《实验动物与管理教学课件》转基因动物.ppt

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1、动物转基因技术转基因技术相关概念转基因技术相关概念1.转基因：在DNA操作过程中整合到宿主细胞染色体上的外源基因 转基因技术包括下列：转基因的重组子构建技术 -构 重组分子导入宿主体内的转化技术 -转 转基因在受体细胞染色体上的稳定整合-整 转基因的可控性表达技术 -表2.转基因生物品（GMO或TO）：含有转基因并为其遗传修饰了的动 植物发育个体1转基因动物转基因动物(Transgenic AnimalTransgenic Animal)是指通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白质基因等，通常称为外源基因，导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本

2、身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。（曾溢滔院士）3、转基因动物2转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达和遗传的一类动物（包括基因敲除的动物）。1982年，华盛顿大学制备的著名“超级小鼠”将大鼠生长激素导入小鼠3转基因动物技术是指借助基因工程技术基因工程技术将体外重组的结构基因导入受精卵或早期胚胎，培育出转基因动物的技术。4，转基因动物技术4转基因动物技术的发展简史回顾1 1、第一例嵌合体小鼠、第一例嵌合体小鼠1974年最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔中（如图），得到部分组织中含有SV40DN

3、A的嵌合体小鼠。但无任何表型改变。2 2、第一个转基因小鼠系、第一个转基因小鼠系 1976年建立了世界上第一个转基因小鼠系，这些小鼠基因组中插人了莫氏白血病病毒基因。他们是运用反转录病毒反转录病毒与小鼠卵裂球共培养把外源DNA插入到小鼠的基因组中。3 3、第一例显微注射法产生转基因小鼠、第一例显微注射法产生转基因小鼠 1980年，Gordn等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。54 4、“超级鼠超级鼠”1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组小鼠2倍的“超级鼠”，首

4、先证明外源基因可在受体中表达，并且表达产物具有生物活性。5 5、转基因家畜的产生、转基因家畜的产生 转基因家兔、绵羊和猪(Hammer等，1985)、牛(Bondioli等，1988)和山羊(Ebert等，1991)等相继出世。76 6、利用转基因生产重组蛋白、利用转基因生产重组蛋白 1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁乳汁中得到绵羊的-球蛋白球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了-抗胰蛋白酶。目前，已有数十种蛋白实现了转基因生产。7 7、转、转YACYAC的转基因小鼠的转基因小鼠 近10年内，陆续出现用全长酵母人工染色体（YAC）DNA来产生转基因小鼠。8 转基因

5、动物实例一超级奶牛普通奶牛的三倍大（英国）9转基因动物实例二东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪 绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆 10转基因动物实例三转绿色荧光蛋白的兔11四、转基因鱼四、转基因鱼12转基因动物实例四正在进行转基因山羊的实验 乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊 上海交通大学医学遗传研究所13just a joke 14转基因动物操作技术流程 获取外源目的基因 含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物简明操作步骤15转基因技术操作的具体流程转基因技术操作的具

6、体流程一、目的基因的设计一、目的基因的设计 转基因可分为随机整合型基因随机整合型基因和基因敲除基因敲除（gene gene knockoutknockout）型载体基因）型载体基因。随机整合型基因要求结构完整，包括5上游启动子区和3下游区等，多用基因组文库（如BAC文库）筛选。也可人为改造基因，改造基因可选择不同的启动子来控制外源基因表达的组织特异性。基因敲除（gene knockout）型载体基因要设计与待剔除基因的同源性的载体基因。二、重组载体的构建二、重组载体的构建 选择合适的基因载体，要求载体序列不干扰外源基因的表达、能接受外源DNA容量大小、稳定、有一定滴度、对宿主细胞无威胁。16三

7、、重组载体的体外验证（三、重组载体的体外验证（in vitroin vitro）重组载体的正确性验证，如拷贝数、连接方向等。对于连有组织特异性启动子或局部体细胞转染的载体，需先在同类型的体外离体培养细胞中初步验证表达特性。四、基因转移四、基因转移 基因转移方法主要有3类：1）化学法 2）物理法 3）生物法 17五、转基因动物模型的验证五、转基因动物模型的验证 国外杂志一般需要从基因组、mRNA、蛋白质和整体表型各各个个层层次次进行验证。FISH杂交、聚合酶链反应（PCR）、免疫印迹杂交（Southern Northern blotting）、酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法等多多种

8、种方方法法，先筛筛选选出有外源基因整合的阳性动物，传代后分别在mRNA和蛋白水平上检检测测外源基因在转基因动物中的表达情况，对外源基因表达产物的生物活性和生化性质进行鉴鉴定定，以及检检查查转基因动物的生理功能和是否出现某些疾病病症状的表型等。18六、组建转基因系六、组建转基因系 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能在后代中稳定遗传。19转基因动物的制作方法一、受精卵雄原核显微注射法二、胚胎干细胞（ES细胞）法三、逆转录病毒感染法四、体细胞核移植法五

9、、精子载体法六、YAC法20一、雄原核显微注射法一、雄原核显微注射法 以以单单细细胞胞受受精精卵卵为为靶靶细细胞胞，利利用用显显微微注注射射技技术术将将构构建建好好的的载载体体DNADNA直直接接注注射射入入受受精精卵卵的的原原核核，再再将将接接受受注注射射的的受受精精卵卵移移入入假假孕孕母母体体输输卵管继续发育获得转基因动物个体。卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。目前应用较广泛，最早最经典的方法。21 这一方法的这一方法的实验程序实验程序如下：如下：载体载体DNADNA制备制备 受精卵准备受精卵准备胚胎操作过程显微注射胚胎操作过程显微注射 假孕母鼠准备假孕母鼠

10、准备(养母养母)胚胎移植胚胎移植对幼鼠鉴定对幼鼠鉴定22 用显微注射方法制备转基因动物，操作技术性很强，即使是受过严格训练的专业人员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5。因此人们往往来用增大微注射受精卵的数目的办法来弥补这一缺陷。23优点：优点：外源外源DNADNA大小基本不受限制（大小基本不受限制（1-50kb1-50kb）；）；导入过程导入过程直观；直观；整合率高整合率高缺点：缺点：设备昂贵、环节较多设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性基

11、因整合随机性转基因沉默转基因沉默24注意事项：注意事项：1.1.显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体细胞后，显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体细胞后，在染色体上的整合位置是随机的在染色体上的整合位置是随机的.2.2.外源基因外源基因甲基化程度甲基化程度在胚胎发育过程中会影响其在胚胎发育过程中会影响其活性活性.3.3.某些外源基因的表达程度可受到个体细胞某些外源基因的表达程度可受到个体细胞正常调正常调节机制节机制的控制的控制.4.4.由于受到宿主组织分化的影响，由于受到宿主组织分化的影响，外源基因还具有外源基因还具有一定的组织特异性一定的组织特异性.252 2、胚胎干细胞（、胚胎干细胞（ESE

12、S细胞）法细胞）法 ESES细胞细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的起来的多潜能细胞系多潜能细胞系。将携带有外源基因的将携带有外源基因的ESES细胞注入到动物的早期胚胎细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生内，可产生嵌合体及转基因动物嵌合体及转基因动物。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能全能性性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不在不同的培养条件下表现出不同的功能状态同的培养条件下表现出不同的功能状态。26(1993)Nature 365,878927

13、28 优点：优点：外源基因整合情况的可控性高外源基因整合情况的可控性高可可预预先先在在细细胞胞水水平平检检测测外外源源基基因因的的拷拷贝贝数数、定定 位、表达的水平及插入的稳定性位、表达的水平及插入的稳定性外外源源基基因因导导入入ESES细细胞胞的的方方法法多多样样，细细胞胞鉴鉴定定及及 筛选方便筛选方便29 缺点：缺点：ESES细胞系建立及培养困难细胞系建立及培养困难维持维持ESES细胞的未分化及多向分化潜能不易细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体所得个体为嵌合体30 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。用比较成熟，在大动

14、物上应用较晚。31 将将目的基因目的基因重组到重组到逆转录病毒载体逆转录病毒载体上，制成高上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的培养以达到感染目的),),获得转基因动物的方法。获得转基因动物的方法。3 3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法32 优点：优点：受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高33 缺点：容纳大小有限 潜在致癌性,

15、载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性344、体细胞核移植法（转基因克隆）将将外外源源基基因因导导入入到到体体细细胞胞中中，再再将将该该细细胞胞进进行行培培养养，选选择择其其中中带带有有外外源源基基因因的的细细胞胞进进行行扩扩增增，用用这这种种细细胞胞的的细细胞胞核核进进行行核核移移植植（把把体体细细胞胞核核植植入入一一个个去去了了核核的的卵卵母母细细胞胞中中，融融合合并并激激活活），将将重重组组胚胚进进行行体体外外培培养养或或者者植植入入同同步步化化的的假假孕孕动动物物的输卵管。的输卵管。35核移植是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，构建成重

16、组胚，通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术。根据核供体的来源不同，可将其分为 胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物技术。36优点：转基因效率显著超过显微注射可以方便的建立生产畜群可以预测基因表达水平可以使用定点整合目标基因的技术37已经成为标本的多莉已经成为标本的多莉将永远被人们记住！将永远被人们记住！永恒的多莉永恒的多莉38 19971997年年2 2月月2222日日，英英国国“NatureNature”刊刊登登了了爱爱丁丁堡堡罗罗斯斯林林研研究究所所维维尔尔穆穆特特的的研研究究成成果果，即即“多多莉莉”羊羊的的克克隆隆成成功功，从从此此震震

17、惊惊了了世世界。界。日日苏苏格格兰兰向向外外界界宣宣布布：多多莉莉因因早早衰衰并并患患有有肺肺炎炎，被被迫迫实实施施了了安安乐乐死死。由由于于早早衰衰问问题题，人人们们怀怀疑疑“多多莉莉是是穿穿着着羔羔羊羊服服装装的的老老羊羊”。39 优点：优点：对对体体细细胞胞进进行行基基因因改改造造后后，用用于于核核移移植植可可以以提提转转基基因因的的效效率率，不不仅仅具具有有“ES“ES细细胞胞途途径径”的的全全部部优优点，且物种适用面广。点，且物种适用面广。无无需需经经过过嵌嵌合合体体育育种种就就可可获获得得纯纯合合个个体体，周周期期短短，效率高。效率高。44 缺点：缺点：技术上难度大，技术上难度大，

18、成功率极低，成功率极低，胚胎死亡率高，胚胎死亡率高，非一般实验室可以开展。非一般实验室可以开展。45 5 5、精子载体法、精子载体法 直直接接以以精精子子为为载载体体的的转转基基因因方方法法：将将成成熟熟精精子子 与与外外源源共共培培养养，成成熟熟精精子子与与外外源源DNADNA预预培培养养之之后后，使使精精子子有有能能力力携携带带外外源源DNADNA进进入入卵卵子子中中，使使 之之 受受 精精，并并 使使 外外 源源 DNADNA整整 合合 到到 染染 色色 体体。46 目前国际上只有1例成功模型，国内也很少有相关报道，精子载体法很少被应用。47 6 6、YACYAC法法 利用酵母人工染色体

19、利用酵母人工染色体()作为载体制作转基因动作为载体制作转基因动物的方法。物的方法。酵母人工染色体（）载体是近年来发展起来的酵母人工染色体（）载体是近年来发展起来的新型载体新型载体,能克隆百万对碱基的大片段。能克隆百万对碱基的大片段。48 优点：保证大片段的完整性保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率高 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。49 因此因此介导法介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。制备转基因动物具有广阔的应用前景。除上述几种常用的转基因方法外，人们为了适应于一些特除上述几种常用的转基因方法外，人们为了适应于一些特殊需要也探索了一些其

20、他的方法。这些方法都不太成熟，殊需要也探索了一些其他的方法。这些方法都不太成熟，其应用也正被人们验证。其应用也正被人们验证。50转基因动物研究出现的问题转基因动物研究出现的问题1 1、制作转基因动物效率低、制作转基因动物效率低 2 2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制 3 3、转基因表达水平低、转基因表达水平低51 1 1、制作转基因动物效率低、制作转基因动物效率低 这是制约这项技术广泛应用的关键。以显微注射法生产这是制约这项技术广泛应用的关键。以显微注射法生产转基因动物为例，小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊转基转基因动物为例，小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊

21、转基因阳性率分别为因阳性率分别为26%26%、44%44%、15%15%、0.7%0.7%、0.9%,0.9%0.9%,0.9%。52 2 2、基因在宿主基因组中的行为难以控制、基因在宿主基因组中的行为难以控制转基因随机整合于动物的基因组中，很有可能引起转基因随机整合于动物的基因组中，很有可能引起宿主细胞染色体的宿主细胞染色体的插入突变插入突变，还可造成插入位点的，还可造成插入位点的基因片段的基因片段的丢失丢失及插入位点的基因的位移，同时也及插入位点的基因的位移，同时也可能激活正常情况下处于关闭的基因。其结果导致可能激活正常情况下处于关闭的基因。其结果导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流产

22、、畸形转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流产、畸形等异常现象。等异常现象。53 3 3、转基因表达水平低、转基因表达水平低 许许多多转转基基因因的的表表达达水水平平受受到到宿宿主主染染色色体体上上整整合合位位点点的的影影响响，往往往往出出现现异异位位表表达达，影影响响转转基基因因的的表表达达能能力力，从从而而使使大大部部分分转转基基因因表表达达水水平平较较低低,极极少少部部分分表达水平过高。表达水平过高。54 进进行行功功能能基基因因组组学学的的研研究究，研研究究外外源源基基因因在在动动物物整整体体水水平平的的表达调控规律。表达调控规律。转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究转基因

23、动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。转基因动物的意义55 什么是基因敲除技术？什么是基因敲除技术？什么是基因敲除技术？什么是基因敲除技术？基因敲除（基因敲除（gene knock outgene knock out）是是是是80808080年代初出现的一年代初出现的一年代初出现的一年代初出现的一项新的基因工程技术。采用项新的基因工程技术。采用项新的基因工程技术。采用项新的基因工程技术。采用同源重组同源重组同源

24、重组同源重组的方法的方法的方法的方法,用体用体用体用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因,再应用转基因方法孵育出转基因动物再应用转基因方法孵育出转基因动物再应用转基因方法孵育出转基因动物再应用转基因方法孵育出转基因动物,即为基因敲即为基因敲即为基因敲即为基因敲除动物。除动物。除动物。除动物。56 基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用1 1 1 1、研究基因调控和基因功能；、研究基因调控和基因功能；、研究基因调控和基因功能；、研

25、究基因调控和基因功能；2 2 2 2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；提供材料；提供材料；提供材料；3 3 3 3、改造动物基因型，鉴定新基因和、改造动物基因型，鉴定新基因和、改造动物基因型，鉴定新基因和、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，或其新功能，或其新功能，或其新功能，研究发育生物学；研究发育生物学；研究发育生物学；研究发育生物学；4 4 4 4、治疗遗传病，即基因治疗。、治疗遗传病，即基因治疗。、治疗遗传病，即基因治疗。、治疗遗传病，即

26、基因治疗。5 5 5 5、改造生物、培育新的生物品种。、改造生物、培育新的生物品种。、改造生物、培育新的生物品种。、改造生物、培育新的生物品种。57病毒介导转移法病毒介导转移法病病病病毒毒毒毒介介介介导导导导基基基基因因因因转转转转移移移移(virus(virus mediated mediated gene gene transfer)transfer)是是是是指指指指以以以以病病病病毒毒毒毒为为为为载载载载体体体体，将将将将外外外外源源源源性性性性目目目目的的的的基基基基因因因因通通通通过过过过基基基基因因因因重重重重组组组组技技技技术术术术，组组组组装装装装到到到到病病病病毒毒毒毒载载载

27、载体体体体上上上上，并并并并使使使使重重重重组组组组病病病病毒毒毒毒感感感感染染染染受受受受体体体体宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞，完成基因转移。完成基因转移。完成基因转移。完成基因转移。58逆转录病毒逆转录病毒(retrovirus)J 优点优点能高效转染宿主细胞，转染率可达能高效转染宿主细胞，转染率可达能高效转染宿主细胞，转染率可达能高效转染宿主细胞，转染率可达100100宿主范围广泛宿主范围广泛宿主范围广泛宿主范围广泛可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所载的外源基因都能表达载的外源基因都能表达载的外源基因都能表达载的外源基因都能表达L 缺点缺点病毒容量有限病毒容量有限病毒容量有限病毒容量有限(7 kb)(7 kb)随机插入随机插入随机插入随机插入有致癌作用有致癌作用有致癌作用有致癌作用59