细菌形态结构观察和染色.pptx

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1、目 的 要 求观察细菌菌落的特征。掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤。在油镜下观察细菌个体的形态。了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽孢、荚膜及鞭毛染色。第1页/共22页奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜镜筒物镜转换器载物台载物台调节纽粗调节器细调节器电源光强调节钮孔径光阑视场光阑双筒目镜摄像头物镜镜座镜臂荧光发射装置第2页/共22页奥林帕斯生物显微镜的使用方法u接通电源。接通电源。u打开主开关。打开主开关。u转转动动光光强强调调节节钮钮，使使亮亮度度适适中。中。u把标本固定在载物台上。把标本固定在载物台上。u用用低低倍倍物物镜镜，旋旋转转粗粗调调和和微微调来进行对焦。调来进行对

2、焦。u调节双目镜筒间距和视度差。调节双目镜筒间距和视度差。u再适当调节照明度。再适当调节照明度。u使焦点正确地对准标本。使焦点正确地对准标本。u调节孔径光阑。调节孔径光阑。u依次用低、中、高倍镜观察。依次用低、中、高倍镜观察。u油油镜镜观观察察：高高倍倍镜镜下下找找到到清清晰晰的的物物象象后后，下下降降载载物物台台，在在标标本本中中央央滴滴一一滴滴香香柏柏油油，使使油油镜镜镜镜头头浸浸入入香香柏柏油油中，再细调至看清物象为止。中，再细调至看清物象为止。u换换片片：另另换换新新片片，必必须须从从第第9条条开开始始操作。操作。u观观察察完完毕毕，下下降降载载物物台台，取取下下载载物物台台上上的的载

3、载玻玻片片，将将4的的目目镜镜对对准准载载物物台台，再再用用擦擦镜镜纸纸擦擦去去镜镜头头上上的的油油，然然后后用用擦擦镜镜纸纸沾沾取取少少量量乙乙醇醇/水水擦擦去去残残留留的的油油，最最后后用用擦擦镜镜纸纸擦擦去去残残留留的乙醇的乙醇/水。水。u用用毕毕复复原原：先先将将电电压压调调节节旋旋钮钮复复原原，关闭主开关，切断电源。关闭主开关，切断电源。第3页/共22页显微镜保养和使用中的注意事项不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片

4、或损伤镜面。光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤害，并且无法进行图像采集。观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同时聚焦。观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。第4页/共22页油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。油镜，即油浸接物镜。当当光光线线由由反反光光镜镜通通过过玻玻片片与与镜镜头头之之间间的的空空气气时时，由由于于空空气气与与玻玻片片的的密密度度不不同同，使使光光线线受受到到曲曲折折，发发生生散散射，降低了视野的照明度。射，降低了视野的照明度。若若中中间间的的介介质质是是一一层层油油（其其折折射射率率与与玻玻

5、片片的的相相近近），则则几几乎乎不不发发生生折折射射，增增加加了了视视野野的的进进光光量量，从从而而使物象更加清晰。使物象更加清晰。第5页/共22页基 本 原 理(一)简单染色法原理(二)革兰氏染色法原理(三)抗酸染色原理(四)芽孢染色原理(五)荚膜染色原理(六)鞭毛染色原理 第6页/共22页染色剂和染色原理染色剂和染色原理微生物染色常用染料如下表：微生物染色常用染料如下表：第7页/共22页实验内容（简单染色的方法和步骤）涂片自然干燥微火固定染色l min冲洗吸干镜检第8页/共22页实验内容（革兰氏染色的方法和步骤）涂片，干燥、固定草酸铵结晶紫染液染色lmin，用水冲洗用革氏碘液媒染lmin，

6、用水冲去碘液用95乙醇脱色10-30s，至乙醇液不呈现紫色蕃红染液复染lmin，用水冲洗吸干并镜检第9页/共22页实验内容（了解抗酸染色的方法和步骤）1制片 将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80恒温水浴3h杀死菌体。取菌悬液涂片，自然干燥。2染色 滴加石炭酸复红染液2滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出现，不断补充染液，加热810min，弃染液。3脱色 用3盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。4水洗 滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。5复染 加美蓝染液染lmin。6水洗后自然干燥、镜检 草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成蓝色。第10页/共22页实验内容（了解芽孢染色的方法和步骤）孔

7、雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀，制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6的孔雀绿饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5蕃红液染色lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈现红色。第11页/共22页实验内容（了解荚膜染色的方法和步骤）1制片 加一滴6葡萄糖水溶液于载片一端，挑取少量胶质芽孢杆菌与其混合，再加一滴黑色素充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层，自然干燥。2固定 滴加l2滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。3染色，冲洗 滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，

8、干燥后镜检。有荚膜的菌、菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能出现一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。第12页/共22页实验内容（了解鞭毛染色的方法和步骤）1载片的清洗：将载片洗净浸泡在95乙醇中备用。2实验菌种的准备：将枯草芽孢杆菌在新制备的肉膏蛋白胨斜面培养基上(斜面下部要有少量冷凝水)，连续移种34次，每次培养1218h，最后一次培养1216h。3制片：擦干载片，在载片一端加一滴蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔底部有水部分的菌体(注意不要挑出培养基)，将接种环悬放在水滴中片刻，将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，可

9、再返转一次使菌液流经面积扩大，然后放平，自然干燥。4染色（利夫森氏染色法）：用蜡笔将涂菌区圈起，滴加染液，过数分钟后，当染液的1/2以上区域表面出现金属光泽膜时，用水轻轻将金属膜及染液冲洗干净，自然干燥。镜检镜检时应在涂片上按顺序进行观察，经常是在部分涂片区的菌体染出鞭毛，菌体及鞭毛均为红色。第13页/共22页实 验 材 料(一)菌种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。(二)染液简单染色：草酸铵结晶紫染液。革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95乙醇、蕃红染液。第14页/共22页实 验 材 料 (三)标本细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。(四)其他物品无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯

10、、吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。第15页/共22页实验内容(一)成片观察(1)观察细菌三型涂片，比较球菌、杆菌和螺旋菌的形态。(2)观察四联球菌的形态及排列方式。(3)观察苏云金芽孢杆菌的芽孢，褐球固氮菌的荚膜的形态。第16页/共22页实验内容(二)观察平板上的细菌菌落，识别大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征。注意菌落的形状、高度、大小、颜色，是否湿润、光泽、透明度、边缘状况等等。第17页/共22页实验内容(三)简单染色(只做金黄色葡萄球菌)。(四)革兰氏染色法：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。第18页/共22页实验报告内容(一一)画表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色

11、葡萄球菌菌落特征。画表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌落特征。(二二)绘绘图图：画画出出大大肠肠杆杆菌菌、枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌的的细细胞胞形态图。形态图。(三三)记记录录3种种菌菌的的革革兰兰氏氏染染色色结结果果；分分辨辨出出革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌或或阴阴性性菌菌。如果染色结果不理想，请分析原因。如果染色结果不理想，请分析原因。第19页/共22页思考题(一)为什么必须用培养24h以内的菌体进行革兰氏染色？(二)要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键步骤？为什么？第20页/共22页实验一实验一 结结束束 请交报告！第21页/共22页感谢您的观看！第22页/共22页