WesternBlot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答).docx

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1、四、WEST BLOTTINGWestern Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)佚名文章来源：本站原创点击数：12403更时间：2022-9-30 9:50:44收藏此页Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进展检测。对表达蛋白，可用相 应抗体作为一抗进展检测，对基因的表达产物，可通过融合局部的抗体检测。本文主要通过以下几个方面来具体地介绍一下Western Blot技术：一、原理二、分类i.放射自显影ii,底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、试验常见的问题指南.参考书推举1 .针对样品的常见问题.

2、抗体2 .滤纸、胶和膜的问题.Marker的相关疑问6.染色的选择.参照的疑问7 .缓冲液配方的常见问题.条件的摸索8 .方法的介绍.结果分析W. Western Blot中抗体的重复应用问题解答：抗体工作溶液一般不主见储存反复使用，但是如抗体比拟贵重，可反复使用23次。稀释后应在2 一3天内使用，4度保存，避开反复冻融。4.滤纸、胶和膜的问题NC膜 PVDF膜 尼龙膜怎样鉴别？解答：尼龙膜是较抱负的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价 格最廉价；PVDF膜介于二者之间。就结合力量而言：尼龙膜结合DNA和RNA力量可达480600Rg/cm2,可结合短至1

3、0bp的核酸片段；硝 酸纤维素膜结合DNA和RNA力量可达80-100gg/cm2,对于200bp的核酸片段结合力量不强；PVDF膜 结合DNA和RNA力量可达125 300（ig/cm2。就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照耀后，核酸中的局部喀咤碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸 纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不结实；PVDF膜结合结实，耐高温，特别适合于蛋白印迹。 就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易裂开；PVDF膜较强。就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不 能重复使用；PVDF膜可以重复使用。Y.在做Wester

4、n Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更简洁跟带负电的蛋白质结合， 做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。Z.检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？解答：可以。AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为 什么？解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分 子的就有可能会变淡。BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化

5、酶失活。CC.承受tank system有什么讲究？解答：建议低电压，长时间，一般tank System用衡压好点），如28V 14 16hrsoDD.做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。EE.膜一般要如何处理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF.假设是6x8转印膜，要加多少一抗？解答：一抗的稀释度是有说明的，依据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3- 5mloGG.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能到达最正确效果。解答：无要求。HH.跑电泳的时候配的胶总

6、是“缩”是什么缘由呢？是有的成分不对吗？解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以 了。假设过夜，胶里的水分被蒸发，承受保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可 以重配制一份观看；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避开找问题麻烦。脱色液中甲醇的含 量太高也会造成胶缩。n.膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答：假设是用的是半干转，挨次为：阴极一滤纸一胶一膜一滤纸。滤纸的长宽分别比胶小L 2mm,而膜 的长宽分别比胶大1 2mm。确定禁忌：上下两层滤纸由于过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过 胶和滤纸。JJ.蛋白质的分子量跨

7、度很大，如要分别小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗？解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12%SDS-,湿转36V , 3- 5hrs 就可以了，可以依据你试验室的阅历调整；170kd用7%SDS , 48V 10hrs-16hrsoKK.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决?解答：可以考虑：转移缓冲液中参加20%甲醇（是指终浓度）（优化的转移缓冲液，可以参考蛋白质技术 手册），由于甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合力量，甲醇可以防止凝胶变形， 甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液参加终浓度

8、0.1%SDS,也是为了增加转移效率；用优 质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6%。太大时还可 以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压/电流；增加转移时间。LL.如何选择最适宜的蛋白杂交膜？解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学试验中极为常用的一门技术。选择质量上层、符合要求、便利适用的 杂交膜是打算这项试验成败的重要环节。依据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素， 我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹试验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数 带负电荷的蛋白质会与硝酸

9、纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是格 外清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离 子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。依据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的 硝酸纤维素膜。由于随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越结实。但是膜孔径假设小于 0.1mm,蛋白的转移就很难进展了。因此，我们通常用0.45岬和0.2pm两种规格的硝酸纤维素膜。大于 20kD的蛋白就可以用0.45叩的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2gm的膜了，假设用0.45gm的膜就会发生 “BlowthroRgh”的现象。

10、从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维 素膜的结合力量主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维 素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司承受的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量， 可达80-15（Hig/cm2。由于100%的纯度，因而也大大削减了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨 度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜比拟脆，漂洗一两次就 会破损，不能反复使用。PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质， 而且可

11、以分别小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，由于硝酸纤维素膜在Edman试剂中会 降解，所以就查找了 PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳 定、耐腐蚀使它成为蛋白测序抱负的用品，始终沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进展各种 染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、区分率和蛋白亲和力在精细工艺下比 常规的膜都要高，格外适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进展浸泡饱和1-5秒钟。离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是依据离子交换的方式 结合生物大分

12、子的。由DEAE (二乙氨乙基)修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以作为蛋白 质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下， DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以 用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的争辩。这种0.45m孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting 外，还可以用于核酸结合争辩。还有一种离子交换型膜是竣甲基(CM)修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带 正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7o结合的多肽分子可以从CM膜

13、上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或 微测序。5 . Marker的相关疑问MM.我用的是可视marker (BICLRAD),但是电泳总跑不全8条带，请问什么缘由？怎样改善？胶用过8%, 10%, 12%,都是这样。marker是买的。解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或削减电泳时间试试看。固然梯度胶也是不错的 选择。NN.用的是 Roche molecular Biochemicals 公司的由 lOOkd, 75kd, 45kd, 30kd, 20kd, Nkd 组成的 marker。 开头做Western Blot时还能够看到marker,固然也仅能观察其中最多三条带

14、。用80V进展SDS-电泳，用恒压 10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有 一条大约是30KD的条带消灭。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进展分析，用培育基样 品进展分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP)。但就是出不 来结果，我很茫然。感谢您过赐予教导！解答:1、“我用的是 Roche molecular Biochemicals 公司的由 lOOkd, 75kd, 45kd, 30kd, 20kd, lOkd 组成 的marker。开头做We

15、stern Blot时还能够看到marker,固然也仅能观察其中最多三条带。“有的时候，Prestained Marker放久了效果就会变差，电泳是条带不清楚，集中。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能 是蛋白跟膜结合的不严密。转移是多加点甲醇。2、“前几次做Western Blot时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是 30KD的条带消灭。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比拟好。3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进展分析，用培育基样品进展分析，没有用间接 法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶

16、联抗体（Anti-V5-HRP）。是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性比照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。6 .染色的选择00. Western Blot哪种染色好？解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可到达1.5摩，考马虽然与 氨基黑有一样的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后简洁从蛋白质中除去，以便进展随 后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵 敏度低。（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。

17、7 .参照的疑问PP.是否Western Blot试验半定量肯定要加ACTIN内参？解答：对于发表文章的试验最好加内参，试验严谨。QQ.用BANDSCAN分析结果行吗？解答：分析一般的结果没问题。RR.核内抗原Western Blot内参选择什么适宜？解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可 以选出你耍的内参。SS.转膜时承受电流是否比电压准确，是否依据0.8mA/cm2, 一般1小时左右？ 解答：不是的，半干法推举用恒流，一般依据目的蛋白的大小来确定电流和时间。TT.做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot,内参Bactin, GA

18、PDH,那个好？解答：选用beta-actin就可以。8 .缓冲液配方的常见问题UU.转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris-HCl就是Tris盐用HC1调ph值，配置而 成。VV.预备做大鼠脑子的Western Blot,蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步 都必需要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？ 解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。WW.想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制

19、剂时有什么原那么吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区 分吗？解答：一般来说提取时参加光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特别 的方法，一般来说都没有区分。XX.最近作了两次Western Blot,不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和 显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD-分子量67kd,提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。 蔗糖不会有影响把？样本-20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是1:100。假设是 一抗的缘由，不会背景都没有把？ 3、第一次有不均匀背景，由于一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景

20、显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST,漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为0.1%, 不会是封闭液的问题吧？解答：可以在下面几个问题上找找缘由。1.封闭液用5%Milk,漂洗液(washing buffer用TBST) 2.看看 一抗是否能work,降到1： 20o 3.看看二抗是否有问题。YY.加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起着肯定的固定作用，由于小分子蛋白质简洁转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，由于NC膜 结合蛋白质的力量较弱)。ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最终那个T是Tween吗，浓度多大？ 解答：是 Tween

21、,配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl, 0.2g of KC1, and 3g of Tris base in 800ml of distilled H20, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HC1, Add distilledH20 to IL, Sterilize by autoclaving.AAA.封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比方现在我就在室温里做，或者要在4度下?解答：均可在室温进展，假设时间不够，一抗孵育可以先

22、在室温进展一个小时，然后 4 度过夜。BBB.试验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫麻提取膜蛋白吗？配方如下：7M尿素，2M 硫版，Triton-x-100 0.2ml,颖参加：65mM DTT蛋白酶抑制剂：试剂盒 HaltTM Protease inhibitor cocktail kit I %（v/v）是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？ 改进的 RIPA 裂解缓冲液（Tris.HCl, 50 mmol/L, pH 7.5; NaCl, 150 mmol/L; NP-40, 1%;脱氧胆酸钠， 0.5%; SDS,

23、0.1%; EDTA, 1 mmol/L; PMSF, 1 mmol/L; Leupeptin, 2 Rg/ml）不知对于膜蛋白效果如何？ 此外该方中的EDTA,是否用做蛋白酶抑制剂？解答：做2D确定不推举使用NP 4 0 （由于即使进口的NP 4 0也不纯，其中的杂质会影响质 谱结果）。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail,由于7M 尿素+ 2 M硫腺+ 4%CHAPS构成的变性环境已经足以抑制大局部蛋白酶的活性，2 M硫腺+ 4%C HA PS对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过假设您专职做膜蛋白建议承受分级抽提法。此外还可以承受 梯度离心法和一

24、些基于去垢剂的方法。EDTA用于灭活金属蛋白酶（主要是其整合作用）。加过多的蛋 白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做WB无所谓，做MA I LD I时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲 液中少了两性电解质（在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：供给连续的PH梯度，从很大程度上增 加蛋白质的溶解性;还可以去除一局部核酸）；也不推举承受SDS,因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发 生转变，假设您实在要用，终浓度降到0.1%以下。METHOD2（50ml 总量）：?-mercaptoethanol 342 gl； 20% SDS 5 ml； Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加 ddH2

25、O 至 50 mlo 方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50C水浴箱中30min,连续振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按的转移好的膜来再次使 用了。该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。METHOD3 1、beta-metaptoethanol 35ul2、10%SDS 1ml 3、tris（0.5M, pH6.7） 625ul4、dH20 3.34ml50 -55, 30minoMETHOD4stripping buffer应当是可以放置很久的。不过我习惯于现配 到底，加了 p-merc叩toethanol以后太难闻 了，配了就用；而且，

26、有了现成的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液，现配还是很便利的。每次用量5ml少了 点，我每次用50ml oMETHODS0.5M NaCl, 0.5M HAc；室温摇床 15minoMETHOD6将用过的膜泡在1*TBS中室温振摇过夜，中间可以换液2-3次，然后封闭，加一抗，二抗（同第一次发光）， 实践证明方法完全可行。不管用那种方法，洗脱后都要用PBS或TBS再洗几次。9 .条件的摸索DDD.用的是Santa Cruz的抗体，也试验过一抗和二抗确定能结合，二抗加DAB确定能显色。电泳的胶用考 马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与 Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是5

27、5KD、 29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色觉察大分子量蛋白转过去的较少。莫非是裂解液出了问题？我 用的是三去污剂，但没加叠氮钠和或许叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解-80度冻存的细胞，4度 12022g离心5分钟，取上清，与分子克隆其次版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上样。不知 道是哪里出了问题？解答：建议：1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度，一般来 讲，其浓度应当在几-20微克/微升。2、假设是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、 29KD,建议分别用10%和1

28、2%的胶。60-80V, 1小时左右。跑过积层胶与分别胶的线时，换用100V, 3-4 小时。3、转膜，建议恒压，15V,不用转2小时，45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是 由于在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时，但和45分钟的区分并不大。4、依据MARKER的条带1我的是7条带：14、18、25、35、45、66、116KD）,您依据MARKER的条 带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条带。这样第一，可以节约抗体，其次，您 要的目的条带确定在上面。5、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度。6

29、、我买的也是Santa Cruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应领先找其他方面的缘由。EEE,电泳用的是恒流，一块胶，20mA, 100分钟左右。转膜也是恒流，38mA, 100分钟。而且我用别人 的细胞和一抗在我的整个反响体系下做出来了，固然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应当出在抗原 和一抗上，不知对不对。解答：电泳的条件：样品的分子量打算了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时 浪酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以打算电泳的电压和时间。建议你用恒压80 100伏。FFF. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），当电流过高

30、，而系 统的散热又比拟差，滤纸的吸水性比拟差的状况下，就很简洁烧胶。就转膜时，是实行恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很简洁烧胶，我 的胶有68cm2,用50mA恒流来转膜，刚开头电压就很高，有20 V左右，而用恒压，开头电流有110mA,但 15min后，电流就降到80mA, 30min后就稳定在40mA,不就相当于恒流吗？解答：恒流时电压渐渐上升的缘由是湿滤纸渐渐变干因而电阻渐渐增大的原因，假设电压升得太快，可以 使滤纸更湿一些以抑制。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd以下的分子丧失很多，不过我用的是 小胶40cm2,不知有无不同。GGG我想尽量提高

31、转膜的效率（我的试验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道 有那些方法？解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或过度转移（电压过大时间过长）的问 题，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不行得兼呵呵。建议把胶切成两半，比方以35KD为界， 分别进展转膜，下半时间短，上半时间长一点，应当会好一些。HHH.请问-TPVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白简洁掉 下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜）， 同时也有疏水作用

32、，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。111. 1、煮好后的样品，假设没有准时上样分别，应如何保存，可以保存多久？ 2、有没有人在用bio-rad的小 型垂直电泳槽，有没有操作手册？ 3、湿式转移时是否必需要用bio-rad的专用滤纸？ 4、恒压转移的条件如 何确定，由于我要分别小至21KD,中至66KD,大致170KD的蛋白质，转移条件能够一样吗？ 5、凝胶的 浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分别的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是 不是不在这个范围内也能分别，只是就不是线性范围了？解答：1、煮好后的样品，放到-20,我们在一个月后此样品，

33、效果一样。2、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-Rad USA上有。3、转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。4、转移条件是和蛋白质大小有关的：以次确定电压和时间。具体可让ptglab帮你定夺。5、凝胶的浓度也是和分别蛋白质大小有关。不是随心所欲选的，否那么分别效果可能不是你所期望的。JJJ.怎样设计试验来确定最正确的条件？解答：任凭说一点，具体的还是需要自己想：1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，（也可以跑1个大well,不插梳子， 多上样，）SDS-；2、转移，设定电流或电压；3、每隔1 lorn）小时，取一点膜染色，看转移效果。KKK.

34、我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好， 我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分钟，好似没什么效果？解答：你可以加毓基乙醇（loading buffer 一样的浓度），56度，30mins,看看。LLL. 1、在用PBS洗涤抗原.抗体-ProteinA-Agarose复合物时，每次要重悬多长时间适宜？ 2、最终用2xSDS 重悬抗原-抗体复合物离心后，由于2XSDS中已经参加了溟芬兰，因此下面的Agarose珠子几乎看不到， 所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了 Agaroseo不知有什么方法可以解决这个问题，或者即使吸进 了一些Agaros

35、e也不要紧呢？一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot承受的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质， “探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过 分别的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜) 上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分别的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素标记的其次抗体起反响，经过底 物显色或放射自显影以检测电泳分别的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水 平的表达。二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水

36、平和试验条件的是用第一种方法，目前发表文章通 常是用底物化学发光ECLo只要买现成的试剂盒就行，操作也比拟简洁，原理如下(二抗用HRP标记)：反 响底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP,即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。三、主要试剂1、丙烯酰胺和N, N，-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双闪稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v) 丙稀酰胺和l%(w/v)N, N亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g, N, N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H20至)储于棕色瓶，4c避光保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反响是光催化或碱催 化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重配制。如有沉

37、淀，可以过滤。2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS, lmlH20去离子水配制，室温保存。3、分别胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8): 18.15gTris 和 48mllmol/LHCL 混合，加水稀释到 100ml 终体 积。过滤后40C保存。4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH2O 中，用约 48mlimol/L HCL 调至 pH6.8 加水稀释到100ml终体积。过滤后40c保存。这两种缓冲液必需使用Tris碱制备，再用HCL调整PH值， 而不用Tris.CLo5、TE

38、MED原溶液N, N, N，N，四甲基乙二胺催化过硫酸铉形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH 太低时，聚合反响受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。供给两种丙稀酰胺聚合所必需的自由基。去离子水 配制数ml,临用前配制.6、SDS-力口样缓冲液:pH6.8 0.5mol/LTris 缓冲液 8ml,甘油 6.4ml, 10%SDS 12.8ml,毓基乙醇 3.2ml, 0.05%溟酚蓝1.6mL H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后 解答：1、不用重悬多久，重悬起来了就可以离心了。2、加2X BUFFER前大体上已经知道有多少胶粒了，吸到

39、那个位置时留神点就是了。我也试过一些次，首先 离心略微长一点，长20秒吧，期望胶粒能沉得结实点（我想象的），再吸取。假设感觉枪头不是很顺畅的 时候可能就是遇到胶粒了。很难一点胶粒也吸取不上来的，尽力做好就是了。MMM.磷酸化抗体的检测样本制备时是否肯定要加NaF等？解答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大局部时候是不用加的。我做 的时候从未加过，都做出来了。NNN. Western Blot 中 block 的最短时间？解答：每一步1小时足够了， 中间换抗体要洗的话多换液几次，每次时间10分钟就够，洗3次只要半小 时。跑胶1小时，转移1小时，block半小时就行，

40、1抗1小时，洗半小时，2抗1小时，洗半小时，显色 10分钟。一般跑两块胶，一块染色，一块westerno 一天确定完事，一般不用等到其次天。OOO.想用Western检测基因转染后细胞培育上清中表达的目的蛋白（定性），分子量为20KD,浓度约为 几百ng/mL蛋白样品需浓缩、纯化吗？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot 时需特别留意哪些条件？解答：依据你供给的浓度，假设做Western Blot,是不用浓缩样品的.对于20kd的小分子的蛋白，Western Blot 中要留意的是：1、转移时的时间，2、转移时的电流或电压.3 transfer buffer 中

41、加 20%的甲醇.4、可以用13-15%的分别胶.PPP.蛋白分子量大小分别为21kd、28kd,用的是湿转，请问多大电流，多长时间比拟适宜？解答：分子量比拟小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2, 30min就应 当够了。湿转，依据bio-rad的说明，用100mA,也得要半个多小时吧。QQQ.需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量，但相互间干扰太大，怎么办？解答：将膜放入 stripping buffer （SDS 2%, Tris Ci （PH=6.7） 62.5mM, beta-筑基乙醇 lOOmM）中，50孵育30分钟，TTBS西三次，再重参加一抗，进

42、展另一种抗原的检测。RRR.做Western Blot试验时，觉察转膜时的电流总是偏小，转膜的效率也偏低.100V恒压转膜时的电流只 有190mA左右，而以前都有250mA。体系和条件都和以前一样，只是环境温度比以前低了很多。解答：有可能重复使用了转移缓冲液，随着离子的渐渐削减，电阻越来越大，固然恒压时电流越来越小了。 建议更换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。环境温度低是有利于转移的。SSS.我电泳用的是恒流，一块胶，20mA, 100分钟左右。转膜也是恒流，38mA, 100分钟。而且我用别 人的细胞和一抗在我的整个反响体系下做出来了，固然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应当出在抗 原和

43、一抗上，不知对不对。一抗我买的是单抗，推举的稀释度是1： 1001： 1000c我用的是1： 100o 莫非非要用多抗吗？按道理单抗也应当出条带呀！细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加毓基乙醇变性 后，每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？解答：1、建议您用恒压进展电泳，先用70V,等跑过积层胶与分别胶的界限时，换用90-100V,再跑3小 时左右。2、转膜可用恒流，但要依据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小， 一般来讲，0.8-3.0mA/CM2,分子量大的蛋白就用的电流大些，譬如，你膜的面积是30CM2,蛋白的分子 量是80KD,那么你就可以以2.0

44、mA/CM2的条件进展，你就可以60mA的电流进展。3、我觉得你的抗体 应当没问题。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我们试验事都是保存在-20度的，提出蛋白分装保存在 20度。TTT.目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白，RT-PCR就显示细胞中mRNA表达不高，估量将培育上清冻干 浓缩后承受Western Blot还可能检测不出，但假设用western,是否肯定要用0.2|im的膜？用Tris-tricine SDS -电泳，电泳时分别管制三层凝胶，分别胶用40%T丙稀酰胺（2.6%C）浓度为16.5%,另外两层都用 30%丙稀酰胺，中间一层浓度为10%,积层胶浓度为4%,凝胶厚度1mm,转膜

45、的条件试过30V70分钟, 膜上可见到小分子蛋白marker的条带，好似见到目的条带，上样量为60咫细胞胞浆总蛋白，转膜的条件 怎么样适宜？解答：肯定要用0.2pm的膜，并且转移的条件要摸索一下，小分子的Western不好做，要依据你的试验器 材来定，一般你要是有prestained marker就可以参照一下，假设相应的分子量大小的marker转移的好就可 以了。UUU.怎样才能把胶跑的格外秀丽，泳道和band都能很直，是不是上样的量很重要，罐胶有什么技巧吗?想跑秀丽，是不是应领先小电压，再高电压，总体上电压小些会跑的好些?还有前面有人说电泳液平玻璃板 会使电泳条带秀丽些？解答：影响跑胶跑的

46、质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压 越小，条带越秀丽，浓缩胶80v,分别胶lOOv就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分 别越均匀。倒胶之前，肯定要充分混匀，玻璃板肯定要干净，双蒸水隔离时，肯定要比拟轻地加上去，避 开稀释上层的分别胶，使胶不均匀。VVV.为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丧失一些哪?什么缘由？解答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一局部小分子的就透过去了。上次转染了 1.6*106细胞，收集，收集到了 400微升体积，加6*loading buffer, 95度煮5分钟，-2

47、0度， 交替3次，离心，上样，7%分别胶，先80v跑进分别胶，在100v电泳至滨酚兰出胶，biorad半干转PDVF 膜，15v转30分钟，预染marker全部进膜，转移后的胶考马斯亮兰染，可见残留的蛋，大分子量多些.blot 时，封闭用5%奶粉TTBS1小时,抗体稀释液TTBS, 一抗（1:10,单抗上清，2022年制备）1小时，二抗 （1:2022）1小时，均在室温.结果，50kd的小分子显色，160kd大分子未显色。缘由分析及预备改进：转染大容量的质粒（融合蛋白的质粒）的效率会相对较低，大分子量表达也会相对较 低，加上大分子量蛋白的转移不完全，可能是我没有拿到大分子量条带结果的缘由。另外

48、背景略微有一些 脏（背景整体均匀全都），估量是二抗的浓度高了些，预备降至1:5000,另外抗体稀释液预备改用5%奶粉 TTBS,封闭改为室温2小时。这个过程有没有问题？解答：首先分析你的整个试验步骤。我觉察了两个比拟大的毛病：1、一抗用TBST稀释。依据我的理解，一抗最好用5%的TBST脱脂牛奶稀释，和你的封闭液相全都，这 样可以降低背景。2、“biorad半干转PDVF膜，15v转30分钟，你是这么做的吗？由于我大局部时间是做的恒流转移，用的 是0.111/膜，100101-20011转2小时。到最终电压会升到20V左右。你用恒压法，我不是很确定你转30 分钟能将大分子（160kd）的抗原转上去。我建议你最好能将时间延长，假设是恒流，可按我的做法；假设 是恒压，可摸索一下，适当延长时间。有时候你的marker也有可能哄骗你，由于marker的量比拟大，是 很简洁转上去的，实际上目标蛋白的量远远少于marker量。我对你的结果分析如下：1、你的结果很好，估量离目标不远了，很快就可以成功。2、没有160kd的带是由于你的转移时间过短，适当延长转移时间（我疑心这是主要的问题）。3、你的一抗用1： 10, 2抗可以降到1： 5000,背景会低一点。10 .方法的