生物芯片技术课件.pptx

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1、第一节第一节 概概 述述 一、生物芯片的概念一、生物芯片的概念二、二、DNA芯片芯片一、基因表达谱研究一、基因表达谱研究一、原位合成一、原位合成DNA芯片制作芯片制作二、二、DNA微阵列芯片制作微阵列芯片制作一、待测样品的准备一、待测样品的准备 二、分子杂交反应二、分子杂交反应三、检测分析三、检测分析第二节第二节 生物芯片的制作生物芯片的制作 第三节第三节 DNADNA芯片使用的基本流程芯片使用的基本流程 第四节第四节 蛋白质芯片蛋白质芯片第五节第五节 生物芯片的基本操作和流程生物芯片的基本操作和流程二、二、DNA测序测序三、基因突变检测三、基因突变检测四、基因诊断四、基因诊断五、蛋白质芯片的

2、应用五、蛋白质芯片的应用六、药物研发六、药物研发目目 录录2023/2/12 22:491 生物芯片生物芯片(biochip)技术是技术是20世纪世纪90年代初期由年代初期由分子生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学分子生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学等多学科交叉融合而发展起来的高新技术等多学科交叉融合而发展起来的高新技术，因既具有因既具有重大的学术价值，又具有明显的产业化前景，被评为重大的学术价值，又具有明显的产业化前景，被评为19981998年度世界十大科技进展之一年度世界十大科技进展之一。生物芯片生物芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有深是继大规模集成电路之后的又一次具有

3、深远意义的科学技术革命。远意义的科学技术革命。生物芯片将生物芯片将会会改变生命科学的研究方式，革新医学改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。极大地提高人口素质和健康水平。第一节第一节 概概 述述 萨萨瑟恩瑟恩提出的提出的核酸核酸杂杂交交理论，即标记的核酸分子能理论，即标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交。够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交。（EdwinMellorSouthern）Southern杂杂交交可以被看作是生物芯片的雏形。可以被看作是生物芯片的雏形。2023/2/12 22:494桑桑格格和和吉吉尔尔伯伯特特发发明明

4、了了现现在在广广泛泛使使用用的的DNA测测序序方方法，并由此在法，并由此在1980年获得了年获得了诺贝诺贝尔尔奖奖。（Frederick Sanger）（Walter Gilbert）生生物物芯芯片片这这个个概概念念首首先先是是由由Fred Sanger和和WalterGilbert提提出出的的；解解决决了了传传统统核核酸酸印印迹迹杂杂交交技技术术复杂、自动化程度低、低通量等不足。复杂、自动化程度低、低通量等不足。2023/2/12 22:495 1989，StephenFodor(斯蒂文斯蒂文弗尔多弗尔多)发明了发明了高密度生物芯片和芯片阅读器，为生物芯片产业开创高密度生物芯片和芯片阅读器，

5、为生物芯片产业开创及发展奠定了良好的基础。及发展奠定了良好的基础。1992，Affymatrix公司公司Fodor小组运用半导体照相小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。这是世界上第一块基因芯片。2023/2/12 22:4961995，Stanford大大学学的的P.Brown实实验验室室发发明明了了第第一一块块以以玻玻璃璃为为载载体体的的基基因因微微矩矩阵阵芯芯片片；将将cDNA密密集集点样在玻璃片上，进行基因表达谱研究和点样在玻璃片上，进行基因表达谱研究和SNP分析。分析。2023/2/1

6、2 22:497一、生物芯片的概念一、生物芯片的概念 指指通通过过微微电电子子和和微微加加工工技技术术，将将大大量量已已知知序序列列的的核核酸酸或或蛋蛋白白片片段段等等，有有序序地地组组合合在在1CM2大大小小固固相相介介质质表表面面而而构构成成的的集集成成分分析析系系统统。可可与与标标记记的的核核酸酸或或蛋蛋白白分分子子特特异异结结合合，实实现现对对核核酸酸、蛋蛋白白等等生生物物组组分分的的快快速、高效、敏感的处理与分析。速、高效、敏感的处理与分析。狭义的生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细狭义的生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。胞芯片和组织芯片等。广义的生物芯片还包括

7、用于研制生物计算机的生广义的生物芯片还包括用于研制生物计算机的生物芯片、将健康细胞与电子集成电路结合起来的仿生物芯片、将健康细胞与电子集成电路结合起来的仿生芯片、缩微化的实验室即芯片实验室。芯片、缩微化的实验室即芯片实验室。2023/2/12 22:498生物芯片的基本原理与特征：生物芯片的基本原理与特征：“芯片芯片”特征：特征：“分子杂交分子杂交”原理：原理：生物分子间的相互特异识别作用（如生物分子间的相互特异识别作用（如:DNA分分子之间、蛋白分子之间、子之间、蛋白分子之间、DNA与蛋白分子之间以与蛋白分子之间以及自组装单分子膜之间等）及自组装单分子膜之间等）高通量、高集成、并行化、微型化

8、、自动化、高通量、高集成、并行化、微型化、自动化、连续化连续化2023/2/12 22:499根据根据芯片的用途可分为两大类芯片的用途可分为两大类2023/2/12 22:4910二、二、DNADNA芯片芯片 又又被被称称为为基基因因芯芯片片 (genechips)、DNA阵阵列列(DNAarray)、cDNA芯芯片片(cDNAchips)、寡寡核核苷苷酸阵列酸阵列(oligonucleotidearray)等。等。DNA芯芯片片是是指指在在固固相相支支持持物物上上原原原原位位位位合合合合成成成成寡寡核核苷苷酸酸或或者者直直接接将将大大量量预预先先合合成成的的DNA探探针针以以显显微微打打印印

9、的方式有序地固化于支持物表面；的方式有序地固化于支持物表面；使使用用时时与与标标记记的的样样品品杂杂交交，通通过过对对杂杂交交信信号号的的检测分析从而得出样品的遗传信息检测分析从而得出样品的遗传信息。2023/2/12 22:49111.1.玻片型玻片型 这种芯片的点阵是通过原位合成技这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，点阵密度很高，所以必须借助于特殊的术制作的，点阵密度很高，所以必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。仪器对测定结果进行解读和分析。2023/2/12 22:4912 有有 此此 类类产产品品研研制制能能力力的的公公司司不不多多,如如Affimetrix公司。公司。（

10、一）从支持物来分主要有：（一）从支持物来分主要有：2.2.薄膜型薄膜型如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。这种类型膜等。这种类型“芯片芯片”的点阵是通过的点阵是通过“点膜点膜”形形式制作的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结式制作的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如合于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如Clone Tech公司）。公司）。2023/2/12 22:4913 3.3.微微板板型型 这这种种芯芯片片实实质质上上是是一一种种具具有有高高密密度度、小小容容量量测测试试孔孔的的小小型型酶酶联联免免疫疫检检测测板板（

11、如如PE公司等）。公司等）。2023/2/12 22:4914 4.4.集集成成电电路路型型 将将杂杂交交技技术术与与微微电电子子技技术术结结合合于于一一体体，通通过过电电子子装装置置检检测测或或控控制制DNA等等生生物物大分子的作用过程（如大分子的作用过程（如Nanogen公司）公司）2023/2/12 22:4915原位合成芯片原位合成芯片DNA微阵列微阵列研发小组研发小组Affymatrix公司公司Fodor研究组研究组斯坦福大学斯坦福大学Brown实验室实验室制作方式制作方式原位化学合成原位化学合成收集探针，显微打印收集探针，显微打印探针类型探针类型寡核苷酸寡核苷酸cDNA、基因片段、

12、寡核苷、基因片段、寡核苷酸、酸、RNA等等探针长度探针长度短，小于短，小于50nt较长，较长，100500nt或更长或更长最高集成度最高集成度1040 万点阵万点阵/cm2110 万点阵万点阵/cm2专利保护专利保护专利控制严格专利控制严格无专利控制无专利控制（二）根据制作方式可分为两大类：（二）根据制作方式可分为两大类：2023/2/12 22:4916原位合成芯片原位合成芯片原位合成芯片原位合成芯片 (syntheticgenechip)(syntheticgenechip)DNADNA微集阵列微集阵列微集阵列微集阵列(DNAmicroarray(DNAmicroarray）基因芯片的基因

13、芯片的基因芯片的基因芯片的制作方式制作方式制作方式制作方式原位合成原位合成原位合成原位合成直接点样直接点样直接点样直接点样 显微光蚀刻技术显微光蚀刻技术(光引导原位合成光引导原位合成)分子印章法分子印章法分子印章法分子印章法针式点样针式点样喷墨点样喷墨点样压电打印法压电打印法2023/2/12 22:4917第二节第二节 生物芯片的制作生物芯片的制作一、原位合成一、原位合成DNADNA芯片的制作芯片的制作(一一)显微光蚀刻技术显微光蚀刻技术1.1.支支支支持持持持物物物物经经化化学学处处理理,表表表表面面面面活活活活性性性性羟羟羟羟基基基基(OH)(OH)连连接接光光敏敏保护基保护基(X),选

14、用选用光刻掩模光刻掩模光刻掩模光刻掩模(M1)(M1)保护非聚合部位；保护非聚合部位；2.用用激激光光点点光光源源照照射射聚聚合合部部位位,去去除除光光敏敏保保护护基基(X),暴露暴露活性羟基活性羟基活性羟基活性羟基(OH)(OH)；3.加加入入单单核核苷苷酸酸(如如dTMP)的的亚亚磷磷酰酰胺胺活活化化端端与与活活活活性性性性羟基羟基羟基羟基(OH)(OH)发发 生化学偶联生化学偶联 ,光敏保护非活化端；光敏保护非活化端；4.更换掩模更换掩模(M2)，激光点光源照射下一个位点；，激光点光源照射下一个位点；5.脱保护，偶联第二个核苷酸脱保护，偶联第二个核苷酸(如如dCMP)；6.重复上述步骤，

15、直至合成完所需探针重复上述步骤，直至合成完所需探针。2023/2/12 22:4918合成过程合成过程光刻掩模光刻掩模光刻掩模光刻掩模1 1光刻掩模光刻掩模光刻掩模光刻掩模2 2(一一)探针的设计与制备探针的设计与制备 DNADNA微微微微集集集集阵阵阵阵列列列列探探探探针针针针可可可可用用用用人人人人工工工工合合合合成成成成寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸、基基基基因因因因组组组组DNADNA或或或或cDNAcDNA中中中中的的的的目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段段段段；可可可可为为为为双双双双链链链链DNADNA、单链、单链、单链、单链DNADNA或或或或 RNARNA，亦可用肽

16、核酸，亦可用肽核酸，亦可用肽核酸，亦可用肽核酸(PNA)(PNA)等。等。等。等。二二.DNA.DNA微集阵列芯片的制作微集阵列芯片的制作肽核酸肽核酸肽核酸肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)是是一一类类以以氨氨基基酸酸替替代代糖糖-磷磷酸酸主主链链的的DNA类类似似物物，骨骨架架由由重重复复的的N-甘甘氨氨酸酸通通过过酰酰胺胺键键相相连连构构成成，碱碱基基则则通过甲叉碳酰基与骨架相连。通过甲叉碳酰基与骨架相连。PNA分分子子内内不不会会形形成成二二级级、三三级级结结构构；DNA与与PNA杂交不需要盐离子。杂交不需要盐离子。2023/2/12 22:4920探针制备：探针

17、制备：探针制备：探针制备：常规分子生物学技术常规分子生物学技术常规分子生物学技术常规分子生物学技术(如基因克隆、如基因克隆、如基因克隆、如基因克隆、PCRPCR、RT-RT-PCRPCR、化学合成等、化学合成等、化学合成等、化学合成等)。探针的纯化：探针的纯化：探针的纯化：探针的纯化：探针的选择：探针的选择：cDNAcDNA探针用于基因表达谱分析；寡核苷酸探针用探针用于基因表达谱分析；寡核苷酸探针用探针用于基因表达谱分析；寡核苷酸探针用探针用于基因表达谱分析；寡核苷酸探针用于基因突变检测。于基因突变检测。于基因突变检测。于基因突变检测。阳性对照阳性对照阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照阴性对照阴

18、性对照空白空白空白空白 对照对照对照对照 脱盐、除酶及去除过剩的脱盐、除酶及去除过剩的脱盐、除酶及去除过剩的脱盐、除酶及去除过剩的DNADNA等。等。等。等。DNADNA芯片探针芯片探针芯片探针芯片探针实验组探针实验组探针实验组探针实验组探针对照组探针对照组探针对照组探针对照组探针2023/2/12 22:4921固相支持物固相支持物固相支持物固相支持物分为实性材料和膜性材料两类：分为实性材料和膜性材料两类：最常用的玻片预处理方法：最常用的玻片预处理方法：实性材料有硅芯片、玻片和瓷片等；膜性材料有实性材料有硅芯片、玻片和瓷片等；膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜和硝酸纤维膜。聚丙烯膜、尼龙膜和硝酸纤维

19、膜。(二二)支持物的类型与预处理支持物的类型与预处理2023/2/12 22:4922 采用多聚赖氨酸包被，氨基硅烷化，醛基化等方采用多聚赖氨酸包被，氨基硅烷化，醛基化等方法，使其表面衍生出氨基或醛基法，使其表面衍生出氨基或醛基 。1.喷墨打印喷墨打印 将将合合成成用用探探针针溶溶液液放放入入打打印印墨墨盒盒内内，由由电电脑脑依依据据预预定定的的程程序序在在 xyz方方向向自自动动控控制制打打印印喷喷头头在在芯芯片片支支持持物上移动，并将特定的探针试剂喷印到特定位点。物上移动，并将特定的探针试剂喷印到特定位点。喷喷印印上上去去的的试试剂剂即即以以固固相相合合成成原原理理与与该该处处支支持持物物

20、发发生偶联反应。生偶联反应。(三三)探针的打印探针的打印2023/2/12 22:49231)1)玻玻璃璃片片基基的的处处理理：使使玻玻璃璃表表面面获获得得羟羟基基、醛醛基基、氨氨基等活性基团；基等活性基团；优点：优点：成本低，操作简单，密度高成本低，操作简单，密度高(几十万点几十万点 cm2)，转移过程中探针溶液损失小。转移过程中探针溶液损失小。2.2.针式打印针式打印缺点：缺点：定量准确性、重现性不好。定量准确性、重现性不好。2)2)点样针沾取探针溶液；点样针沾取探针溶液；3)3)点点样样针针把把探探针针点点到到玻玻片片表表面面，让让探探针针末末端端的的化化学学集集团与玻片表面的集团形成共

21、价键。团与玻片表面的集团形成共价键。2023/2/12 22:492422022202芯片点样仪芯片点样仪生生 产产 商：商：Bio-Rad；性能介绍：分辨率：性能介绍：分辨率：1.25um(x，y轴轴)和和0.25um(Z轴轴)。重复性：重复性：3um；球面精确性：球面精确性：l0um。一次制成芯片数：一次制成芯片数：126块芯片，每块玻片点样量块芯片，每块玻片点样量82,000个点。个点。2023/2/12 22:4925 氨基修饰的玻片，氨基修饰的玻片，可以一定能量的紫外线进行照可以一定能量的紫外线进行照射，使射，使 DNA探针中的胸腺嘧啶残基，与支持物上带探针中的胸腺嘧啶残基，与支持物

22、上带正电的氨基形成共价键而固定在玻片表面；正电的氨基形成共价键而固定在玻片表面；醛基修饰的玻片，醛基修饰的玻片，可使氨基末端修饰探针的氨基，可使氨基末端修饰探针的氨基，与玻片上的醛基形成与玻片上的醛基形成 Schiff碱，使碱，使DNA探针固定在探针固定在玻片表面。玻片表面。(四四)探针的固化探针的固化2023/2/12 22:4926 一、待测样品的制备一、待测样品的制备 用用用用PCRPCR或反转录法标记时，可用荧光标记底物或反转录法标记时，可用荧光标记底物或反转录法标记时，可用荧光标记底物或反转录法标记时，可用荧光标记底物(dNTP)(dNTP)，也可标记引物的也可标记引物的也可标记引物

23、的也可标记引物的55末端。末端。末端。末端。第三节第三节 DNADNA芯片使用的基本流程芯片使用的基本流程 双色荧光标记：双色荧光标记：双色荧光标记：双色荧光标记：待测样品用待测样品用待测样品用待测样品用Cy3Cy3；对照用对照用对照用对照用Cy5Cy5。常用于标记的荧光分子有：常用于标记的荧光分子有：常用于标记的荧光分子有：常用于标记的荧光分子有：Cy3Cy3、Cy5Cy5、FITCFITC、TRITCTRITC 和生物素等。和生物素等。和生物素等。和生物素等。组织细胞或组织细胞或组织细胞或组织细胞或其他材料其他材料其他材料其他材料 提取提取提取提取 核酸核酸核酸核酸 纯化纯化纯化纯化纯核酸

24、纯核酸纯核酸纯核酸 核酸核酸核酸核酸纯化纯化纯化纯化随机引物延随机引物延随机引物延随机引物延伸、伸、伸、伸、PCR PCR 或或或或反转录标记反转录标记反转录标记反转录标记2023/2/12 22:4927类型：固类型：固类型：固类型：固-液相杂交液相杂交液相杂交液相杂交(固相：探针；液相：靶核酸固相：探针；液相：靶核酸固相：探针；液相：靶核酸固相：探针；液相：靶核酸)。特点：探针的数量特点：探针的数量特点：探针的数量特点：探针的数量 靶基因的数量靶基因的数量靶基因的数量靶基因的数量 反应动力学：呈线性关系反应动力学：呈线性关系反应动力学：呈线性关系反应动力学：呈线性关系信号强度信号强度信号强

25、度信号强度 (样品样品样品样品)靶基因的量靶基因的量靶基因的量靶基因的量 空间位阻效应：探针空间位阻效应：探针空间位阻效应：探针空间位阻效应：探针 靶分子；探针靶分子；探针靶分子；探针靶分子；探针 探针探针探针探针2.2.2.2.杂交反应条件优化杂交反应条件优化杂交反应条件优化杂交反应条件优化PNAPNA分子内无带负电荷的磷酸基团。分子内无带负电荷的磷酸基团。分子内无带负电荷的磷酸基团。分子内无带负电荷的磷酸基团。1.1.1.1.芯片杂交的特点：芯片杂交的特点：芯片杂交的特点：芯片杂交的特点：3.Nnogen3.Nnogen3.Nnogen3.Nnogen公司研制出的电子基因芯片。公司研制出的

26、电子基因芯片。公司研制出的电子基因芯片。公司研制出的电子基因芯片。二、分子杂交反应二、分子杂交反应2023/2/12 22:4928检测芯片荧光信号有两类仪器：检测芯片荧光信号有两类仪器：检测芯片荧光信号有两类仪器：检测芯片荧光信号有两类仪器：1 1、利用电荷偶合装置检测的摄像仪；、利用电荷偶合装置检测的摄像仪；、利用电荷偶合装置检测的摄像仪；、利用电荷偶合装置检测的摄像仪；2 2、激光共聚焦扫描仪。、激光共聚焦扫描仪。、激光共聚焦扫描仪。、激光共聚焦扫描仪。所谓激光共聚焦，是指激发光路和发射光路分所谓激光共聚焦，是指激发光路和发射光路分所谓激光共聚焦，是指激发光路和发射光路分所谓激光共聚焦，

27、是指激发光路和发射光路分别在两个位置上聚焦。别在两个位置上聚焦。别在两个位置上聚焦。别在两个位置上聚焦。应注意如何有效防止来自杂质的荧光信号，提应注意如何有效防止来自杂质的荧光信号，提应注意如何有效防止来自杂质的荧光信号，提应注意如何有效防止来自杂质的荧光信号，提高信高信高信高信/噪比。噪比。噪比。噪比。三、检测分析三、检测分析2023/2/12 22:4929(入射入射)激光束激光束发射光发射光滤镜滤镜检测透镜检测透镜检测器检测器共聚焦共聚焦针孔针孔荧光束荧光束光束分离器光束分离器(分光镜分光镜)物镜物镜支持物支持物由样品发射的荧光由样品发射的荧光图图14-4 14-4 共聚焦扫描示意图共聚

28、焦扫描示意图反反光镜光镜样品样品放大器放大器数模转数模转换器换器计算机计算机2023/2/12 22:49302023/2/12 22:4931基因芯片技术基因芯片技术 基因芯片技术主要基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分应和信号检测以及结果分析析(图图13-4)13-4)。基基因因芯芯片片技技术术主主要要步步骤骤2023/2/12 22:4932将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，加加入入待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可

29、捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白白进进行行定定性性和和定定量量分分析析的一种技术。的一种技术。基本原理：基本原理：蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。能特异性的相互识别和相互结合。又称蛋白质阵列又称蛋白质阵列又称蛋白质阵列又称蛋白质阵列 (protein array)(protein array)(protein array)(protein array)2023/2/12 22:4933第四节第四节 蛋白质芯片蛋白质芯片 最常用的探针：最常用的探针：抗体抗体 检测方法：检测方法：标记检测

30、法、直接检测法标记检测法、直接检测法4.4.不同的不同的不同的不同的McAbMcAb可通过机械点涂方式固定在膜性载可通过机械点涂方式固定在膜性载可通过机械点涂方式固定在膜性载可通过机械点涂方式固定在膜性载 体表面体表面体表面体表面.一、芯片的制作一、芯片的制作1.1.作为探针的多肽作为探针的多肽作为探针的多肽作为探针的多肽(或蛋白质或蛋白质或蛋白质或蛋白质)，可原位合成，也可，可原位合成，也可，可原位合成，也可，可原位合成，也可 先合成后固化。先合成后固化。先合成后固化。先合成后固化。2.2.蛋白质芯片的载体常选择膜性材料，如蛋白质芯片的载体常选择膜性材料，如 尼龙膜、尼龙膜、NC膜、聚偏氟乙

31、烯膜等。膜、聚偏氟乙烯膜等。3.3.蛋白质芯片的载体的处理方法与核酸蛋白质芯片的载体的处理方法与核酸 芯片载体芯片载体 相似。相似。2023/2/12 22:49341.待检测样品抗原从体液、组织细胞待检测样品抗原从体液、组织细胞,或从或从cDNA表表 达文库中提取多肽和蛋白质。达文库中提取多肽和蛋白质。2.若作蛋白质组学研究，应同时制备正常与病变组若作蛋白质组学研究，应同时制备正常与病变组织的蛋白质样品。织的蛋白质样品。3.蛋白质样品的标记：采用荧光素蛋白质样品的标记：采用荧光素(Cy3、Cy5)、放、放射性同位素等，也可用酶标法标记。射性同位素等，也可用酶标法标记。二、样品的制备二、样品的

32、制备2023/2/12 22:49351.1.标记的多肽样品与探针之间的反应有：标记的多肽样品与探针之间的反应有：标记的多肽样品与探针之间的反应有：标记的多肽样品与探针之间的反应有：用激光扫描仪、磷光成像仪、质谱仪、酶标仪用激光扫描仪、磷光成像仪、质谱仪、酶标仪用激光扫描仪、磷光成像仪、质谱仪、酶标仪用激光扫描仪、磷光成像仪、质谱仪、酶标仪等检测后等检测后等检测后等检测后,再用相应的软件对获得的信号分析。再用相应的软件对获得的信号分析。再用相应的软件对获得的信号分析。再用相应的软件对获得的信号分析。三、生化反应三、生化反应Ag+Ab H +R Ag-Ab H-R 2.2.反应结束后即行洗脱。反

33、应结束后即行洗脱。反应结束后即行洗脱。反应结束后即行洗脱。等等。等等。四、检测分析四、检测分析2023/2/12 22:4936第五节第五节 生物芯片在生物医学中的应用生物芯片在生物医学中的应用一、基因差异表达谱分析一、基因差异表达谱分析2023/2/12 22:4937二、二、DNADNA测序测序三、基因突变的检测三、基因突变的检测四、基因诊断四、基因诊断五、药物研究开发五、药物研究开发六、蛋白质芯片的应用六、蛋白质芯片的应用一、一、DNADNA芯片与基因差异表达谱分析芯片与基因差异表达谱分析2023/2/12 22:4938(一一)探针的设计与芯片的制作探针的设计与芯片的制作(二二)待测样

34、品核酸的提取、扩增与标记待测样品核酸的提取、扩增与标记(三三)杂交反应与杂交后清洗杂交反应与杂交后清洗(四四)扫描与分析扫描与分析(五五)结果与讨论结果与讨论cDNA2023/2/12 22:4939(一一)探针的设计与芯片的制作探针的设计与芯片的制作 1.1.探针的设计探针的设计-寡核苷酸探针设计原则寡核苷酸探针设计原则(1)(1)(1)(1)完全互补性：完全互补性：完全互补性：完全互补性：对目的基因或相关序列对目的基因或相关序列对目的基因或相关序列对目的基因或相关序列 的保守区而言，的保守区而言，的保守区而言，的保守区而言，PMPM 探针。探针。探针。探针。(3)(3)(3)(3)探针的丰

35、度：探针的丰度：探针的丰度：探针的丰度：针对靶基因序列设计多个针对靶基因序列设计多个针对靶基因序列设计多个针对靶基因序列设计多个(3(3个以上个以上个以上个以上)寡核苷寡核苷寡核苷寡核苷 酸探针。酸探针。酸探针。酸探针。(2)(2)(2)(2)高度特异性：高度特异性：高度特异性：高度特异性：对基因家族的某个成员或对不同对基因家族的某个成员或对不同对基因家族的某个成员或对不同对基因家族的某个成员或对不同 生物生物生物生物 种属种属种属种属 的同一基因而言。的同一基因而言。的同一基因而言。的同一基因而言。(4)(4)(4)(4)单碱基错配：单碱基错配：单碱基错配：单碱基错配：即设计即设计即设计即设

36、计MM(mis-match)MM(mis-match)探针：作内参照探针：作内参照探针：作内参照探针：作内参照(衡衡衡衡 量探针的特异性量探针的特异性量探针的特异性量探针的特异性)。(5)(5)(5)(5)设阳性对照：设阳性对照：设阳性对照：设阳性对照：采用看家基因采用看家基因采用看家基因采用看家基因-actin-actin或或或或GADPHGADPH基因作为阳基因作为阳基因作为阳基因作为阳 性对照。性对照。性对照。性对照。2023/2/12 22:4940离心离心2.2.探针的制备探针的制备(细菌培养平板细菌培养平板细菌培养平板细菌培养平板)cDNAcDNA文库文库文库文库 挑取挑取挑取挑取

37、 cDNAcDNA克隆克隆克隆克隆 扩增培养扩增培养扩增培养扩增培养(液体培养液体培养液体培养液体培养)PCRPCR扩增扩增扩增扩增扩增产物电泳扩增产物电泳扩增产物电泳扩增产物电泳(鉴定含靶序列的克隆鉴定含靶序列的克隆鉴定含靶序列的克隆鉴定含靶序列的克隆)相应的相应的相应的相应的 PCRPCR产物产物产物产物 +异丙醇异丙醇异丙醇异丙醇打印打印打印打印加加加加 DMSODMSO溶解溶解溶解溶解 挥干乙醇挥干乙醇挥干乙醇挥干乙醇7070乙醇洗涤乙醇洗涤乙醇洗涤乙醇洗涤取沉淀取沉淀取沉淀取沉淀2023/2/12 22:4941(1)(1)(1)(1)玻片的清洗玻片的清洗玻片的清洗玻片的清洗 4.4

38、.探针的打印与固化探针的打印与固化3.3.玻片的多聚玻片的多聚-L-L-赖氨酸预处理赖氨酸预处理(1)(1)编辑打印程序、探针打印编辑打印程序、探针打印(2)(2)紫外线照射紫外线照射(使探针与玻片交联结合使探针与玻片交联结合)(3)(3)80烘干固定、室温避光保存烘干固定、室温避光保存(2)(2)(2)(2)用多聚用多聚用多聚用多聚-L-L-L-L-赖氨酸处理玻片赖氨酸处理玻片赖氨酸处理玻片赖氨酸处理玻片NaOH乙醇浸泡振荡至少乙醇浸泡振荡至少2hr；双蒸水反复漂洗。；双蒸水反复漂洗。多聚多聚多聚多聚-L-L-赖氨酸赖氨酸赖氨酸赖氨酸溶液浸泡振荡溶液浸泡振荡15 min1 hr；双；双蒸水反

39、复漂洗；离心、蒸水反复漂洗；离心、45干燥。干燥。2023/2/12 22:4942反转录荧光标记：反转录荧光标记：反转录荧光标记：反转录荧光标记：组织或细胞组织或细胞组织或细胞组织或细胞 抽提抽提抽提抽提 总总总总RNARNA分离分离分离分离 mRNA mRNA AAAAAA 3 AAAAAA 3 oligo dToligo dT引物引物引物引物 dNTP,RT-ase dNTP,RT-ase 荧光标记荧光标记荧光标记荧光标记 dCTPdCTP或或或或 SS-cDNASS-cDNATTTTTT 5 TTTTTT 5 (二二)待测样品核酸的提取、扩增与标记待测样品核酸的提取、扩增与标记2023

40、/2/12 22:4943(Cy3Cy3为红色为红色为红色为红色,标记处理组标记处理组标记处理组标记处理组；Cy5Cy5为绿色为绿色为绿色为绿色,标记对照组标记对照组标记对照组标记对照组)后续步骤：后续步骤：1.1.终止反应降解模板终止反应降解模板终止反应降解模板终止反应降解模板(总总总总RNARNA或或或或mRNA)mRNA)；2.2.过柱滤去游离的荧光核苷酸；过柱滤去游离的荧光核苷酸；过柱滤去游离的荧光核苷酸；过柱滤去游离的荧光核苷酸；3.3.洗脱、浓缩洗脱、浓缩洗脱、浓缩洗脱、浓缩 、真空干燥获取纯化的核酸样品；、真空干燥获取纯化的核酸样品；、真空干燥获取纯化的核酸样品；、真空干燥获取纯

41、化的核酸样品；4.4.溶解溶解溶解溶解 (DEPC(DEPC处理的水处理的水处理的水处理的水)成样品液成样品液成样品液成样品液2023/2/12 22:4944注意事项：注意事项：若若若若用用用用Cy3-dCTPCy3-dCTP或或或或Cy5-dCTPCy5-dCTP(分分分分别别别别标标标标记记记记2 2种种种种样样样样品品品品)，则应相应则应相应则应相应则应相应调整调整调整调整其余其余其余其余3 3种种种种dNTPdNTP的浓度。的浓度。的浓度。的浓度。对对对对同同同同一一一一种种种种dNTPdNTP，既既既既要要要要加加加加入入入入荧荧荧荧光光光光标标标标记记记记的的的的，也也也也要要要

42、要加加加加入入入入非非非非标标标标记记记记的的的的(如如如如 Cy3-dCTPCy3-dCTP与与与与 dCTPdCTP)，并并并并调调调调整整整整两两两两者者者者的比例，使杂交信号最强。的比例，使杂交信号最强。的比例，使杂交信号最强。的比例，使杂交信号最强。不不不不同同同同来来来来源源源源的的的的样样样样品品品品分分分分别别别别用用用用不不不不同同同同颜颜颜颜色色色色的的的的荧荧荧荧光光光光素素素素标标标标记记记记 (Cy3Cy3为为为为红红红红色色色色,标标标标记记记记处处处处理理理理组组组组；Cy5Cy5为为为为绿绿绿绿色色色色,标标标标记记记记对对对对照照照照组组组组)，以便比较分析；

43、，以便比较分析；，以便比较分析；，以便比较分析；2023/2/12 22:4945 芯片杂交与常规分子杂交相似，但探针不标记，芯片杂交与常规分子杂交相似，但探针不标记，芯片杂交与常规分子杂交相似，但探针不标记，芯片杂交与常规分子杂交相似，但探针不标记，而待测核酸而待测核酸而待测核酸而待测核酸(液相液相液相液相)标记。标记。标记。标记。分析过程：分析过程：分析过程：分析过程：预杂交预杂交预杂交预杂交 杂交杂交杂交杂交 洗涤洗涤洗涤洗涤 干燥干燥干燥干燥 检测检测检测检测(扫描与分析扫描与分析扫描与分析扫描与分析)影响因素：影响因素：影响因素：影响因素：探针碱基组成及其浓度探针碱基组成及其浓度探针

44、碱基组成及其浓度探针碱基组成及其浓度靶核酸长度、碱基组成及其浓度靶核酸长度、碱基组成及其浓度靶核酸长度、碱基组成及其浓度靶核酸长度、碱基组成及其浓度温度温度温度温度杂交液的组成杂交液的组成杂交液的组成杂交液的组成条件设置：条件设置：条件设置：条件设置：高离子强度、高样品浓度、长时间、高离子强度、高样品浓度、长时间、高离子强度、高样品浓度、长时间、高离子强度、高样品浓度、长时间、低温度低温度低温度低温度(杂交杂交杂交杂交)(三三)杂交反应与杂交后清洗杂交反应与杂交后清洗2023/2/12 22:49461.1.图像分析图像分析 将扫描得到的将扫描得到的将扫描得到的将扫描得到的 Cy3/Cy5Cy

45、3/Cy5文件通过划格，确定阳文件通过划格，确定阳文件通过划格，确定阳文件通过划格，确定阳性杂交点及其背景，过滤性杂交点及其背景，过滤性杂交点及其背景，过滤性杂交点及其背景，过滤(减去减去减去减去)背景，得到基因表达背景，得到基因表达背景，得到基因表达背景，得到基因表达的荧光信号强度的荧光信号强度的荧光信号强度的荧光信号强度(值值值值)。通常用通常用通常用通常用 Cy3/Cy5Cy3/Cy5荧光强度的比值来鉴别差异表荧光强度的比值来鉴别差异表荧光强度的比值来鉴别差异表荧光强度的比值来鉴别差异表达基因达基因达基因达基因(多用平均值表示多用平均值表示多用平均值表示多用平均值表示)。(四四)扫描与分

46、析扫描与分析2023/2/12 22:4947(1)(1)(1)(1)标准化处理标准化处理标准化处理标准化处理 将某些看家基因将某些看家基因将某些看家基因将某些看家基因Cy3/Cy5Cy3/Cy5荧光强度平均比值调荧光强度平均比值调荧光强度平均比值调荧光强度平均比值调节为节为节为节为 11。(2)(2)(2)(2)比值分析比值分析比值分析比值分析 一般认为，一般认为，一般认为，一般认为，Cy3/Cy5Cy3/Cy5在在在在0.5-2.00.5-2.0范围内不存在显范围内不存在显范围内不存在显范围内不存在显著的差异表达基因；若超出此范围，则存在差异表著的差异表达基因；若超出此范围，则存在差异表著

47、的差异表达基因；若超出此范围，则存在差异表著的差异表达基因；若超出此范围，则存在差异表达基因。达基因。达基因。达基因。2.2.数据的标准化处理与分析数据的标准化处理与分析2023/2/12 22:4948(1)cDNA(1)cDNA探针的质量控制探针的质量控制PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定：应显示产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定：应显示单一清晰条带。单一清晰条带。(2)(2)总总RNARNA的提取与鉴定的提取与鉴定1)1)1)1)电泳鉴定电泳鉴定电泳鉴定电泳鉴定：应显：应显：应显：应显2 2条带条带条带条带(18SrRNA(18SrRNA及及及及28SrRNA)28SrRNA)；2)2)2)2)紫外吸

48、收值测定紫外吸收值测定紫外吸收值测定紫外吸收值测定：A260/A280A260/A280均应在均应在均应在均应在1.9-2.01.9-2.0之间。之间。之间。之间。3.3.结果与讨论结果与讨论2023/2/12 22:4949(3)(3)杂交结果的扫描与分析杂交结果的扫描与分析对照组对照组对照组对照组(以以以以绿绿色色色色Cy5Cy5标记标记标记标记)，见图，见图，见图，见图14-614-6中的中的中的中的(1)(1)所示所示所示所示每每个个探探针针3个个点点的的阳阳性性杂杂交交信信号号均均一一性性及及3次次实实验的重复性均较好。验的重复性均较好。空空空空白白白白与与与与阴阴阴阴性性性性对对对

49、对照照照照均均无无信信号号或或很很弱弱,图图(1)和和图图(2)中倒中倒1行第行第13-18个点及第个点及第7-12个点个点图图(1)和和图图(2)中中倒倒1行行第第1-6个个荧荧光光点点分分别别代代表表阳阳阳阳性性性性 参参参参 照照照照 GAPDH的的 Cy3和和 Cy5信信 号号 强强 度度，且且Cy3/Cy5=1.0处理组处理组处理组处理组(以以红红红红色色Cy3Cy3标记标记标记标记)，见图，见图14-6中的中的(2)所示所示 表明：探针是特异的，结果是可靠的。表明：探针是特异的，结果是可靠的。2023/2/12 22:4950BiologicalBiologicalSampleSa

50、mpleFunctionalFunctionalInformationInformation红色表示上调；红色表示上调；黄色表示不变；黄色表示不变；绿色表示下调绿色表示下调(4)(4)图像重叠分析图像重叠分析2023/2/12 22:4951红色红色红色红色Cy3Cy3标记处理组，标记处理组，标记处理组，标记处理组，绿色绿色绿色绿色Cy5Cy5标记对照组标记对照组标记对照组标记对照组用基因芯片检测基因表达谱的过程用基因芯片检测基因表达谱的过程2023/2/12 22:4952u 小结小结 只能对已知序列作重测序只能对已知序列作重测序只能对已知序列作重测序只能对已知序列作重测序 (reseque