细胞凋亡及机制检测.pptx
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1、危难中的细胞啊,你沉稳不乱,DNA片片切割,化云梯直通天堂;细胞体分团相聚,把生命的凝重浓集在小体上;分别了朝夕相处的伙伴,再见了快乐美好的时光;这一切的一切又融入临近的胞体,腾出的空间再写生命的篇章。第1页/共71页第2页/共71页第3页/共71页典型的凋亡小体(apoposis boby):由透亮空泡和不由透亮空泡和不透光的浓密的核碎片两部透光的浓密的核碎片两部分组成。分组成。第4页/共71页第5页/共71页第6页/共71页 坏死坏死 凋亡凋亡1.性质性质病理性病理性,非特异性非特异性生理性或病理性,特异性生理性或病理性,特异性2.诱导因素诱导因素 强烈病理性刺激强烈病理性刺激,随机发生随
2、机发生生理性或较弱病理性刺激,非随机发生理性或较弱病理性刺激,非随机发生生3.生化特点生化特点 被动过程被动过程,无新蛋白合成无新蛋白合成,不不耗能耗能耗能的主动过程,有新蛋白合成耗能的主动过程,有新蛋白合成4.形态变化形态变化 细胞结构全面溶解、破坏、细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩,核胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩,核固缩固缩,膜可发泡成芽膜可发泡成芽,形成凋亡小体形成凋亡小体5.DNA电泳电泳弥散性降解,电泳呈均一弥散性降解,电泳呈均一DNA片状片状DNA片段化(片段化(180-120bp),电泳呈电泳呈“梯梯”状条带状条带6.炎症反应炎症反应 溶酶体破
3、裂,局部炎症反应溶酶体破裂,局部炎症反应 溶酶体相对完整,局部无炎症反应溶酶体相对完整,局部无炎症反应7.凋亡小体凋亡小体无无有有8.基因调控基因调控无无有有细胞凋亡与坏死的比较第7页/共71页2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿,因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖。Sydney BrennerH.Robert HorvitzJohn E.Sulston 第8页/共71页细胞凋亡与疾病发生机制的新认识新认识1.该“死”的细胞(如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞)未死,是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制之一。细胞凋亡不足2.不该“死”的细
4、胞(如神经元、心肌细胞)死了,这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等发病有关。细胞凋亡过度第9页/共71页胸腺细胞正常凋亡第10页/共71页胸腺细胞正常凋亡第11页/共71页细胞凋亡的过程细胞凋亡的过程1.凋亡信号转导2.凋亡基因激活3.细胞凋亡的执行4.凋亡细胞的清除第12页/共71页凋亡过程及分期诱导期 执行期 消亡期 凋亡诱导因素受体cAMPCa2+神经酰胺死亡信号凋亡相关基因激活Dnase激活Capases激活巨噬细胞吞噬细胞凋亡细胞第13页/共71页细胞凋亡的生化改变细胞凋亡的生化改变1.DNA的片段化“梯”状条带2.内源性核酸内切酶激活及其作用3.凋亡蛋白酶(caspases)的激
5、活 及其作用第14页/共71页1.DNA的片段化“梯”状条带为细胞凋亡主要特征几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂 解,导致DNA 的断裂;DNA降解过程的特异性:不伴有组蛋 白和其它核蛋白的降解;染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞 和形态改变的基础;DNA fragmentation是凋亡的“golden marker”。第15页/共71页第16页/共71页2.2.内源性核酸内切酶激活及其作用内源性核酸内切酶激活及其作用由一系列胞内信号转导环节激活,由一系列胞内信号转导环节激活,执行染色质执行染色质DNADNA切割切割第17页/共71页3.Caspase 9 激活,需要通过CARD(caspase
6、-recruitment domain)、Apaf-1、细胞色素c、ATP等多个因子的参与Caspases在凋亡中的主要作用1.灭活细胞凋亡的抑制物(如细胞凋亡的抑制物(如Bcl-2Bcl-2););2.2.水解水解细胞的蛋白质结构,细胞的蛋白质结构,导致细胞解体,形成导致细胞解体,形成凋亡小体(apoposis boby);3.在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白,使该蛋白获得或丧失某种生物学功能第18页/共71页细胞凋亡的调控细胞凋亡的调控(一)细胞凋亡相关因素1.诱导性因素2.抑制性因素(二)细胞凋亡信号的转导第19页/共71页1.细胞凋亡的诱导因素.生理活性因子:TNF家族(Fas-L,T
7、NF)、TGF、神经递质(谷氨酸、多巴胺)、生长 因子撤退、GC等.损伤相关因子:热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等.化疗药物.毒素:乙醇、-淀粉样肽第20页/共71页2.细胞凋亡的抑制因素.凋亡相关基因的抑制作用:p53、bcl-2、bcl-XL等。.生理性抑制剂:生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等.病毒基因:腺病毒E1B、杆状病毒p35、棒状病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等.药物:Calpain抑制剂、caspases抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等第21页/共71页(二)细胞凋亡信号的转导凋亡信号转导系统特点凋亡信号转导系统特点 多样性
8、:不同种类的细胞系统不同多样性:不同种类的细胞系统不同 偶联性:与增殖分化的信号系统交叉偶联偶联性:与增殖分化的信号系统交叉偶联 同一性:多因素,共用同一系统触发同一性:多因素,共用同一系统触发 多途性:同一诱导因素启动多条信号转导途径多途性:同一诱导因素启动多条信号转导途径第22页/共71页细胞凋亡信号的转导细胞凋亡信号的转导诱导信号cellR神经酰胺多途径RSAPK/JNKP53 基因NF-kB,JNK/AP-1途径激活bax or 下调bcl-2ROSmtDNA第23页/共71页细胞凋亡相关基因细胞凋亡相关基因抑制凋亡基因:抑制凋亡基因:bcl-2bcl-2促进凋亡基因:促进凋亡基因:f
9、asfas,P53P53双向调控基因:双向调控基因:c-mycc-myc,bclxbclx研究较多的有c-myc、bcl-2、p53、Ice、Fas/APO-1等。第24页/共71页1.c-mycc-myc诱导细胞增殖,也能诱导细胞凋亡。当生长因子存在,bcl-2基因表达时,促进细胞增殖,反之细胞凋亡。第25页/共71页第一个被确认有抑制凋亡作用的基因,存在于线粒体外膜、核膜及部分内质网中。bcl-2相当于线虫的ced9。Bcl-2家族可分为两类,一类是抗凋亡的,如:Bcl-2;一类是促进凋亡的,如:Bax、Bad、Bid,以二聚体形体发挥作用。2.bcl-2第26页/共71页Bcl-2Bcl
10、-2抗凋亡机制抗凋亡机制直接的抗氧化直接的抗氧化抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制促凋亡的抑制促凋亡的BaxBax,BakBak细胞毒作用细胞毒作用抑制抑制CaspasesCaspases激活激活维持细胞钙稳态维持细胞钙稳态第27页/共71页3.fas fas又称作APO-1或CD95,属TNF受体和NGF受体家族。对细胞凋亡有促进作用基因产物为45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统,二者的结合导致靶细胞走向凋亡。第28页/共71页与线虫ced-3同源,又称为Caspase。ICE是一种半胱氨酸蛋白酶,在人类,ICE家族至少有11个成员,每一成员均含
11、有与底物结合及催化的保守序列,识别位点在Asp之后,故又称Caspases。启动子Caspases:Caspases8、9和10 效应子Caspases:Caspases3、6、74.ICE蛋白酶家族第29页/共71页5.Apaf-1与线虫的ced-4同源;在线粒体参与的凋亡途径中发挥作用;能激活Caspase3,这一过程需要细胞色素c和Caspase9的参与。第30页/共71页6.p53 磷酸化p53使细胞处于G1期,必要时诱导细胞凋亡。p21 CDK RB不被磷酸化 G1DNA损伤 p53 并磷酸化 Bax ,Bcl apoptosis Gadd45 DNA修复野生型P53基因具有诱导细胞
12、凋亡的功能“分子警察”;第31页/共71页细胞凋亡发生机制细胞凋亡发生机制(一)氧化损伤(二)钙稳态失衡 (三)线粒体损伤第32页/共71页(一)氧化损伤机制氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡,造成生物大分子的氧化损伤,干扰正常的生命活动,形成严重的氧化应激状态后果:诱导细胞凋亡。第33页/共71页氧化应激引起细胞凋亡的可能机制1.氧自由基引起的DNA损伤可激活P53基因引起细胞凋亡。2.氧自由基引起的DNA损伤可活化多聚ADP核糖合成酶,引起NAD快速耗竭,ATP大量消耗,引发细胞凋亡。3.氧自由在攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸,通过脂质过氧化作用直接造成细胞膜的损伤可诱导细胞凋亡;此
13、外细胞膜上不饱和脂肪酸(如:花生四烯酸)的氧化产物过氧羟基24碳四烯酸有很强的诱发细胞凋亡的作用。第34页/共71页氧化应激引起细胞凋亡的可能机制(续)4.氧化应激可激活Ca2+/Mg2+依赖的DNase,也可产生膜的发泡现象。5.氧化应激引起细胞膜结构的破坏,可改变细胞膜的通透性使Ca2+内流增加,诱导细胞凋亡。自由基对线粒体膜的损害导致其通透性和膜电位的变化也可诱导细胞凋亡。6.氧化应激可活化核转录因子NF-B、AP-1,可加速细胞凋亡相关的一些基因的表达,诱发细胞凋亡。第35页/共71页(二)钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase),降解D
14、NA链;2.激活谷氨酰胺转移酶,催化细胞内肽链间的酰基转移,在肽链间形成共价键,使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联,有利于凋亡小体形成;3.激活核转录因子,加速细胞凋亡相关基因的转录;4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展,暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点,有利于DNA内切酶切割DNA。第36页/共71页(三)线粒体损伤第37页/共71页第38页/共71页细胞凋亡的恶性网络假说细胞凋亡的恶性网络假说线粒体 m PTP开放 Apaf+Cyt.C AIFCaspase抑制剂+Caspase 9酶原Caspase-9Caspase3酶原Caspase-3蛋白质水解无活性核酸内切酶内切酶激活DN
15、A断裂+Bcl-2Ca2+apoptosis?第39页/共71页氧化损伤钙稳态失衡线粒体损伤恶性网络假说(deleterious network hypothesis)细胞凋亡 m AIF,ApafPTP open第40页/共71页细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡的生物学意义1.1.发育发育 从低等动物到高等动物的发育,都存从低等动物到高等动物的发育,都存在着程序性细胞死亡的现象。在着程序性细胞死亡的现象。2.2.免疫系统免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中,淋巴细胞发育分化成熟过程中,始终伴随着细胞凋亡。始终伴随着细胞凋亡。3.3.衰老衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接细胞凋亡与许多年龄相关
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