力

27、的百分数。l固定化酶的活力回收计算公式如下：固定化酶的活力回收计算公式如下：活力回收活力回收=固定化酶总活力(加入酶的总活力上清液中未偶联酶活力)100l固定化酶通常呈颗粒状，所以一般测定溶液酶活力的方法要作改进才能适用于测定固定化酶，其活力可存两种基本系统-填充床或均匀悬浮在保温介质中进行测定。偶联率及相对活力的测定偶联率及相对活力的测定 l影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活，可用偶联率或相对活力来表示。测定方法可以分为间歇测定和连续测定两种。l固定化酶的固定化酶的偶联率计算公式如下计算公式如下：偶联率=(加入酶的活力上清液酶的活力)加入酶的活力100l偶联率=1时，表示

28、反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；l偶联率1时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。固定化酶固定化酶(细胞细胞)的半衰期的半衰期 l固定化酶(细胞)的半衰期是指在连续测定条件下，固固定定化化酶酶(细细胞胞)的的活活力力下下降降为为最最初初活活力力一一半半所所经经历历的的连连续续工工作作时时间间，以t1/2表示。固定化酶(细胞)的操作稳定性是影响实用的关键因素，半衰期是衡量稳定性的指标。l半衰期的测定可以和化工催化剂一样实测，即进行长期实际操作，也可以通过较短时间操作进行推算。在没有扩散限制时，固定化酶(细胞)活力随时间呈指数关系。l固定化酶的固定化酶的半衰期计算公式如下计算公式如

29、下：半衰期t1/2=0.693/KD，式中KD=-2.303/tlg(E0/E)，KD称为衰减常数，其中E/E0是时间t后酶活力残留的百分数。E0为起始酶活力；E为时间t后残留酶活力。固定化酶的热稳定性固定化酶的热稳定性 l将固定化酶在不同温度下温育（孵化）1小时之后，在最适温度下测酶活力，固定化酶的活力一般应保持在60以上。三、固定化酶（细胞）的反应器三、固定化酶（细胞）的反应器l1.固定化酶反应器的类型和特点l2.固定化酶反应器的选择依据l3.固定化酶反应器的性能评价l4.固定化酶反应器的操作四、酶工程在医药工业中的应用四、酶工程在医药工业中的应用l1.固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 l2.固定化酶法生产5-复合单核苷酸 l3.固定化酶法生产L-氨基酸 l谢谢！