DNA重组技术的基本工具PPT课件.ppt

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1、专题一 基因工程1 假如你是一位育种专家，你能培育出下面几种“生物”吗？请问你准备用什么方法？2这些定向改造基因的设想能实现吗？经过多年的努力，科学家终于在20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术 基因工程3一.基因工程的概念基因工程基因工程的别名的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平特点特点本质本质DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平定向改造生物基因重组 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的。因此又叫做

2、DNA重组技术。41.1 DNA重组技术的基本工具三种基本工具剪刀针线运输车限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶DNADNA连接酶连接酶运载体运载体5问题探讨：苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉6基因工程培育抗虫棉的简要过程普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌（有抗虫性状）提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)重组DNA导入形成培育抗虫棉的关键步骤有哪些？7基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分

3、子手术刀”限制性核酸内切酶“分子缝合针”DNA连接酶“分子运输车”基因进入受体细胞的载体8主要来源：（1）限制性核酸内切酶“分子手术刀”原核生物限制酶就是细菌的一种防御性工具，切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。简称：限制酶分布：主要在原核生物中你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？二.基因工程的工具9原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原

4、核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。限制酶在原核生物中的作用10 T磷酸二酯键1234512345 A2、作用特点：11122、作用特点：识别识别特定核苷酸序列特定核苷酸序列,切断两个切断两个核苷酸之间的核苷酸之间的磷酸二酯键。磷酸二酯键。具有特异性。一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。（1）限制性核酸内切酶“分子手术刀”3、限制酶识别序列大多数大多数限制酶的识别序列由限制酶的识别序列由6 6个个核苷酸组成核苷酸组成少数的少数的识别序列由识别序列由4 4、5 5或或8 8个个核苷酸组成核苷酸组成13思考与探究 P72、为

5、什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。14 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？15限制酶所识别的序列的特点 中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。EcoREcoRSmaSma3、限制性核酸内切酶的作用特点

6、能识别特定核苷酸序列；（专一性）163、限制性核酸内切酶的作用特点：从特定部位的两个核苷酸之间切开。（切点：磷酸二酯键）T1234512345 A（专一性）1718Sma平末端平末端平末端平末端4.限制酶的作用结果：19EcoR黏性末端黏性末端4.限制酶的作用结果：20EcoR黏性末端黏性末端重复演示重复演示21EcoR黏性末端黏性末端 大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶EcoR能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。222/15/202323什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。24Sma平末端平末端平末端

7、平末端限制酶Sma能识别GGGCCC序列，并在G和C之间切开。25平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。26GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGEcoREcoRGGAATTCAATTCCTTAACTTAAGGGGAATTCAATTCCTTAACTTAAGG不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来生物生物A A基因片段基因片段生物生物B B基因片段基因片段GGAATTCAATTCCTTAACTTAAG

8、GGGAATTCAATTCCTTAACTTAAGG酶切酶切27（1）限制性核酸内切酶“分子手术刀”4.作用结果：产生黏性末端或平末端28要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?29（2）“分子缝合针”DNA连接酶作用:把切下来的把切下来的DNADNA片段拼接成片段拼接成新的新的DNADNA，即将，即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.作用原理：恢复

9、被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键30 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E E coli DNAcoli DNA连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键31T4 DNA DNA连接酶连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶32类型：类型E E colicoliDNADNA连接连接酶酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶来源来源功能功能大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体恢复恢复磷酸磷酸二酯键二酯键只能连接只能连接黏性末端黏性末端能

10、连接能连接黏性末端黏性末端和和平末端平末端(效率较低效率较低)相同点相同点差别差别（2）“分子缝合针”DNA连接酶33DNA连接酶寻根问底 P6DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?34AGTAC T AATDNA母链母链DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶TTAG A TA TCCGACGGTTTAA35DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸将单个核苷酸通过磷酸二酯键二酯键连接成一条互补

11、的DNA链2)能将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板36【探规寻律】几种酶的作用部位限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶作用于部位,DNA解旋酶作用于部位。37（3）“分子运输车”基因进入受体细胞的载体载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载体：质粒 动植物病毒 （3）噬菌体的衍生物 假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？（最常用

12、）38 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且有自我复制能力的双链环状DNA分子。3940常用的载体质粒：能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别培养基鉴别独立于细菌拟核独立于细菌拟核DNADNA之外的一种可以自我之外的一种可以自我复制的复制的小型环状的小型环状的DNADNA分子分子411 1）载体载体DNADNA必需有必需有一个或多个限制酶一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制

13、酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外，这样，这样才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。2 2）载体载体DNADNA必需具备必需具备自我复制的能力自我复制的能力，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体DNADNA上随染色体上随染色体DNADNA的的复制而同步复制复制而同步复制。3 3）载体载体DNADNA必需必需带有标记基因带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。，以便重组后进行重组子的筛选。4 4）载体载体DNADNA必需必需是安全的是安全的，不

14、会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5 5）载体载体DNADNA分子分子大小应适合大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNADNA分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。42小结基因工程基因工程的工具的工具限制 酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键产生黏末端或平末端DNA连连接酶

15、接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键种类种类E.coliDNA连接酶连接酶T4DNADNA连接酶连接酶运载运载工工具具具备的具备的条件条件能在宿主细胞中自我复制能在宿主细胞中自我复制并稳定存在并稳定存在具一种至多种限制酶切点具一种至多种限制酶切点具标记基因具标记基因质粒、质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒噬菌体衍生物、动植物病毒43基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定441.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？CTGCAGACTGCGGCGCTTAAGACGTCGCCGGTCAAATTCG和能连接形成ACTGGTCA和能连接形成GCTTAAAATTCGCGGCGCCG和能连接形成和能连接形成CTGCAGGACGTC反向对称思考与探究 P7452/15/202346