《高效液相色谱分析》PPT课件.ppt

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1、复习2023/2/12分离度R定义；为什么可用分离度R作为色谱柱的总分离效能指标？能否根据理论塔板数来判断分离的可能性？为什么？根据“相似相容”原理，色谱的流出规律？热导检测器适用范围与工作原理？色谱流出规律分离非极性物质，一般选用非极性固定液，各组分按沸点次序先后流出色谱柱，沸点低的先出峰，沸点高的后出峰。分离极性物质，选用极性固定液，各组分按极性顺序分离，极性小的先流出色谱柱，极性大的后流出色谱柱。分离非极性和极性混合物时，一般选用极性固定液，这时非极性组分先出峰。对于形成氢键的试样，如醇、酚、胺和水等，一般选用极性或氢键型固定液，各组分按与固定液分子间形成氢键能力大小先后出峰。2023/

2、2/122023/2/122023/2/12第第三三章章高效液相色谱高效液相色谱分析法分析法一一、高效液相色谱法特点高效液相色谱法特点CharacteristicofHPLC二、二、影响色谱峰扩展及分离的因素影响色谱峰扩展及分离的因素Thefactorsthatinfluencepeakexpansionandseprationhighperformanceliquidchromatograph3-13-1概述概述2023/2/122023/2/122023/2/122023/2/12经典经典LC与与HPLC比较比较2023/2/12HPLC:采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器采用

3、高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器 HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便 2023/2/12GC与HPLC的比较2023/2/12与与GC比较，比较，HPLC的的优点优点1.分析对象广分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析

4、除永久气定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。体外所有的有机和无机化合物。2.流动相对分离起作用流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；不产生相互作用力；HPLC的流动相对组分产生相互作用力，相的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。3.经常在室温条件下操作经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行气相色谱法一般在较高温度下进行2023/2/12缺点缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。仪器设备费用昂贵

5、，操作严格。与与GC相比，流动相差别相比，流动相差别vGC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vHPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性2023/2/122023/2/12影响色谱峰扩展及分离的因素影响色谱峰扩展及分离的因素基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因子)、塔板理论及速率理论。由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。2

6、023/2/12速率理论速率理论(与与GC对比对比)GC:HPLC:2023/2/12速率理论速率理论(与与GC对比对比)讨论：讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next2）涡流扩散项及其影响 next2023/2/12速率理论速率理论(与与GC对比对比)2023/2/12速率理论速率理论(与与GC对比对比)3）传质阻抗项及其影响 2023/2/12HPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min3.柱温的选择

7、：选室温250C左右2023/2/122023/2/12第第三三章章高效液相色谱高效液相色谱分析法分析法一一、液、液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph二二、液、液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph三、离子交换色谱三、离子交换色谱ion-exchangechromatograph五、离子对色谱五、离子对色谱ion-pairchromatograph四、离子色谱四、离子色谱ionchromatograph六、排阻色谱六、排阻色谱size-exclusionchromatograph3

8、-23-2主要分离类型与原理主要分离类型与原理highperformanceliquidchromatographbasicprincipleandmainseparatingtypes2023/2/12一、一、液液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流流动动相相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正正相相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反反相相reversephase）。正相与反相的出峰

9、顺序相反；固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化化学学键键合合固固定定相相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。2023/2/12二、二、液液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatography 固固定定相相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾

10、；2023/2/12三、三、离子交换色谱离子交换色谱ion-exchangechromatography 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流流动动相相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基基本本原原理理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3-Na+M+=RSO3-M+Na+阴离子交换：RNR4+Cl-+X-=RNR4+X-+Cl-应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2023/2/12四、四、离子对色

11、谱离子对色谱ionpairchromatography 原原理理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴阴离离子子分分离离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳阳离离子子分分离离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反反相相离离子子对对色色谱谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。2023/2/12五、五、离子色谱离子色谱ionchromato

12、graphy离子色谱是在离子色谱是在20世纪世纪70年代中期发展起来的一项技术，其年代中期发展起来的一项技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快

13、速的在线检测方法。洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。2023/2/121 1、离子色谱法原理、离子色谱法原理 离离子子交交换换原原理理，与与传传统统离离子子交交换的不同点：换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。2023/2/122 2、离子色谱优点、离子色谱优点（1 1）分析速度快）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2 2）分离能力高）分离能力高 在

14、适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2023/2/123 3、离子色谱装置类型、离子色谱装置类型 suppressedapparatusofIC抑制型：抑制柱型、连续抑制型抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂。非抑制型非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸

15、盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。2023/2/12离子色谱连续抑制装置图离子色谱连续抑制装置图2023/2/12离子色谱连续抑制原理图离子色谱连续抑制原理图2023/2/124 4、离子色谱的应用、离子色谱的应用 applicationofIC阴离子分析阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。2023/2/12六、六、排阻色谱色谱排阻色谱色谱size-e

16、xclusionchromatography 固定相固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原原理理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 2023/2/12第第三三章章高效液相色谱高效液相色谱分析法分析法一、一、液相色谱固定相液相色谱固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色谱流动相二、液相色谱流动相mobilephaseofHPLC三、分离条件的选择三、分离条件的选择3-3 3-

17、4 3-3 3-4 液相色谱的固定相液相色谱的固定相液相色谱的流动相液相色谱的流动相highperformanceliquidchromatographstationaryphaseandmobilephaseofHPLC2023/2/12一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相stationaryphasesofLC 1.1.液液-液分配及离子对色谱法固定相液分配及离子对色谱法固定相（1）全多孔型担体）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体）表面多孔型担体

18、 （薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；2023/2/12（3）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSiC稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：硅碳键型：SiCd.硅氮键型：硅氮键型：SiN2023/2/12化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐

19、水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；2023/2/12 2.2.液液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：510m；2023/2/123.3.离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为

20、担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：（1）阳阳离离子子交交换换树树脂脂（强强酸酸性、弱酸性）性、弱酸性）（2）阴阴离离子子交交换换树树脂脂（强强碱碱性、弱碱性）性、弱碱性）2023/2/12 4.4.空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多

21、孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2023/2/12二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相mobilephasesofLC 1.1.流动相特性流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2023/2/122.2.流

22、动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常常用用溶溶剂剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2023/2/123.3.流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩

23、短。常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2023/2/124.4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，

24、流动相不应有紫外吸收。2023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/12第第三三章章高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法一、一、高效液相色谱高效液相色谱仪仪HPLC二、流程及主要部件二、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC3-53-5高效液相色谱的高效液相色谱的特点与仪器特点与仪器highperformanceliquidchromatographfeatureandinstrume

25、ntofHPLC2023/2/12一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器highperformanceliquidchromatograph2023/2/12液相色谱仪（液相色谱仪（2）2023/2/12液相色谱仪（液相色谱仪（3）2023/2/12液相色谱仪（液相色谱仪（4）2023/2/12二、流程及主要部件二、流程及主要部件processandmainassemblyofHPLC1.1.流程流程2023/2/122.主要部件主要部件(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因

26、此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/12(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2023/2/12(3)进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：2023/2/122023/2/122023/2/122023

27、/2/122023/2/122023/2/122023/2/12(4)高效分离柱高效分离柱2023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/12平均颗粒度，颗粒度分布颗粒度(dp)颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布颗粒分布越宽柱效低(渗透性差)颗粒形状球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展对HPLC柱的了解（一）平均孔径/孔体积孔径/孔体积分布大的孔径可分析高分子量的分子键合相化学影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同

28、种类的化合物分离不同可能导致色谱的分离机理不同如：C18、C8、CN对HPLC柱的了解（二）含碳量含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好，重现性好有利于极性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗不同色谱柱的含碳量 色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱C%C%kk苊苊苊苊(50/50(50/50的乙腈的乙腈的乙腈的乙腈/水水水水)Symmetry C181917Zorbax ODS1715.7LiChrosorb RP-181510.3Symmetry C81212.5Resolve C-181212.4Ultrasphere OD

29、S1111.3Partisil ODS-31112.0Bondpak C-1810 7.9Nova-Pak C-18 7 5.5对HPLC柱的了解(三)填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）残基处理的效果NovaPak C18未封口未封口 C18 抗坏血酸抗坏血酸 烟酰胺烟酰胺 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 哌咯西叮哌咯西叮 核黄素核黄素 苯酚苯酚 盐酸硫胺盐酸硫胺对HPLC柱的了解（四）硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：k生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小是色谱柱质量好坏的重要

30、标志对HPLC柱的了解（五）填料的稳定性硅胶填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2时键合相水解新一代硅胶基质的色谱柱 Symmetry高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均10ppm 孔径100A，5球形颗粒，端基封口超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面积：300 m2/g孔体积：1mL/g特点好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长Waters聚合物基质的反相柱特殊设计的多孔聚合物胶有很宽的 pH 适应范围（2-12）可用离子抑制方法分析碱性化合物有非常不同的选择性柱效及韧性比相应的硅胶柱低色谱机理不太清楚文献背景低，用户少色谱柱的规格内径检测的灵敏度样品的容量长度分离度，

31、理论塔板数速度样品的容量检测的灵敏度2023/2/12采用采用ODS柱为固定相柱为固定相,甲醇甲醇-水为流动相水为流动相,用用HPLC分离两种弱碱性药物分离两种弱碱性药物(pKa=89),但分离效果不理但分离效果不理想想;主要表现为柱效能低主要表现为柱效能低,保留时间过短保留时间过短.试设计通试设计通过改变流动相提高分离效能的方案过改变流动相提高分离效能的方案.(10分分)2023/2/12(5)液相色谱检测器液相色谱检测器a.紫外检测器紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积

32、8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。2023/2/12b.b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2023/2/122023/2/12光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器2023/2/12c.荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector）高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；2023/2/12d.示

33、差折光检测器示差折光检测器（differential refractive index detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；2023/2/12示差折光检测器示差折光检测器2023/2/12液相色谱常用检测器的一般性质检测器检测器选择性选择性梯度洗梯度洗脱脱线性范线性范围围检测限检测限(g/ml)敏感性敏感性对流速对流速对温度对温度紫外紫外紫外吸紫外吸收收可以可以10521010不敏感不敏感低低示差示

34、差通用型通用型不可以不可以1042107不敏感不敏感104荧光荧光荧光物荧光物质质可以可以1031011不敏感不敏感低低电化学电化学电活性电活性不可以不可以1061012敏感敏感1.5%电导电导离子离子不可以不可以2104108敏感敏感2%2023/2/12一、一、影响分离的因素影响分离的因素factorsinfluencedseparation二、分离类型的选择二、分离类型的选择choiceofseparationtypes三、液相色谱的应用三、液相色谱的应用applicationofHPLC四、液相制备色谱四、液相制备色谱preparativeliquidchromatography五、实

35、际应用过程注意事项五、实际应用过程注意事项3-6 3-7 3-83-6 3-7 3-8影响分离的因素与操影响分离的因素与操作条件的选择作条件的选择highperformanceliquidchromatographfactorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition第三章第三章高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法2023/2/12一、一、影响分离的因素影响分离的因素factorsinfluencedseparation1.1.影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之

36、一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。2023/2/12 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2023/2/12 2.2.流速流速 流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。3.3.固定相及分离柱固定相及分离柱气相色谱中的固定

37、液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2023/2/12二、分离类型选择二、分离类型选择choiceofseparationtypes2023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/12三、三、HPLC的的应用应用applicationofHPLC1.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药

38、残留量进行分析。2023/2/12有有机机氯氯农农药药毒毒性性大大、具具持持久久性性，正正被被特特异异性性更更高高、更更易易降降解解的的有有机机磷磷农农药药和和有有机机氮氮农农药药取取代代，但但其其热热稳稳定定性性差差，易易在在柱柱上上降降解解。可可用用高高效效液液相相色色谱谱检检测测。例例如如，氨氨基基甲甲酸酸酯酯农农药药是是一一类类应应用用范范围围宽宽，药药效效高高，而而对对哺哺乳乳动动物物毒毒性性低低的的农农药药，随随着着大大量量生生产产和和应应用用，对对水水环环境境造造成成了了污污染染。由由于于它它们们热热稳稳定定性性差差，不不适适于于用用气气相相色色谱谱法法测测定定，Anderson

39、等等在在测测定定河河水水中中的的氨氨基基甲甲酸酸酯酯时时，先先将将样样品品经经过过填填有有反反相相 C18薄薄壳壳型型填填料料的的预预柱柱，再再进进人人Altex Ultrasil ODS分分析析柱柱，以以磷磷酸酸一一乙乙酸酸缓缓冲冲溶溶液液和和甲甲醇醇的的混混合合液液为为流流动动相相，用用高高灵灵敏敏度度的的电电化化学学检检测测器器测测定定，对对灭灭害害威威、多多菌菌灵灵等等氨氨基基甲甲酸酸酯酯的的最最低低检检测测质质量可达量可达50430pg。2023/2/122.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线

40、性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器2023/2/12多多环环芳芳烃烃类类不不易易气气化化，而而在在紫紫外外或或荧荧光光检检测测器器上上有有灵灵敏敏的的响响应应，可可消消除除或或减减少少无无紫紫外外吸吸收收或或无无荧荧光光信信号号化化合合物物的的干干扰扰，且且在在反反相相色色谱谱柱柱中中很很好好地地分分离离，常常用用高高效效液液相相色色谱谱法法测测定定饮饮用用水水、地地下下水水和和江江、河河、湖湖水水中中的的多多环环芳芳烃烃，用用二二氯氯甲甲烷烷或或环环己己烷烷进进行行萃萃取取，将将萃萃取取液液经经佛佛罗罗里里硅硅土

41、土或或硅硅胶胶色色谱谱柱柱预预分分离离，浓浓缩缩后后注注入入ODS柱柱，用用甲甲醇醇水水或或乙乙睛睛，水水为为流流动动相相，分分离离各各种种多多环环芳芳烃烃，荧荧光光或或紫紫外外分分光光光光度度检检测测器器检检测测。也也可可将将水水样样经经高高分分子子多多孔孔材材料料如如 AmberliteXAD 2、XAD 4、GDX等等富富集集，再再适适当当的的溶溶剂剂洗洗脱脱，浓浓缩缩后后注注入入高高效效液液相相色色谱谱分分析析。美美国国环环保保局局的的6440法法采采用用Thk甲甲烷烷萃萃取取水水中中的的16种种多多环环芳芳烃烃，萃萃取取液液经经干干燥燥浓浓缩缩后后，注注入入反反相相HC ODS Si

42、l X色色谱谱柱柱，用用乙乙睛睛水水为为流流动动相相进进行行梯梯度度洗洗脱脱，用用紫紫外外检检测测器器和和荧荧光光检检测测器器鉴鉴别别测测定。定。2023/2/123 3.水中酚类化合物水中酚类化合物酚酚类类化化合合物物属属有有毒毒有有机机污污染染物物。水水中中痕痕量量的的酚酚类类化化合合物物易易形形成成氯氯酚酚使使饮饮水水出出现现异异味味。我我国国水水中中优优先先控控制制污污染染物物黑黑名名单单中中68种种有有毒毒污污染染物物中中6种种为为酚酚类类。高高效效液液相相色色谱谱测测酚酚类类化化合合物物可可保保持持组组成成不不变变，无无需需衍衍生生可可直直接接测测定定，对对不不同同取取代代和和不不

43、同同结结构构的的酚酚可可同同时时分分离离分分析析且且重重现现性性好好、灵灵敏敏度度高高、选选择择性性好好。通通常常先先将将水水样样酸酸化化至至pH 4，再再经经二二氯氯甲甲烷烷、氯氯仿仿、乙乙醇醇等等溶溶剂剂萃萃取取或或通通过过AmberliteXAD2、XAD4、GDX502、上上试试401等等高高分分子子多多孔孔树树脂脂进进行行富富集集，再再用用乙乙醇醇等等溶溶剂剂洗洗脱脱，浓浓缩缩后后注注入入反反相相色色谱谱柱柱，用用甲甲醇醇水水乙乙酸酸为为流流动动相相进进行行梯梯度洗脱，用紫外检测器或二极管阵列检测器测定。度洗脱，用紫外检测器或二极管阵列检测器测定。2023/2/124 4.水中硝基化

44、合物的分析水中硝基化合物的分析硝硝基基化化合合物物是是制制造造军军火火的的主主要要原原料料，军军火火的的生生产产和和施施用用引引起起的的硝硝基基化化合合物物对对水水环环境境的的污污染染。由由于于其其热热不不稳稳定定性性常常用用液液相相色色谱谱法法检检测测。Maskarinec等等用用高高效效液液相相色色谱谱法法测测定定了了水水中中硝硝胺胺类类、硝硝基基苯苯类类和和硝硝酸酸酯酯类类炸炸药药。先先用用Porapak树树脂脂吸吸附附富富集集水水中中痕痕量量的的硝硝基基化化合合物物，再再用用丙丙酮酮洗洗脱脱，浓浓缩缩后后用用乙乙酸酸钠钠一一氯氯乙乙酸酸缓缓冲冲溶溶液液和和丙丙酮酮的的混混合合液液为为流

45、流动动相相，用用ZorbaxODS色色谱谱柱柱分分离离，用用灵灵敏敏的的电电化化学学检检测测器器定定量量测测定定，硝硝化化甘甘油油（NG）和和季季戊戊炸炸药药（PETN）的的最最低低检检测测质质量量可可达达0104ng。2023/2/125 5.水样中无机物的分析水样中无机物的分析离离子子色色谱谱可可分分析析阴阴离离子子和和阳阳离离子子。使使用用电电导导检检测测器器最最低低检检测测质质量量浓浓度度为为几几百百g/L，使使用用电电化化学学检检测测器器最最低低检检测测质质量量浓浓度度则则可可低低达达几几个个g/L。一一次次分分析析可可同同时时测测多多种种阴阴离离子子或或阳阳离离子子，分分析析的的灵

46、灵敏敏度度高高，所所用用的的样样品品量量小小。若若用用富富集集柱柱，可可将将水水样样富富集集可可达达到到很很低低的的检检测测质质量量浓浓度度。使使用用磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液为为流流动动相相，采采用用反反相相高高效效液液相相色色谱谱法法紫紫外外检检测测环环境境水水样样中中的的硝硝酸酸盐盐，最最低低检检测测浓浓度度可可达达0.7g/L。一一些些金金属属离离子子可可与与有有机机试试剂剂形形成成螫螫合合物物，经经反反相相高高效效液液相相色色谱谱法法分分离离后后可可用用分分光光光光度度检检测测器器测测定定。另另外外，水水样样中中的的砷砷和和硒硒可可用用高高效效液液相相色色谱谱与与交交流流等等离离子检测

47、器和柱后氢化物发生器联用技术进行分离检测。子检测器和柱后氢化物发生器联用技术进行分离检测。2023/2/12四、制备型液相色谱四、制备型液相色谱preparativeliquidchromatography获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k

48、降降低低10%为宜。为宜。2023/2/122.2.液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。2023/2/123.3.制备型液相色谱制备型液相色谱 制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱制备柱：内径2050mm，柱长50cm。五、实际应用过程注意事项五、实际应用过程注意事项1.选选HPLC参数时的基本考虑参数时的基本考虑溶解度溶解度-选择流动相的条件选择流动相的条

49、件分子量分子量-在样品预处理或在样品预处理或GPC分析时有用分析时有用官能团官能团-有否离子化基团有否离子化基团?保留特性如何保留特性如何?样品的基质样品的基质-考虑如何前处理考虑如何前处理在基质中样品的含量在基质中样品的含量-分析、制备都考虑分析、制备都考虑检测特性检测特性-有否紫外吸收有否紫外吸收?荧光荧光?找出样品中不同组份之间的差异找出样品中不同组份之间的差异w摸索条件的重要线索摸索条件的重要线索 极性问题2023/2/122.对HPLC柱的了解色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷10020

50、0ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗2023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/122023/2/123.流动相及样品的预处理液相色谱对流动相的要求除色谱柱对流动相对的要求外，还有与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长流动相的脱气流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低