2023年荧光定量PCR实验报告.docx

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1、荧光定量PCR实验报告目前需要检测抗癌药A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响，根据该药物在文献记 录中发挥作用的时间点0小时,6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA, 请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平影响。一、实验原理。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反映体系中加入荧光基团，运用荧光信号枳 累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。研究表白，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越 多，Ct值越小。运用己知起始提贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝 数的对数，纵坐标代Ct值。因此,只要

2、获得未知样品的。值，即可从标准曲线上计算出该 样品的起始拷贝数。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。本实验重要采用 SYBR荧光染料。在PC R反映体系中，加入过量SYBR荧光染料,S YBR荧光染料特异性地 掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号， 从而保证荧光信号的增长与PCR产物的增长完全同步。二、实验试剂和器材因RNA已提取，即应准备反转录和做PCR的试剂：逆转录睡(M-MLV),核糖核酸酶克制剂(RNasin), dNTP,Taq DNA聚合的(Taq DNA p o 1 y m e r ase),随机引物(Ran

3、 d om p r im e rs),琼脂糖(agarose)均为美国 Pro mega 公司产品；荧光定量试剂盒：Hot S t a rt Fluor e s cent PCR C o re R e agen t Kits(SYBR Gre e n1) , BBI公司，合适的抑癌基因A的引物、口一 actin引物。器材：ABI 7 3 00 R e a 1 -Time PCR Sys t emRS-28高速低温离心机超低温冰箱微量移液器三、实验环节,根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点，用抗癌药A在0小时，6小时,24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNAV2反转录(RT):反转录反

4、映液组成如下表：T abl e 1 Mixed com p one n t s for synthesis o f c DN A first chain4 2 反转录5 Omin, 95 5m i n灭活反转录酶。6Compo n entVb 1 u me (1)Con centration5xR. T .buffer*5lxdNTP2.510 M/ 1RNasin220 U / 1RNA5.3gRan d om Prime r10.1 u g/ 1M-MLV65 U / 1Nucleas r F ree Water3.2Total25Syber G r e en荧光定量P C R检测：在冰上

5、按下表加样，PCR反映液组成如下表：Table 2 Mixed components f o r p o lym erase c h ain r eac t ionC om p o n entVolume (ul)R.T.pr o due t12xMa s t e r Mix1 0P r i merH2OTota 120PC R板的设立如图中所示：PCR热循环参数：964min,然后三步反映：94 30S, 58 30s, 72c 30 s ,进行 4 0个循环，于每个循环的第三步即:72 3 0 s收集荧光信号。最后在7 2c保温7min。 a3.结束反映，PCR产物放置于4c待电泳检测或-

6、20C长期保存。a四、实时荧光定量PCR结果分析：扩增完毕后，进入结果分析界面，看CT值、起始拷贝数、标准偏差等，假如是SYBR做 的话，再看下溶解曲线。以p-actin为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相 对定量值（RQ值），将RQ值用于记录分析。五、注意事项a 1 .PCR反映应当在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最佳设立一个专 用的PCR实验室。2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要可以得到可靠的结果， 纯化的方法越简朴越好。3A.所有试剂都应当没有核酸和核酸雨的污染。操作过程中均应戴 手套。4.PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0 .

7、22pm滤膜过滤除菌或高压 灭菌。5.试剂都应当以大体积配制，实验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从geneAgeneAgeneAb-actinb-actinb-actinOh geneAOhgeneAOh geneAOh b-actinOh b-actinOh b-actin6h geneA6h geneA6hgeneA6h b-actin6h b-actin6h b-actin24h geneA24 h geneA24h geneA24hb-actin24h b-actin24h b-actin而保证实验与实验之间的连续性。6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。a 7 .PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充足混匀。