《微生物学教学课件》第六章微生物生长繁殖.ppt

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1、第六章第六章 微生物的生长及其微生物的生长及其控制控制第一节第一节测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法 第二节第二节微生物的生长规律微生物的生长规律第三节第三节影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的主要因素第四节第四节微生物培养法微生物培养法第五节第五节有害微生物的控制有害微生物的控制第六节第六节引起食品变质的微生物引起食品变质的微生物第一节第一节 测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法一一测微生物生长量的方法测微生物生长量的方法二二计微生物繁殖数的方法计微生物繁殖数的方法 一一 测微生物生长量的方法：测微生物生长量的方法：（一）直接法：（一）直接法：1 1 测体积（离心法）测体积（离心法）2

2、 2 测干重（离心法、过滤法）测干重（离心法、过滤法）（二）间接法：（二）间接法：1 1 比浊法：利用分光光度计或是浊度计比浊法：利用分光光度计或是浊度计测定微生物细胞的浓度测定微生物细胞的浓度2 2 间接成分测定：测含氮量、含碳量、间接成分测定：测含氮量、含碳量、测遗传物质的量测遗传物质的量3 3 生理指标法：生理指标法：呼吸强度、耗氧、酶活呼吸强度、耗氧、酶活性、生物热等性、生物热等 原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定

3、波长密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、特点：快速、简便；但易受干便；但易受干扰。比比浊浊法法测含氮量测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的一般细菌含氮量为干重的12.5%12.5%，酵母，酵母菌为菌为7.5%7.5%，霉菌为，霉菌为6.0%6.0%；根据一定体积培养；根据一定体积培养液中的含氮量再乘以液中的含氮

4、量再乘以6.256.25，就可测得粗蛋白，就可测得粗蛋白的含量。的含量。细胞成分测定细胞成分测定二二 计微生物繁殖数的方法：计微生物繁殖数的方法：（一）直接法（微生物总数（一）直接法（微生物总数,包括死菌在内）包括死菌在内）1 1、比例计数法、比例计数法 2 2、血球计数板计数法、血球计数板计数法 1 比例计数法比例计数法 将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。知菌液的细胞

5、浓度。这种计数方法比较粗放。这种计数方法比较粗放。需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。2血球计数板法血球计数板法血球计数板的图示血球计数板的图示原理：将原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为的薄层空间划分为400小格，从中均匀小格，从中均匀分布地选取分布地选取80或或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，

6、不）细菌细胞太小，不易沉降；（易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。血球计数板法血球计数板法 （二）间接法（活菌计数法）（二）间接法（活菌计数法）1 1、液体稀释法、液体稀释法 2 2、平板菌落计数法、平板菌落计数法10n10n-210n-1When we observe colonies,we cannot assume each arose from just o

7、ne cell originally planted on the medium,however.A pair,chain or cluster of cells which land on the medium in close proximity to each other can multiply and produce a single colony.Thus,we use the term colony-forming unit when we consider the common origin for the cells of any colony.This term is us

8、ually abbreviated CFU.Colony-Forming Unit常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。含菌数。薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 n一一同步生长同步生长n二二典型生长曲线典型生长曲线n三三微生物的连续培养微生

9、物的连续培养n四四微生物的高密度培养微生物的高密度培养一一同同步步生生长长：通通过过同同步步培培养养而而使使细细胞胞群群体体处处于分裂步调一致的状态。于分裂步调一致的状态。获得同步生长的方法主要有两类：获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。随机选择，不影响细胞代谢。获得同步生长的方法：获得同步生长的方法：二二 典型生长曲线（群体生长曲线）典型生长曲

10、线（群体生长曲线）（分批培养）（分批培养）微生物典型生长曲线表示的是非丝状单细胞微生物典型生长曲线表示的是非丝状单细胞微生物在液体培养时的生长规律，广泛地应微生物在液体培养时的生长规律，广泛地应用于生产及研究上。用于生产及研究上。将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。制所得的曲线。生长曲线的制作生长曲线

11、的制作典型的生长曲线典型的生长曲线（Growth curve）延延滞滞期期对对数数期期稳定期稳定期衰亡期衰亡期细菌的同步生长与非同步生长的曲线细菌的同步生长与非同步生长的曲线 大肠杆菌生长实测生长曲线大肠杆菌生长实测生长曲线一定量的微生物接种于装有一定体积培养基一定量的微生物接种于装有一定体积培养基的装置中，进行一段时间的培养。期间，的装置中，进行一段时间的培养。期间，微生物数量的变化趋势？微生物数量的变化趋势？延滞期：少量细胞接延滞期：少量细胞接种到新培养基后的一种到新培养基后的一段细胞数目不增加的段细胞数目不增加的适应期。其长短主要适应期。其长短主要受微生物的接种龄、受微生物的接种龄、接种

12、量和培养基成分接种量和培养基成分的影响。的影响。对数期：细胞数以几对数期：细胞数以几何级数增长的一段时何级数增长的一段时期。其时间长短主要期。其时间长短主要受菌株种类、营养成受菌株种类、营养成分和营养物质浓度的分和营养物质浓度的影响影响。稳定期：新繁殖的细胞稳定期：新繁殖的细胞数目与衰亡的细胞数目数目与衰亡的细胞数目相等的一段时期相等的一段时期。衰亡期：细胞死亡数衰亡期：细胞死亡数目超过新生的细胞数目超过新生的细胞数目的时期。死亡的细目的时期。死亡的细胞发生自溶胞发生自溶。上节回顾上节回顾n工业上如何解除反馈抑制工业上如何解除反馈抑制n微生物生长量的测定方法微生物生长量的测定方法n微生物繁殖数

13、的测定微生物繁殖数的测定n典型生长曲线的适用范围典型生长曲线的适用范围n典型生长曲线的特征典型生长曲线的特征1 生长曲线各时期的特点生长曲线各时期的特点1)1)延滞期（延滞期（lag phase）又称停滞期、适应期）又称停滞期、适应期n 细菌数目不增长的时期。细菌数目不增长的时期。n 特特点点：生生长长速速率率常常数数等等于于零零；细细胞胞形形态态变变大大或或增增长长；RNARNA尤尤其其rRNArRNA含含量量增增加加，合合成成代代谢活跃；对外界不良条件敏感。谢活跃；对外界不良条件敏感。影响延滞期的因素：影响延滞期的因素：接种龄；（对数期接种时，延滞期短；接种龄；（对数期接种时，延滞期短；延

14、滞期或稳定期，延滞期居中；衰亡期接种，延滞期或稳定期，延滞期居中；衰亡期接种，延滞期延长）延滞期延长）接种量（负相关）接种量（负相关）培养基成分（营养丰富则延滞期短培养基成分（营养丰富则延滞期短)2)2)指数期（指数期（exponential phase）又称对数期）又称对数期 以以几几何何级级数数速速度度分分裂裂，细细胞胞数数目目迅迅速速增增加加的时期。的时期。特特点点：生生长长速速率率常常数数R R最最大大，则则细细胞胞每每分分裂裂一一次次所所需需要要的的代代时时G G或或原原生生质质增增加加一一倍倍所所需需时时间间最最短短；细细胞胞进进行行平平衡衡生生长长，各各种种组组分最为均匀；酶系活

15、跃，代谢旺盛。分最为均匀；酶系活跃，代谢旺盛。繁繁殖殖代代数数：n（lgx2lgx1）/lg2=3.322(lgx2lgx1)生生长长速速率率常常数数Rn/(t2-t1)=3.322(lgx2lgx1)/(t2-t1)代时（代时（G）：）：G=1/R=(t2-t1)/3.322(lgx2lgx1)生长繁殖中的有关计算公式生长繁殖中的有关计算公式影响指数期的因素：影响指数期的因素：菌种菌种:生长周期长的微生物生长周期长的微生物,指数期则长；指数期则长；营养成分：营养丰富则指数期短；营养成分：营养丰富则指数期短；营营养养物物浓浓度度：限限制制性性营营养养浓浓度度大大则则指指数数期期长；长；概概念念

16、：凡凡是是处处于于较较低低浓浓度度范范围围内内，可可影影响响生生长长速速率率和和菌菌体体产产量量的的营营养养物物。又又称称生生长长限限制因子制因子 培养温度：最适温度时，指数期较短；培养温度：最适温度时，指数期较短；一些细菌的代时一些细菌的代时菌名菌名培养基培养基培养温度培养温度代时代时E.coli（大肠杆菌）（大肠杆菌）肉汤肉汤3717minE.coli牛奶牛奶3712.5Enterobacteraerogenes（产气肠细菌）（产气肠细菌）肉汤或牛奶肉汤或牛奶371618E.aerogenes组合组合372944B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）（蜡状芽孢杆菌）肉汤肉汤3018B.therm

17、ophilus（嗜热芽孢杆菌）（嗜热芽孢杆菌）肉汤肉汤5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌）（嗜酸乳杆菌）牛奶牛奶376687Streptococcuslactis（乳酸链球菌）（乳酸链球菌）牛奶牛奶3726S.lactis乳糖肉汤乳糖肉汤3748Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）（伤寒沙门氏菌）肉汤肉汤3723.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌）（褐球固氮菌）葡萄糖葡萄糖2534446Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合（结核分枝杆菌）组合3779293Nitrobacteragili

18、s（活跃硝化杆菌）（活跃硝化杆菌）组合组合2712003)3)稳定期（稳定期（stationary phase）死死亡亡细细胞胞数数目目和和新新增增殖殖细细胞胞数数目目平平衡衡,即即细细胞胞数数目目基基本本不不变变的的时时期期。平平衡衡后后期期，曲线有下降趋势。曲线有下降趋势。菌菌体体产产量量与与营营养养物物貭貭的的消消耗耗间间呈呈现现一一定定的的比比例关系。例关系。生长产量常数生长产量常数 Y Y（x xx x0 0）/(C/(C0 0-C)=-C)=（x xx x0 0）/C/C0 0 x x：稳定期的细胞干重；：稳定期的细胞干重；x x0 0：刚接种时的细胞干重；：刚接种时的细胞干重；C

19、 C0 0：限制性营养物的最初浓度：限制性营养物的最初浓度在稳定期，细胞开始贮存糖原、异染粒和在稳定期，细胞开始贮存糖原、异染粒和脂肪等贮藏物，产芽孢，产次生代谢产物。脂肪等贮藏物，产芽孢，产次生代谢产物。可通过补料、调节可通过补料、调节pH、调整温度等措施以延长稳调整温度等措施以延长稳定期累积更多的代谢产物。定期累积更多的代谢产物。4)4)衰亡期（衰亡期（decline phase）n由由于于营营养养物物质质的的进进一一步步匮匮乏乏和和代代谢谢废废物物的的累累积积，大大量量的的微微生生物物死死亡亡、自自溶溶，导导致致细细胞数目急剧减少的时期。胞数目急剧减少的时期。n细细胞胞死死亡亡后后自自溶

20、溶释释放放出出一一些些产产物物如如：氨氨基基酸、转化酶、外肽酶、流出培养物。酸、转化酶、外肽酶、流出培养物。lg 细胞数或产物细胞数或产物浓度浓度时间时间细胞细胞 产产物物I型型II型型微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：是一致的。一般认为：初级代谢初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的的稳定期稳定期是这些产物的最佳收获时机；是这些产物的最佳收获

21、时机；次级代谢次级代谢产物与微生物的产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微它们的形成高峰往往在微生物生长生物生长稳定期的后期或稳定期的后期或衰亡期。衰亡期。2微生物生长与代谢产物形成的关系微生物生长与代谢产物形成的关系代谢产物和微生物细胞形成过程的关系代谢产物和微生物细胞形成过程的关系(a)酵母菌形成的初级代谢产物酵母菌形成的初级代谢产物乙醇；乙醇；(b)产黄青霉形成的次级代谢产物产黄青霉形成的次级代谢产物青霉素；青霉素；

22、丝状微生物的纯培养采用丝状微生物的纯培养采用孢子孢子接接种，在液体培养基中震荡培养或种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用以用菌丝干重菌丝干重作为衡量生长的指作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。干重为纵坐标，绘制生长曲线。可分为三个阶段：可分为三个阶段：1、生长停滞期、生长停滞期2、迅速生长期、迅速生长期3、衰退期、衰退期3丝状微生物的群体生长丝状微生物的群体生长三三 微生物的连续培养微生物的连续培养连连续续培培养养是是指指向

23、向培培养养容容器器中中连连续续流流加加新新鲜鲜培培养养液液，使使微微生生物物的的液液体体培培养养物物长长期期维维持持稳稳定定、高高速速生生长长状态的一种溢流培养技术，又称开放培养。状态的一种溢流培养技术，又称开放培养。原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。就能长期保持对数期的

24、平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养单批培养 恒浊法恒浊法恒化法恒化法 单批培养单批培养连续培养连续培养时间时间连续流入连续流入新鲜培养液新鲜培养液lg细胞数（个细胞数（个/ml）连续培养连续培养 连续培养原理连续培养原理一）根据控制方式不同，连续培养分为：一）根据控制方式不同，连续培养分为：1恒恒浊浊器器连连续续培培养养：控控制制微微生生物物细细胞胞的的生生长长密度的一种连续培养形式密度的一种连续培养形式2恒恒化化器器连连续续培培养养：通通过过控控制制某某一一种种营营养养物物的的浓浓度度，使使其其始始终终成成为为生生长长限限制制因因子子的的条条件件下达到的一种连续培养形式。下达到的一种连续

25、培养形式。概念：概念：通过调节培养基流速，使培通过调节培养基流速，使培养液养液浊度保持恒定浊度保持恒定的连续培养方法。的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变浓度不变,即浊度不变。主要采用即浊度不变。主要采用恒浊器，恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度

26、；但工艺复内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。杂，烦琐。连续培养技术连续培养技术恒浊培养恒浊培养使用范围：用于生产大量菌体、使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。代谢产物，如乳酸、乙醇等。恒化器恒化器Chemostat 或或bactogenD=f(流速流速)/v(容积容积)装置装置控制对象控制对象培养基培养基培养基培养基流速流速生长速生长速率率产物产物应用应用范围范围恒浊器恒浊器菌体密度菌体密度（内控制）（内控制）无限制无限制生长因生长因子子不恒定不恒定最高最高大量菌体大量菌体或与菌体或与菌体形成相平形成相平行的产物行的产

27、物生产生产为主为主恒化器恒化器培养基流培养基流速（外控速（外控制）制）有限制有限制生长因生长因子子恒定恒定低于最低于最高高不同生长不同生长速率的菌速率的菌体体实验实验室为室为主主恒浊器与恒化器的比较恒浊器与恒化器的比较二）按培养器级数分二）按培养器级数分单级连续培养器：单级连续培养器：适宜于代谢产物的产生速率适宜于代谢产物的产生速率与菌体生长速率相平衡的发酵，如乙醇发酵与菌体生长速率相平衡的发酵，如乙醇发酵多级连续培养器：多级连续培养器：适宜于生产的产物与菌体生适宜于生产的产物与菌体生长不平行的发酵，如丙酮或某些次生代谢产长不平行的发酵，如丙酮或某些次生代谢产物的生产物的生产三）连续培养与分批

28、培养的比较三）连续培养与分批培养的比较1连续培养的优点：连续培养的优点：高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多操作单元，从而减少了非生产时间；许多操作单元，从而减少了非生产时间；便于自动控制便于自动控制产品质量较稳定产品质量较稳定节约了大量动力、人力、水和蒸汽等节约了大量动力、人力、水和蒸汽等2连续培养的缺点：连续培养的缺点：菌种易变异；菌种易变异；易污染杂菌；易污染杂菌；营养物的利用率一般低于单批培养营养物的利用率一般低于单批培养四四 微生物的高密度培养微生物的高密度培养一）微生物的高密度培养一般指的是液体培养一）微生物的高密度培养一般指

29、的是液体培养中细胞群体密度超过常规培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的倍以上时的生长状态或培养技术。生长状态或培养技术。二）高密度培养的优点二）高密度培养的优点提高菌体培养密度，提高产物的比生产率，提高菌体培养密度，提高产物的比生产率，不仅可减少培养容器的体积、培养基的消耗不仅可减少培养容器的体积、培养基的消耗和提高产物的分离、提取效率，而且还可以和提高产物的分离、提取效率，而且还可以缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成本。本。三）进行高密度培养的具体方法三）进行高密度培养的具体方法1选取最佳培养基成份和各成份含量选取最佳培养基成份和各成份含量2

30、补料补料3提高溶解氧的浓度提高溶解氧的浓度4防止有害代谢产物的生成防止有害代谢产物的生成5保持合适的保持合适的pH第三节第三节 影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的主要因素一一 温度温度二二 氧气氧气三三 pHpH一一 温度温度 对对于于微微生生物物的的需需要要可可将将温温度度分分为为适适合合 生长温度、最高生长温度、最低生长温度。生长温度、最高生长温度、最低生长温度。根根据据对对温温度度的的要要求求将将微微生生物物区区分分为为：嗜嗜冷微生物；嗜热微生物；嗜温微生物冷微生物；嗜热微生物；嗜温微生物 菌菌 名名生长温度生长温度发酵温度发酵温度累积产物温度累积产物温度 （）（）（）Strept

31、ococcus thermophilus374737S.lactis3440产细胞：产细胞：2530产乳酸：产乳酸：30Streptomyces griseus3728_Corenybacterium pekinense32 3335_Clostridium acetobutylicum3733_Penicilium chrysogenum302520不同生理生化过程的最适温度不同生理生化过程的最适温度微生物不同生理活动要求不同温度，所以，微生物不同生理活动要求不同温度，所以，最适生长温度最适生长温度 发酵速度快、积累代谢产物多。发酵速度快、积累代谢产物多。n以青霉素的生产为例：培养以青霉素的

32、生产为例：培养165小时采用分小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30培养提高了培养提高了14.7%。n分段控制方式：分段控制方式：05小时，小时，30；540小小时，时，25；40125小时，小时，20；125165小时，小时，25。二二 氧气氧气氧对于微生物比较重要，可以提供呼吸作用的氢供氧对于微生物比较重要，可以提供呼吸作用的氢供体，同时可以氧化有机物及无机物产能。体，同时可以氧化有机物及无机物产能。微生物根据对氧的需要程度可以区分为专性微生物根据对氧的需要程度可以区分为专性好氧微生物、兼性厌氧微生物、微好氧微生好氧微生物、兼性厌氧微生物

33、、微好氧微生物、耐氧微生物及专性厌氧微生物。物、耐氧微生物及专性厌氧微生物。1 1 专专性性好好氧氧微微生生物物（strict aerobe）：有有氧氧才才能能生存生存 以以O O2 2作作为为最最终终氢氢受受体体，利利用用呼呼吸吸形形式式产产能能。因因此必须生活在有氧的条件下。此必须生活在有氧的条件下。细细胞胞内内存存在在SODSOD（超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶）、过过氧氧化化物酶和过氧化氢酶物酶和过氧化氢酶。2 2 兼性厌氧微生物（兼性厌氧微生物（facaltative aerobe）有有氧氧时时，靠靠呼呼吸吸形形式式产产能能。无无氧氧时时，借借发发酵酵或或无无氧氧呼呼吸吸等等形形式式产

34、产能能。故故有有氧氧时时生生长长速速度度高于无氧时高于无氧时 细胞内存在含细胞内存在含SODSOD和过氧化氢酶和过氧化氢酶。n酵母菌在有氧条件下迅速生长繁殖，进行好氧呼吸，将有酵母菌在有氧条件下迅速生长繁殖，进行好氧呼吸，将有机物彻底氧化成机物彻底氧化成CO2和和H2O，并产生大量菌体；在无氧条件，并产生大量菌体；在无氧条件下，发酵葡萄糖产生乙醇和下，发酵葡萄糖产生乙醇和CO2。如果将氧通入正在发酵葡。如果将氧通入正在发酵葡萄糖的酵母悬液中，发酵速率迅速下降，葡萄糖的消耗随之萄糖的酵母悬液中，发酵速率迅速下降，葡萄糖的消耗随之下降。该氧对葡萄糖耗量的抑制现象，称为巴斯德效应。下降。该氧对葡萄糖

35、耗量的抑制现象，称为巴斯德效应。3 3 微好氧菌（微好氧菌（microaerophilic bacteria）只只能能在在较较低低的的氧氧分分压压下下才才能能生生长长的的微微生生物物。利用呼吸形式产能。利用呼吸形式产能。4 4 耐氧菌（耐氧菌（aerotolerant anaerobe）有氧条件进行厌氧生活，靠专性发酵获能量。有氧条件进行厌氧生活，靠专性发酵获能量。生长不需要氧，但分子氧对其也无害生长不需要氧，但分子氧对其也无害细胞内存在细胞内存在SODSOD和过氧化物酶和过氧化物酶5 5 厌氧菌（厌氧菌（anaerobe）利用无氧呼吸和发酵形式产能。利用无氧呼吸和发酵形式产能。H2O+O22

36、 O2 +2H+O2+H2O22H2O12SOD好氧生物好氧生物和耐氧细菌和耐氧细菌过氧化氢酶过氧化氢酶 好氧生物好氧生物过氧化物酶过氧化物酶 NADH2NAD耐氧菌耐氧菌好氧微生物细胞中存在超氧化物歧化酶好氧微生物细胞中存在超氧化物歧化酶（SODSOD）和过氧化物酶、过氧化氢酶以消除过）和过氧化物酶、过氧化氢酶以消除过氧化物对其的伤害，从而能在有氧的条件下氧化物对其的伤害，从而能在有氧的条件下生存生存分子氧在细胞中会形成有害的过氧化物。分子氧在细胞中会形成有害的过氧化物。O22HH2O2O2+eO2-这些物质均对微生物有害这些物质均对微生物有害 厌厌氧氧微微生生物物细细胞胞中中不不含含SOD

37、SOD、过过氧氧化化物物酶酶及及过过氧氧化化氢氢酶酶等等消消除除过过氧氧化化物物的的酶酶类类，因因此此必必须须生生活在严格无氧的条件下活在严格无氧的条件下上节内容回顾上节内容回顾典型生长曲线的适用范围和意义典型生长曲线的适用范围和意义典型生长曲线特征及影响因素典型生长曲线特征及影响因素处于不同生长时期的微生物细胞生理特征处于不同生长时期的微生物细胞生理特征连续培养的类型连续培养的类型根据对氧的要求将微生物区分为哪五种类型根据对氧的要求将微生物区分为哪五种类型好氧微生物为何只能在有氧条件下生存好氧微生物为何只能在有氧条件下生存厌氧微生物为何只能在无氧条件下生存厌氧微生物为何只能在无氧条件下生存氧

38、对兼性厌氧微生物的影响氧对兼性厌氧微生物的影响氧浓度对不同微生物生长的影响氧浓度对不同微生物生长的影响三三 pH（59）不不同同微微生生物物对对环环境境pH要要求求不不同同，其其中中最最适适生生长长pH偏偏碱碱范范围围内内的的微微生生物物称称为为耐耐碱碱性性微微生生物物；而而最最适适生生长长pH偏酸范围内的微生物称为耐酸性微生物。偏酸范围内的微生物称为耐酸性微生物。同一种微生物在不同生长阶段和生理、生化过同一种微生物在不同生长阶段和生理、生化过程中有不同的最适程中有不同的最适pH要求。要求。培培养养基基内内某某些些中中性性成成分分在在发发酵酵过过程程中中能能引引起起培培养液的养液的pH变化：变

39、化：有机物：有机物：糖类糖类发酵氧化发酵氧化有机酸有机酸 pH pH脂肪脂肪水解水解有机酸有机酸 pH pH蛋白质蛋白质脱羧脱羧胺类胺类 pH pH无机盐：无机盐：NH3pHpHNO3-pHpHpH变化对微生物的影响：变化对微生物的影响：1）引引起起细细胞胞膜膜电电荷荷的的变变化化，影影响响营营养养物物质质的的吸收吸收2）影响酶的活性）影响酶的活性第四节第四节 微生物培养法微生物培养法一一实验室培养法实验室培养法二二生产实践中培养微生物的装置生产实践中培养微生物的装置一一 实验室培养法实验室培养法（一）（一）固体培养法固体培养法1好氧菌的固体培养好氧菌的固体培养试管斜面、培养皿琼脂平板、克氏扁

40、瓶及茄试管斜面、培养皿琼脂平板、克氏扁瓶及茄子瓶等子瓶等2厌氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养高层琼脂柱、厌氧培养皿、高层琼脂柱、厌氧培养皿、亨盖特滚管亨盖特滚管技术技术及及厌氧罐厌氧罐技术、技术、厌氧手套箱厌氧手套箱等等厌氧培养箱厌氧培养箱（二）（二）液体培养法液体培养法1好氧菌的液体培养好氧菌的液体培养试管液体培养、三角瓶浅层液体培养、试管液体培养、三角瓶浅层液体培养、摇瓶培摇瓶培养养及及台式发酵罐台式发酵罐等等2厌氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养培养基中加入巯基乙醇、半胱氨酸等还原剂减培养基中加入巯基乙醇、半胱氨酸等还原剂减小氧压。小氧压。Laboratory process developm

41、entShake Flask ExperimentsOptimization of conditions for cell growth and product formation using shake flask experiments:1.pH2.Temperature3.Dissolved oxygen(DO)4.Substrate choice5.Maximal and optimal substrate concentration6.Others实验室台式发酵罐实验室台式发酵罐二二 生产实践中培养微生物的装置生产实践中培养微生物的装置（一）（一）固态培养法固态培养法1好氧菌的曲法培

42、养好氧菌的曲法培养接过种的固体基质薄薄地滩铺在容器表接过种的固体基质薄薄地滩铺在容器表面，这样，既可使微生物获得充分的氧气，面，这样，既可使微生物获得充分的氧气，又可让微生物在生长过程中生产的热量及时又可让微生物在生长过程中生产的热量及时释放。释放。2厌氧菌的堆积培养法厌氧菌的堆积培养法传统的白酒生产传统的白酒生产（二）液体培养法（二）液体培养法1好氧菌的培养好氧菌的培养1）浅盘培养：）浅盘培养：一种用大型盘子对好氧菌进行浅一种用大型盘子对好氧菌进行浅层液体静止培养的方法。如早期的青霉素和柠檬层液体静止培养的方法。如早期的青霉素和柠檬酸的发酵酸的发酵2）深层液体通气培养）深层液体通气培养发酵罐

43、（发酵罐（fermenter）是一种钢质圆筒形直立容）是一种钢质圆筒形直立容器，发酵罐的主要作用是要为微生物提供丰富而器，发酵罐的主要作用是要为微生物提供丰富而均匀的养料，良好的通气和搅拌，适宜的温度和均匀的养料，良好的通气和搅拌，适宜的温度和酸碱度，并能确保防止杂菌污染。有一套必要的酸碱度，并能确保防止杂菌污染。有一套必要的附属装置，例如培养基配置系统，蒸汽灭菌系统。附属装置，例如培养基配置系统，蒸汽灭菌系统。以及发酵产物的后处理系统。以及发酵产物的后处理系统。Industrial Fermentation Settingn2厌氧菌的培养厌氧菌的培养n如啤酒等的发酵，生产过程中不需要提供无菌

44、如啤酒等的发酵，生产过程中不需要提供无菌空气，所以发酵罐的结构比较简化空气，所以发酵罐的结构比较简化Industrial Scale upnTo transfer the pilot scale results into a commercially feasible production setting.nFermentor sizes range from 100 L to 500,000 L,depending on products.第五节第五节 有害微生物的控制有害微生物的控制基本概念基本概念一一物理杀菌因素的代表高温物理杀菌因素的代表高温二二化学杀菌剂或制菌剂化学杀菌剂或制菌剂三三

45、影响微生物生长的环境因素影响微生物生长的环境因素基本概念基本概念 1 1 灭灭菌菌（sterilization）：采采用用强强烈烈的的理理化化因因素素使使任任何何物物体体内内外外部部的的一一切切微微生生物物永永远远丧丧失失其其生生长长繁繁殖殖能能力力的的措措施施。分分为为杀杀菌菌和和溶溶菌菌两两种。如高温灭菌和辐射灭菌。种。如高温灭菌和辐射灭菌。2 2 消消毒毒（disinfection）：采采用用较较温温和和的的理理化化因因素素仅仅杀杀死死物物体体表表面面或或内内部部一一部部分分对对人人体体有有害害的的病病原原菌菌，而而对对被被消消毒毒的的物物体体基基本本无无害害的的措措施（防止传染）。施（

46、防止传染）。3 3 防腐（防腐（antisepsis）：利用某种理化因素完）：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖从而达到防止全抑制霉腐微生物的生长繁殖从而达到防止食品等发生霉腐的措施。食品等发生霉腐的措施。如：低温、缺氧、如：低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度、高醇度、添加防腐剂等干燥、高渗、高酸度、高醇度、添加防腐剂等4 4 化疗（化疗（chemotherapy）：利用高度选择毒力）：利用高度选择毒力的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称化学疗剂

47、。用于化疗目的的化学物质称化学疗剂。如：抗生素、磺胺类药物、生物药物素和中草药如：抗生素、磺胺类药物、生物药物素和中草药 一一 物理杀菌因素的代表高温物理杀菌因素的代表高温一）一）高温对微生物的影响：高温对微生物的影响：1蛋蛋白白、核核酸酸等等在在高高温温下下能能发发生生变变性性反反应应，从从而影响酶的活性及微生物的正常生长繁殖；而影响酶的活性及微生物的正常生长繁殖；2幼幼菌菌对对温温度度较较敏敏感感，营营养养体体对对高高温温比比芽芽孢孢敏感敏感 1 1干干热热灭灭菌菌：破破坏坏微微生生物物的的细细胞胞膜膜，使使蛋蛋白白变变性性，原原生生质质干干燥燥以以及及各各种种细细胞胞成成分分发发生生氧化

48、反应，进而杀灭有害微生物。氧化反应，进而杀灭有害微生物。1）灼烧灭菌法：对接种环等金属工具进行灭菌。）灼烧灭菌法：对接种环等金属工具进行灭菌。2）干干热热灭灭菌菌法法：加加热热空空气气以以杀杀灭灭微微生生物物。一一般般在在170170条条件件下下维维持持1h1h，或或是是在在160160条条件件下下维维持持2h2h。主主要要适适用用于于金金属属或或玻玻璃璃器器皿皿，其其中中玻玻璃璃器器皿皿需需要要用用纸纸包包裹裹以以减减少少热热的冲击。的冲击。二）高温灭菌的种类二）高温灭菌的种类2湿湿热热灭灭菌菌：利利用用加加热热的的水水或或是是水水蒸蒸汽汽对对微微生生物物进进行行杀杀灭灭。一一般般微微生生物

49、物经经过过60左左右右处理处理510分钟，即可杀灭。分钟，即可杀灭。真菌的孢子耐热真菌的孢子耐热80细菌的芽孢耐热细菌的芽孢耐热12015分钟分钟 1）常压法（）常压法（pasteurization）巴氏消毒法巴氏消毒法 60-85 60-85处理处理3030分分-15-15秒：秒：低温维持法（低温维持法（63 3063 30分）分）高高温温瞬瞬时时法法（72-85 72-85 1515秒秒或或120-140 120-140 2-42-4秒秒）：含含有有易易被被热热破破坏坏的的物物质质成成分分，如如牛奶、果汁的消毒；牛奶、果汁的消毒；煮沸消毒法；煮沸消毒法；间间歇歇灭灭菌菌法法：或或称称丁丁达

50、达尔尔灭灭菌菌法法、分分段段灭灭菌菌法法。主主要要针针对对于于含含有有芽芽孢孢杆杆菌菌或或是是丝丝状状微微生物孢子的物质。生物孢子的物质。操操作作方方法法：80100煮煮1560分分37过过夜夜80100重复重复3次次2)2)加压法：加压法：通过加热水而产生的蒸汽进入细胞通过加热水而产生的蒸汽进入细胞中释放潜热，杀菌效果较干热灭菌及常压灭菌好。中释放潜热，杀菌效果较干热灭菌及常压灭菌好。常规加压法常规加压法 121 121（0.101Mpa0.101Mpa、1kg/cm1kg/cm2 2 or 15or 15磅磅/英寸英寸2 2）15-2015-20分钟分钟 或或115115（0.08Mpa0