逍遥丸二仙汤对雌性大鼠性激素及乳腺癌细胞ER亚型影响的对比研究.pptx

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1、会计学1逍遥丸二仙汤对雌性大鼠性激素及乳腺癌逍遥丸二仙汤对雌性大鼠性激素及乳腺癌细胞细胞ER亚型影响的对比研究亚型影响的对比研究研究背研究背景景n n乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，近乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，近3030年来，乳腺癌发病年来，乳腺癌发病率一直居女性肿瘤首位，我国乳腺癌的发病率急剧上升，率一直居女性肿瘤首位，我国乳腺癌的发病率急剧上升，据统计据统计20062006年已达到年已达到52/1052/10万。万。n nERER阳性的乳腺癌患者需要阳性的乳腺癌患者需要3 35 5年的内分泌治疗，目前绝年的内分泌治疗，目前绝经期前患者常用药为他莫昔芬（经期前患者常用药为他莫昔芬（TAMTAM

2、），），主要副作用有：主要副作用有：食欲不振、恶心、眩晕、抑郁、面部潮红、皮疹等。食欲不振、恶心、眩晕、抑郁、面部潮红、皮疹等。n n我国大部分乳腺癌患者都接受中西医结合治疗，在手术我国大部分乳腺癌患者都接受中西医结合治疗，在手术后、放化疗期间、内分泌治疗期间及晚期姑息治疗中，后、放化疗期间、内分泌治疗期间及晚期姑息治疗中，中药均全程参与并起着重要作用。尤其内分泌治疗副反中药均全程参与并起着重要作用。尤其内分泌治疗副反应，中医辨证属中医肝郁、冲任失调证，常以逍遥散、应，中医辨证属中医肝郁、冲任失调证，常以逍遥散、二仙汤为母方加减。二仙汤为母方加减。第1页/共29页n n大量临床及实验研究表明疏

3、肝、补肾方剂如逍遥散、二大量临床及实验研究表明疏肝、补肾方剂如逍遥散、二仙汤、乌鸡白凤丸、六味地黄丸等对女性激素均有调节仙汤、乌鸡白凤丸、六味地黄丸等对女性激素均有调节作用。这些调节作用机理一方面与下丘脑垂体卵巢作用。这些调节作用机理一方面与下丘脑垂体卵巢轴有关，另一方面也与复方中单药所含植物雌激素有关。轴有关，另一方面也与复方中单药所含植物雌激素有关。n n己证实植物雌激素对机体具有类雌激素和己证实植物雌激素对机体具有类雌激素和/或抗雌激素活或抗雌激素活性的双重作用。因此，植物雌激素既能作为雌激素又能性的双重作用。因此，植物雌激素既能作为雌激素又能作为抗雌激素使用。作为抗雌激素使用。n n5

4、0506060的乳腺癌是激素依赖性的，雌激素通过与的乳腺癌是激素依赖性的，雌激素通过与ERER（主要是主要是ER ER ）相结合相结合，在乳腺癌的发生中起主要在乳腺癌的发生中起主要作用。作用。可直接和间接促进癌细胞的增殖。可直接和间接促进癌细胞的增殖。研究背研究背景景第2页/共29页n n长期服用疏肝解郁、调理冲任中药治疗乳腺癌或减轻内分泌药物副反应的同时，是否会改变雌孕激素水平？以及改变ER亚型比例？n n中药方剂中植物雌激素对激素敏感性乳腺癌是否有促进或抑制作用？n n中药方剂对雌激素受体拮抗剂他莫昔芬是否有协同或抵消作用？第3页/共29页实验实验内容内容n n1 1逍遥丸、二仙汤对雌性正

5、常大鼠、卵巢摘除大鼠、TAM大鼠血清性激素的影响n n2 含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌T47D细胞ER、蛋白表达的影响第4页/共29页v逍遥丸浓缩液：根据中华人民共和国药典规定，柴胡、当归、白芍、白术（炒）、茯苓、甘草（蜜炙）、生姜、薄荷（后下），以1.4g/kg换算成大鼠剂量。购自中国中医科学院广安门医院门诊药房，浓煎冷藏保存。v二仙汤浓缩液：根据中药方剂现代研究大典引1973年妇产科学记载：仙茅、仙灵脾、巴戟天、当归、黄柏、知母，以1.4g/kg换算成大鼠剂量。购自中国中医科学院广安门医院门诊药房，浓煎冷藏保存。研究方法和技术路线第5页/共29页研究方法和技术研究方法和技术路线路线1 逍遥

6、丸、二仙汤对雌性正常大鼠、卵巢摘逍遥丸、二仙汤对雌性正常大鼠、卵巢摘除大鼠、除大鼠、TAM大鼠血清性激素的影响大鼠血清性激素的影响 Wister 雌性大鼠70只去势术开关术逍遥丸去势组二仙汤去势组空白去势组逍遥丸组逍遥丸TAM组二仙汤组二仙汤TAM组去冠取血，放射免疫法测血清E2、P7d7d30d第6页/共29页研究方法和技术路线研究方法和技术路线n n统计方法：使用使用SPSS 14.0SPSS 14.0统计软件，多组间计数资料先采用方统计软件，多组间计数资料先采用方差分析，再用差分析，再用Student-Newman-KeulsStudent-Newman-Keuls检验检验第7页/共29

7、页结结 果果n n逍遥丸、二仙汤对雌性大鼠雌激素（逍遥丸、二仙汤对雌性大鼠雌激素（E E2 2）的影响）的影响分组E2（pg/ml）正常组321.11632.399空白手术组186.28933.967逍遥丸组154.98150.477去势逍遥丸182.51639.029逍遥丸TAM组394.28137.804二仙汤组346.42564.530去势二仙汤组259.76637.142二仙汤TAM组510.37282.658第8页/共29页对正常雌性大鼠对正常雌性大鼠对正常雌性大鼠对正常雌性大鼠E2E2影响：影响：影响：影响：逍遥丸可显著降低降低正常雌性大鼠血清E2水平；二仙汤对正常大鼠E2未见明显

8、影响；结 果第9页/共29页对去势雌性大鼠对去势雌性大鼠对去势雌性大鼠对去势雌性大鼠E2E2影响：影响：影响：影响：逍遥丸对去卵巢大鼠E2水平无明显影响；二仙汤可升高升高去卵巢大鼠E2水平；结 果第10页/共29页对灌服对灌服对灌服对灌服TAMTAM雌性大鼠雌性大鼠雌性大鼠雌性大鼠E2E2影响：影响：影响：影响：使用TAM使大鼠E2升高；逍遥丸对于TAM引起的E2升高有降低降低作用，二仙汤则无。结 果第11页/共29页结结 果果n n逍遥丸、二仙汤对雌性大鼠孕激素（逍遥丸、二仙汤对雌性大鼠孕激素（P P）的影响）的影响分组P（pg/ml）正常组51.8665.429空白手术组60.08513.

9、505逍遥丸组58.33912.741去势逍遥丸47.18810.297逍遥丸TAM组75.75913.664*二仙汤组59.4187.655去势二仙汤组50.0379.521二仙汤TAM组44.7896.531*第12页/共29页对正常雌性大鼠对正常雌性大鼠对正常雌性大鼠对正常雌性大鼠P P影响影响影响影响：逍遥丸、二仙汤对正常大鼠血清孕激素均无无明显影响结 果第13页/共29页对去势雌性大鼠对去势雌性大鼠对去势雌性大鼠对去势雌性大鼠P P影响：影响：影响：影响：逍遥丸、二仙汤对去势大鼠血清孕激素均无无明显影响结 果第14页/共29页对灌服对灌服对灌服对灌服TAMTAM雌性大鼠雌性大鼠雌性大

10、鼠雌性大鼠P P影响：影响：影响：影响：合用逍遥丸组P水平增高增高，合用二仙汤组P水平下降下降结 果第15页/共29页n n在体内雌激素水平正常或偏高的情况下，逍遥丸主要起抑制作在体内雌激素水平正常或偏高的情况下，逍遥丸主要起抑制作用，降低体内雌激素水平；而当体内雌激素显著低于正常或去用，降低体内雌激素水平；而当体内雌激素显著低于正常或去除卵巢时，逍遥丸并不会使之进一步下降除卵巢时，逍遥丸并不会使之进一步下降 n n在去除卵巢后体内雌激素水平低下时，二仙汤可增加在去除卵巢后体内雌激素水平低下时，二仙汤可增加E2E2水平，水平，这种增加并非通过卵巢，是否通过增加芳香化作用尚需进一步这种增加并非通

11、过卵巢，是否通过增加芳香化作用尚需进一步实验探讨实验探讨 n n使用使用TAMTAM的大鼠血清雌激素水平较正常均有明显升高，考虑与的大鼠血清雌激素水平较正常均有明显升高，考虑与TAMTAM使用早期使用早期与雌激素竞争受体导致血清游离雌激素相对过剩。与雌激素竞争受体导致血清游离雌激素相对过剩。合用逍遥丸的大鼠血清合用逍遥丸的大鼠血清E2E2有降低趋势，与逍遥丸可以抑制过高有降低趋势，与逍遥丸可以抑制过高的雌激素水平相吻合。的雌激素水平相吻合。n n使用使用TAMTAM的两组大鼠，合用逍遥丸的大鼠的两组大鼠，合用逍遥丸的大鼠P P升高，而合用二仙汤升高，而合用二仙汤的大鼠的大鼠P P降低，推测使用

12、降低，推测使用TAMTAM后后ER-PRER-PR基因抑活，因此孕激素相基因抑活，因此孕激素相对增多，逍遥丸对此并无明显作用，而二仙汤可通过高雌激素对增多，逍遥丸对此并无明显作用，而二仙汤可通过高雌激素水平反馈性抑制下丘脑水平反馈性抑制下丘脑-垂体垂体-卵巢轴降低卵巢轴降低P P水平水平 逍遥丸、二仙汤对雌、孕激素的影响逍遥丸、二仙汤对雌、孕激素的影响第16页/共29页2 2 2 2 含逍遥丸、二仙汤血清对含逍遥丸、二仙汤血清对含逍遥丸、二仙汤血清对含逍遥丸、二仙汤血清对T47DT47DT47DT47D细胞生长及细胞生长及细胞生长及细胞生长及ERERERER、ERERERER蛋白表达影响蛋白表

13、达影响蛋白表达影响蛋白表达影响n n雌激素通过与雌激素通过与ERER相结合起作用。目前认为雌激素与相结合起作用。目前认为雌激素与ERER结合在乳腺癌的发生中起主要作用。结合在乳腺癌的发生中起主要作用。ERER与植物性雌激与植物性雌激素的亲和力高于素的亲和力高于ERERn nERER亚型与乳腺癌的发生：正常乳腺组织中亚型与乳腺癌的发生：正常乳腺组织中ERER表达水平表达水平高于高于ERER，且当组织自良性病变发展自到癌变的过程中且当组织自良性病变发展自到癌变的过程中ERER表达下降而表达下降而ERER升高，特别是升高，特别是ERER/ER/ER比值下降，于比值下降，于是组织对雌激素反应力即逐渐增

14、加，发生癌变的风险亦是组织对雌激素反应力即逐渐增加，发生癌变的风险亦逐渐增强。由此，推断逐渐增强。由此，推断ERER对维持乳腺组织的正常生理对维持乳腺组织的正常生理功能起着重要作用。功能起着重要作用。n n ERER亚型与内分泌治疗耐药：目前尚无定论，部分实验显亚型与内分泌治疗耐药：目前尚无定论，部分实验显示示ERER 表达的上调与表达的上调与TAMTAM耐药有关，但部分则认为耐药有关，但部分则认为ERER阳阳性前提下，性前提下，ERER 表达可增加表达可增加TAMTAM的敏感性的敏感性第17页/共29页研究方法和技术路线研究方法和技术路线研究方法和技术路线研究方法和技术路线Wister大鼠8

15、只灌服逍遥丸4只灌服二仙汤4只去冠取血清30d去激素小牛血清培养的T47D细胞溶剂对照组 0.5%DMSO 雌激素对照组（E2，0.1nmol/L）逍遥丸血清组（10逍遥丸血清）二仙汤血清组（10二仙汤血清）他莫昔芬组（1.0uMTAM）雌激素+他莫昔芬组 逍遥丸血清+他莫昔芬组 二仙汤血清+他莫昔芬组 96h加入6dMTT法测细胞增殖Western-blot法测定ER、ER蛋白表达第18页/共29页结结 果果n n含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌T47DT47D细胞活性影细胞活性影响响分组分组24h MTT值值48h MTT值值72h MTT值值未处理0.2500.0

16、180.3790.0290.4610.047雌激素0.2430.0150.4030.0160.5200.042*逍遥丸0.2570.0170.3670.0340.4760.024二仙汤0.2600.0140.3700.0400.4920.056TAM0.2520.0170.3500.0270.4720.048第19页/共29页结结 果果n n72h时，加入雌激素雌激素的T47D细胞MTT活性较未处理组增强增强（p0.05）；n n加入逍遥丸、二仙汤血清、TAM的细胞活性较未处理组无明显变化无明显变化，各组之间也无统计学差异第20页/共29页n n含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌含逍遥丸、二仙汤血清

17、对乳腺癌T47DT47D细胞细胞ER ER 的影响的影响结结 果果分组ER灰度值溶剂0.8050.092雌激素1.5400.097*逍遥丸1.0050.073二仙汤0.9510.098TAM1.1080.132*v加入雌激素雌激素的细胞ER蛋白表达明显增加，与其他组有明显差异（P0.01）。vTAM也上调了ER蛋白的表达，与溶剂组、二仙汤血清组有明显差异（P0.01）。v逍遥丸、二仙汤血清对ER蛋白表达无明显改变 第21页/共29页结果结果n n含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌T47DT47D细胞细胞ERER的影响的影响 分组ER灰度值溶剂0.9530.096雌激素1.

18、2430.100*逍遥丸1.1120.118二仙汤1.3200.133*TAM1.3210.104*雌雌激激素素、二二仙仙汤汤血血清清及及TAM均使ER蛋白表达增加，与溶剂组、逍遥丸组有显著差异（P0.01）第22页/共29页结结 果果n n含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌T47DT47D细胞细胞ERER/ERER比值的影响比值的影响 分组ER/ER比值溶剂1.184雌激素0.807逍遥丸1.004二仙汤1.388TAM1.315v加入溶剂的T47D细胞，ER和ER蛋白的表达基本相近，ER略多于ER；v加入雌激素的T47D细胞，ER蛋白表达低于ER；v加入逍遥丸血清与溶

19、剂类似，ER和ER蛋白的表达基本相近，ER略多于ER；v加入TAM和二仙汤血清的细胞，ER蛋白的表达明显高于ER。第23页/共29页n n雌激素诱导雌激素诱导ERER和和ERER蛋白表达比例的失常或倒蛋白表达比例的失常或倒置，可能是其促进乳腺癌发生发展的原因之一置，可能是其促进乳腺癌发生发展的原因之一 n nTAMTAM诱导诱导ERER和和ERER表达上调，表达上调，ERER/ER/ER比例增比例增加，尚不足以推测是其治疗有效的原因，还是耐加，尚不足以推测是其治疗有效的原因，还是耐药性产生的开始药性产生的开始n n逍遥丸血清对逍遥丸血清对ERER和和ERER无明显改变；无明显改变；n n二仙汤

20、血清对二仙汤血清对ERER有特异性的诱导作用，考虑与有特异性的诱导作用，考虑与其方内所含植物雌激素有关。以往不少研究显示，其方内所含植物雌激素有关。以往不少研究显示，仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归均有雌激素样作用。仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归均有雌激素样作用。逍遥丸、二仙汤对逍遥丸、二仙汤对T47D乳腺癌细胞乳腺癌细胞ER亚型的影响亚型的影响 第24页/共29页n n虽然逍遥丸使大鼠血清E2水平下降、二仙汤血清特异性诱导ER蛋白表达上调，但均未见对ER和ER双阳性的 T47D细胞有明显促进或抑制作用。n n说明肿瘤细胞的生长也受到多种因素的影响，影响因素及信息通路越多，药物对其产生的效果越复杂多变，

21、所需时间也越长 逍遥丸、二仙汤对逍遥丸、二仙汤对T47D乳腺癌细胞活性的影响乳腺癌细胞活性的影响 第25页/共29页结论结论逍逍遥遥丸丸和和二二仙仙汤汤对对机机体体激激素素内内环环境境具具有有调调节节作作用用，这这种种调节是发生在机体当时所处的生理或病理状态基础上的。调节是发生在机体当时所处的生理或病理状态基础上的。二二仙仙汤汤血血清清对对ERER有有特特异异性性的的诱诱导导作作用用，考考虑虑与与其其方方内内所含植物雌激素有关所含植物雌激素有关 逍逍遥遥丸丸、二二仙仙汤汤均均未未见见对对乳乳腺腺癌癌T47DT47D细细胞胞有有明明显显促促进进或或抑制作用。抑制作用。第26页/共29页临床提临床

22、提示示n n逍遥丸可降低雌激素水平，提示其用于绝经期前逍遥丸可降低雌激素水平，提示其用于绝经期前激素敏感型乳腺癌可能与激素敏感型乳腺癌可能与TAMTAM有协同、增效的作有协同、增效的作用，安全性相对较强；用，安全性相对较强；n n二仙汤可上调二仙汤可上调ERER蛋白表达，可能增加蛋白表达，可能增加TAMTAM治疗治疗的敏感性，但就目前研究尚无法定论其增加的敏感性，但就目前研究尚无法定论其增加TAMTAM的敏感性还是诱导耐药，尚需进一步研究的敏感性还是诱导耐药，尚需进一步研究n n二仙汤可提高去卵巢后雌激素水平，故用于治疗二仙汤可提高去卵巢后雌激素水平，故用于治疗乳腺癌患者的更年期综合征或内分泌药物副反应乳腺癌患者的更年期综合征或内分泌药物副反应时以及使用芳香化酶抑制剂的绝经期后乳腺癌患时以及使用芳香化酶抑制剂的绝经期后乳腺癌患者是否安全，尚需进一步研究者是否安全，尚需进一步研究第27页/共29页第28页/共29页