基因操作原理课件.pptx

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1、基基 因因 操操 作作 原原 理理Principles of Gene Manipulation 绪论绪论一、什么是基因操作一、什么是基因操作将在细胞外产生的核酸分子将在细胞外产生的核酸分子插入病毒质粒或其它载体系统中插入病毒质粒或其它载体系统中再整合到那些本来不含该类物质的宿主中再整合到那些本来不含该类物质的宿主中从而形成一种新的可连续繁殖的有机体从而形成一种新的可连续繁殖的有机体目的目的要求掌握要求掌握基因操作中基本的普遍应用的原理基因操作中基本的普遍应用的原理并能自主设计通用操作方法和策略并能自主设计通用操作方法和策略要求的基础要求的基础生物学生物学生物化学生物化学分子生物学分子生物学参

2、考书籍参考书籍.Molecular Cloning V2.0,1989 分子克隆实验指南分子克隆实验指南 2.基因工程原理第二版（上册）基因工程原理第二版（上册）吴乃虎科学出版社吴乃虎科学出版社1998/2000 3.分子生物学试剂产品目录分子生物学试剂产品目录如如 New England BioLabs 其它基因及其操作原理其它基因及其操作原理精编分子生物学实验指南精编分子生物学实验指南Internet 基因及其产物的共线性基因及其产物的共线性基因及其产物的基因及其产物的非非共线性共线性基因的重叠与可变性基因的重叠与可变性二、基因的基本概念二、基因的基本概念编码区编码区 ORF启动子启动子

3、promoter RBS ribosomal binding site 终止区终止区 terminatorflanking sequence upstream/downstreamCap/tail 三、基因的基本结构组成三、基因的基本结构组成酶切酶切酶切酶切连接连接转化转化筛选筛选.GAATTC.CTTAAG.G.CTTAAAATTC.G.EcoRI三、基因克隆的通用策略三、基因克隆的通用策略Chromosome DNAvectorRecombinant plasmidsTarget gene第二章第二章 工具酶工具酶 切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记利用限制性内切酶切割产生特殊DN

4、A片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶Restriction endonuclease任何物种都有排除异物保护自身的防御机制免疫系统细菌的限制与修饰系统限制性内切酶限制性内切酶 修饰酶修饰酶一、限制与修饰Restriction and modification 50年代初，发现 host controlled specificity噬菌体具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。E.coli KE.coli CEOP=1EOP=1EOP=1EOP=1

5、0-41.现象现象EOP Efficiency of platepfu plaque forming unit E.coli K E.coli B E.coli C KBC11110-410-410-410-411说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5甲基胞嘧啶2.限制酶的发现限制酶的发现60年代，限制内切酶和限制酶的概念1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点达离识别位点1000bp以上1970年 美国约翰霍

6、布金斯大学 H.Smith 偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA无细胞提取液可降解E.coli DNA但不能降解自身DNA 即HindII酶5.G T Py Pu A C.33C A Pu Py T G.5 G T C G A CG T T A A CG T C A A CG T T G A CY R5.G A A T T C.33C T T A A G.5 EcoRI3.限制酶的命名限制酶的命名宿主宿主 属名第一字母、种名头两个字母属名第一字母、种名头两个字母菌株或型号菌株或型号序号序号 罗马字罗马字HindII EcoRI 早前加

7、R,or M 菌株号和序号小写1986年下半年 发现 615R 98M1998年 10000细菌 古细菌 3000种酶 200多特异性3.限制与修饰系统的种类限制与修饰系统的种类 亚单位组成,识别序列的种类,是否需要辅助因子分三类(I,II,III)也有分四类，IIs类，即II 亚类(1)type II 93%识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 3-OH,5-P，需需Mg2+，相应的修饰酶需，相应的修饰酶需only SAM 识别序列主要为识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列或更长且呈二重对称的特殊序列但有少数酶识别更长的序列或

8、简并序列但有少数酶识别更长的序列或简并序列 切割位置因酶而异，有些是隔开的切割位置因酶而异，有些是隔开的R:一般为同源二聚体一般为同源二聚体,反向结合反向结合 作用在两条链作用在两条链M:单体单体 DNA同时切割同时切割,M只作用新链只作用新链type IIs 占占5%识别位点非对称识别位点非对称,非间断非间断 4-7bp切割位点可能在切割位点可能在20bp范围内。范围内。R:与与 type II 具有相同的辅助因子要求具有相同的辅助因子要求M:通常由两个通常由两个M来完成来完成,各作用一条链各作用一条链(2)type I 和和 typeIIItype I(1%)种类少 如 EcoR EcoB

9、R酶和M酶 各作为一个亚基存在于酶分子中 即R基和M亚基，还有负责识别DNA序列的S亚基 分别由hsdR，hsd M，hsdS基因编码 属于同一操纵子（转录单位）EcoK R2M2S EcoB R2M4S2P1hsdRP2hsdMhsdS 识别位点识别位点EcoB TGA*(N)8TGCT A*EcoK AAC (N6)GTGC A*甲基化位点 可能的甲基化位点切割位点1000bp以外,无特异性R-M+突变突变 M+S-R-M-Gene type phenotype M-R-M-保全机制保全机制typeIII(64Nt=44=2566Nt=46=4096 回文对称 4 6 8 5 72.结构E

10、coRI GAATTC CTTAAGHindIII AAGCTT TTCGAA 非对称AccBSI CCGCTC(-3/-3)BssSI CTCGTG2.结构Numbers in parentheses indicate point of cleavage for non-palindromic enzymes 多识别序列 (简并序列)AccI GTMKACHindII GTYRAC 间断对称AlwNI CAGNNNCTGDdeI CTNAG3切割位置 内部 大多数AccBSI CCGCTC(-3/-3)GGCGAGAaaaI NNNNNN(-2/-4)NNNNNN例 两端 EcoRII CC

11、WGG Sau3AI GATCNlaIII CATG 两侧 BcgI (10/12)CGA(N)6TGC(12/10)10(N)CGA(N)6TGC(N)1212(N)GCT(N)6 ACG(N)10TspRI CASTGNN/NNCAC(G)TGNNNNGTG(C)ACNN 单侧 BbvI GCAGC N(8/12)BspMI ACCTGC(N4)TGGACG(N8)4.特殊系列 I-prefix&pI-prefix三、限制性内切酶产生的末端Cohesive terminus(end)1.匹配粘端(粘性末端）末端相同 在对称轴5侧切割底物DNA双链交错断开5protrudingEcoRI N

12、NGAATTCNN NNCTTAAGNN NNG AATTCNNNNCTTAA GNN 3-侧3突出末端 5 recessedKpnI GGTACC CCATGG2.平端 Blunt end在对称轴上同时切割DNA的两条链HaeIII GGCC EcoRV GATATCXmnI GAANNNNTTC3.非对称突出端非对称突出端(相同相同)来自非对称识别序列来自非对称识别序列 CCTCAGC BbvCI GGAGTCG 简并序列AccIGT/MKACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC 间隔序列 DraIII CACNNNGTG EarI CTC T TC(1/4)GAGAAG4.同

13、裂酶(isoschizomer)识别相同序列的限制酶称同裂酶 同序同切 HindII HincII GTY/RAC HpaII HpaII C/CGG MobI Sau3AI /GATC同功酶？同序异切KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC Asp718I G/GTACCAatII GACGT/C BsaHI GR/CGYC“同功多位”EcoRI G/AATTC ApoI R/AATTYHpaI GTT/AAC HincII GTY/RAC 其它 SalI G/TCGAC AccI GT/MKAC HincII GTY/RAC5.同尾酶平端同裂酶EcoRI GAATTC Mfe

14、I CAATTG ApoI RAATTYSpeINheIXbaIStyIA C T A G T G C T A G C T C T A G AC C W W G GBamHI GGATCC Sau3AI GATC ClaI ATCGAT AccI GTMKAC pUC19 BstBI TTCGAATaqI TCGA四、末端长度对切割的影响指导双酶切以及酶切 PCR产物 2hr 20hrAccI CCGGTCGACCGG 0 0HindIII CAAGCTTG 0 0 CCAAGCTTGG 0 0 CCCAAGCTTGGG 10%75%EcoRI GGAATTCC 90 90利用Labeled

15、寡核苷酸 在20 Units RE 时 酶切 1 ug oligo1.Labeled 寡核苷酸 PstI GCTGCAGC 0 0 TGCACTGCAGTGCA 10 10 AACTGCAG(N)14 90 90 CTGCAG(N)20 0 02.DNA片段（线性载体）10/ug DNA 60minCGTACG CTCGAG GAATTC CTGCAG GATATCEcoRI L1TMUS29XhoI 100%(1)PstI 88(1)CTCGAG GAATTC CTGCAG XhoI EcoRI PstI .CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI

16、 EcoRI PstI EcoRI initial cut L1TMUS29cleavage efficiency XhoI 97%1 base PstI 37%1 baseXhoI:1 EcoRI 100%PstI :1 EcoRI 88%L1TMU39NheI 100(1)GGATCC GAATTC GCTAGC BamHI EcoRI NheI由于不计算单链部分的4个碱基，因此设计引物时应加4个。在双酶切多克隆位点时，选酶切秩序五、位点偏爱(site preferences)单位酶、在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1g DNA完全消化所需的酶量(多数情况用 DN

17、A来测试)NEB in 50l 体系/Pharmacia 50l某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割1975 EcoRI切割 phage中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快10倍。1976 EcoRI在腺病毒2 DNA中的切割速率不同。1981 EcoRI和HindIII在中的切割速率分别有10倍和14倍的差异（=48502bp 12bp粘端）1.现象*1977，X174 ssDNA 5386bp circle HgaI切割某些位点比其它的快*1983 腺病毒2中，CTCGAG位点对PaeR7I 完全抵抗 但同裂酶XhoI,却很易切割，原因是5末端有一

18、个CT二核苷酸 与甲基化完全无关有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）at 40,38bp中央三个快50倍NEB检测了许多限制酶，有许多酶的差异在10倍的范围上，但有许多酶有较大的差异NarI,NaeI SacIIGGCGCC,GCCGGC,CCGCGG(1)pBR322含4个NarI位点1单位酶 1hr (标准条件)将两个位点完全切割但是另外两个位点50单位,16小时 不能完全切割完全(2)NaeI在pBR322也有4个位点，其中两个易切割,有一个有点慢,第四个慢50倍在 DNA上它们都有一个位点，但是过量的酶只能完成部分酶切。酶单位定义是通过切割腺病

19、毒2 DNA来测定的(A-virus2 有至少10个位点)1单位NaeI or NarI是切割1g腺病毒2 DNA在50l体系中1hr完全所需的酶量2.原因(1)在切割DNA之前需要同时与两个识别位点相作用(2)BspMI、EcoRII、HpaII对它们作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是激活另一个的变构位点(allosteric)由顺式方式提供（cis）:它们相互靠近或可形成环（loop）由反式方式提供（trans）:其变构位点由含识别序列的寡核苷酸提供BspMI难以切割DNA:在pBR322和pUC18/19中有一个BspMI位点，100倍的过量切割一半DNA未切割3酶量

20、使用差异cccDNA/linear DNA 酶量使用有差异单位酶、在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1g DNA完全消化所需的酶量1Unit/1g DNA少数需酶量少,如 AseI:0.3U 可满足 1g pBR322切割多数需酶量多 pUC19:AvaI 10u,NarI 20U,ScaI 15U EagI 10U for pBR322&LITMUS六、酶切反应条件任何一个提供商都会标明其产品的最佳作用条件(一)缓冲液1.常规缓冲液pH,Mg+,DTT,BSA(10X)pH 7.0-7.9(at 25)Tris-HCl,乙酸 离子强度：NaCl 高 中 低 100mM

21、 50mM 0 Mg+10mM MgCl2,MgAc DTT(dithiothreitol,二硫苏糖醇)1mM 100g/ml BSA 少数需要 乙酸盐缓冲液 其它特用缓冲液，如NEB的U体系 不同酶具有不同Buffer各公司设立几种常用BufferNEBuffer 1NEBuffer 2 NEBuffer 3NEBuffer 4 Buffer ABuffer BBuffer HBuffer L 如2.通用缓冲体系 Phamacia One-Phor-All buffer plus,OPA+谷氨酸钾缓冲液（KGB）使用浓度不同 0.5 1 1.5 2 2：50-80%,3：正常相当于厂家的活性

22、 4：高于厂家提供的活性3.双酶切策略 a.选用都合适的Buffer or KGB b.不可替代：先低，加适量NaCl和第二种酶 c.先低后高（可纯化或不纯化）4.注意事项a.取少量酶 (方法 or 稀释)b.最后加酶、尽快操作c.减少反应体积d.反应时间的延长e.分装（对于多个反应）(二)反应温度大多数为37,一部分为50-65 少数25-30高温作用酶37时活性多数10-50%TaqI(65)10%,ApoI(50)50%SmaI(25)在在 37 half life 15min(三)反应时间 1hr or more 许多酶延长其反应时间可减少酶的用量 在在16hr反应时间所需正常酶量的比

23、率EcoRI 0.13 (1/8)HindIII(1/8)KpnI(1/4)BamHI(1/2)HaeIII(1/1)(四)反应终止1.EDTA 终10mM2.加热 37 酶 在65处理20min,otherwise 80 20min3.其它 DNA纯化(苯酚,试剂盒)在80 20min不失活的酶:37：Bg1II HpaI PvuII65：Tth111I TspRI50：Bc1I七、星星活性(star activity)非特异性切割在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性1.概念 实际上星星活性是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都

24、能切割非典型位点。ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI2.酶的特异性变化方式与酶的种类和所应用的条件有关最普遍的活性变化:1个碱基的变化;识别位点外层碱基的随意性;以及单链缺口EcoRI的研究表明 pH的升高和离子强度的降低,可切割N/AATTN 切割只有一个碱基不同的序列 (但这个变化的碱基在中央序列,以及 AATT中不是A到T或T至A的变化)3.引起星星活性的因素 高浓度甘油（5%）酶过量（100U/g）低离子强有力度（pH8.0)有机溶剂PMSD(二甲基亚砜

25、)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide),sulphalane 用其它二价阳离子代替Mg+Mn+，Cu+，Co+,Zn+不同的酶对上述条件的敏感性不一样PstI比EcoRI对高pH更敏感但后者对甘油浓度更敏感星星活性在绝大多数情况下，是可控制的4.抑制星星活性的条件（措施）减少酶的用量，避免过量酶切,减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶济或乙醇 提高离子强度到100150mM (如果不会抑制的话)降低反应pH至pH7.0 使用Mg+作为二价阳离子X174(5386 bases)M13mp18(7249bases),

26、Wild M13 phage 6407base八、单链DNA的切割Cleavage of single-stranded DNAHinP1I,HhaI,MnlI at 50%of the rate of dsDNA HaeIII 10%BstNI,DdeI,HgaI,HinfI,TaqI 100倍慢不切割：AluI,BbvI,DpnI,FnuDII,FokI,HpaII,HphI,MobI,MobII,MspI,Sau3AI,SfaNI1.外因外因反应条件反应条件底物的纯度底物的纯度(杂质杂质,污染污染-盐盐-酚酚)九、影响活性的因素九、影响活性的因素2.“内因内因”星星活性星星活性 甲基化甲

27、基化 底物的构象底物的构象/位点位点1.产生的产生的5突出端补平后连接突出端补平后连接EcoRI GAATTC CTTAAG十、十、酶切位点的引入 （酶切水平）.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI EcoRI PstI .CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC.XhoI PstI .CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC.XhoI PstI AATTTTAA.CTCGAGGAATTAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAATTAAGGACGTC.XhoI Pst

28、I AseIXmnI酶切补平连接HindIII AAGCTAGCTT TTCGATCGAA AluINheI2.同尾末端的连接同尾末端的连接BamHI(G/GATCC)+BclI (T/GATCA)AlwI(GGATC 4/5)3.平端连接平端连接PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC)MobI(GATC)十一、十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性GC%酶切位点出现的机率BamHI GGATCCEcoRI GAATTC在基因组中，碱基对的排列是非均匀的因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的平均片段大小在E.coliAscI(GGCGCGCC)20kbNo

29、tI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII 5kbSpeI(ACTAGT)60kb细菌基因组在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少酵母基因组G+C%为38%，因此在重复序列之外(tRNA or Ty elements)，富含G+C的识别序列就特别少哺乳动物 细胞核基因组的G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞就相当稀少。但是在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的第二节第二节 甲基化酶 Methylase Methylation一、一、甲基化酶的种类在真核和

30、原核生物中存在大量的甲基化酶，在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶1.Dam甲基化酶甲基化酶识别位点GATC,在腺嘌呤N6位置 引入甲基 PvuII BamHI BclI BglII XhoII MboI Sau3AI 识别位点中含GATC序列 ClaI(1/4)XbaI(1/16)TaqI(1/16)MboII(1/16)HphI(1/16)部分识别序列含GATC序列4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列有些限制酶对有些限制酶对Dam甲基化敏感甲基化敏感不能切割相应的序列不能切割相应的序列BclI,ClaI,MboI,XbaI 等等不敏感的有不敏感的有 BamH

31、I,Sau3AI,BglII,PvuI等等一般哺乳动物一般哺乳动物DNA 不会在不会在A-N6上甲基化上甲基化当需要在敏感位点上完全切割当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从时，必须从dam-E.coli中提取中提取DNA2.Dcm甲基化酶甲基化酶识别识别CCAGG或或CCTGG序列序列在第二个在第二个C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基EcoRII/BstNI CCA(T)GG二者识别序列相同，但切点不同二者识别序列相同，但切点不同EcoRII受受dcm甲基化作用影响甲基化作用影响BstNI可避免这一影响可避免这一影响受影响酶有：受影响酶有：Acc65I GGTACCAlwNI Apa

32、I GGGCCCEcoRIIEaeI 等等不受影响酶有：不受影响酶有：KpnI GGTACCBanIIBg1I BstNINarI GGCGCC等等3.EcoKI甲基化酶甲基化酶识别AAC(N)6GTGC GCAC(N)6GTT 但识别位点少(1/8kb)研究较少而dam（1/256bp）dcm(1/512bp)4.SssI甲基化酶甲基化酶来自原核生物SpiroplasmaCG序列中的C在C5位置上甲基化可在未甲基化或半甲基化链上起作用A的 N6位置许多酶对此甲基化敏感AatII ClaI XhoI SalI等不敏感的有BamHI EcoRI SphI KpnISssI甲基化的DNA 受E.c

33、oliMcrA,McrBC,Mrr 系统的限制5.其它甲基化酶二、二、依赖于甲基化的限制系统 E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列mcrA,mcrBC,mrr 都限制由 CpG甲基化酶(MSssI)作用的DNA Mrr也限制m6A McrBC 切割两套位点（G/A）mC，这两套位点之间间隔2kb，最适为55103bp，需GTP大多数常用的E.coli受体都含这三个限制系统三个都不限制Dam,EcoKI,EcoRI修饰的位点McrA限制HpaII甲基化修饰的位点三、三、甲基化对限制酶切的影响1.修饰酶切位点 HincII GTCGAC GTC

34、AAC GTTGAC GTTAAC M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割 BamHI GGATCC M.MspI m5CCGG如果BamHI前面为CC或后面为GG，那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割 构建DNA文库时用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因组DNAM.EcoRI甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割2.产生新酶切位点TCGATCGAAGCTAGCT TaqI TaqI M.TaqI TCGA*TCGA*AGCTAGCT DpnI3.

35、用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG肠道细胞的Gm6ATCC m5/4 CGG MspI可切割，HpaII不可切割Gm6ATC Sau3AI 可切割，MobI不可切割其它4.对基因组作图的影响在哺乳动物DNA CpG序列出现的频率大约只有预计的1/5 含CpG序列的识别序列极其稀少大多数CpG都发生甲基化 含CpG的所有识别序列的酶不能切割CpG甲基化大多数不完全 对酶切位点稀少的酶来说 在其识别位点上的甲基化具可变性第三节第三节 DNA聚合酶DNA polymerase催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相辅的活性一、大肠杆菌

36、DNA聚合酶I 真核细胞有 4种 DNApoly：也许是复合物，位于细胞核内，有催化细胞增生的作用。：小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺出大是出，与细胞增生无关。：100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高。其它：线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA的合成。原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关I单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长II 与低分子脱氧核苷酸链的延长有关III 在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶1.活性活性单链多肽(109kDa)三种活性 53DNA聚合酶活性底物:模板(ssDNA),引物（带3OH基）或 5突出DsDNA M

37、g2+dNTP DNApolyI53外切核酸酶活性底物:dsDNA or DNA:RNA杂交体活性：从5端降解dsDNA，也降解 RNA:DNA中的RNA(RNase H活性)Mg2+DNApolyI+dNTP35外切酶活性底物：3-OH dsDNA or ssDNA活性：从3-OH端降解DNA，可被53聚合活性封闭。Mg2+DNApolyI+dNTP Mg2+DNApolyI+dNTPProof reading反应平衡过量dNTP 平端2.用途切口平移法标记DNA（所有DNApoly中只有该酶有此活性）Mg2+,低限量DNase IdNTP DNApoly I产生切口切口平移外切活性和合成活

38、性共同作用使切口沿5-3方向平移若有放射性dNTP,则可标记成探针 用于cDNA克隆中的第二链即单纯的DNA聚合活性但由于有5-3外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶 末端标记（交换或置换反应）Mg2+,DNApoly I-P32dATPA*TT4 DNApolyT7 DNApoly 更好二、Klenow酶E.coli DNA polymerase I large fragmentKlenow fragment在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影响，或基因工程而得76kDa1.活性共两种,同 DNApoly I2.作用 补

39、平3凹端，注意要用 dNTP 抹平3凸端，注意必须加足量dNTP T4和T7具更强3-5外切活性，被取代 末端标记 A置换反应 同前,同样被 T4 poly 代替 B补平3-凹端的过程进行标记 cDNA克隆中合成第二链 随机引物标记 DNA测序（Sanger 双脱氧链末端终止法）被T7取代，Taq等PCR酶。PCR反应被Taq等取代 在体外诱变中，用于从单链模板合成dsDNA仅利用DNA合成活性三、T4噬菌体DNA聚合酶 T4 DNA polymerase来源于T4 phage感染的E.coli,114kDa1.活性 与Klenow酶相似,但35外切活性强200倍 不从单链DNA模板上置换引物

40、 因此在诱变反应中更有用2.用途 补平或标记3 凹端 必须有高浓度dNTP（末端标记）置换反应 必须有高浓度dNTP(一种),末端标记 标记DNA片段 即利用外切活性产生了3凹端 再补平（用标记的dNTP）与切口平移相比有两大优点：不产生发夹结构 经限制酶切割后易变成链特异性探针缺点：标记不均匀，且35外切活性强且快，当外切至中点时必须终止，否则变成二单链，而被降解 将dsDNA变成平端，需高浓度dNTP 定点诱变 在ssDNAdsDNA过程中 由于T4不置换引物，效率提高1倍。四、T7噬菌体DNA聚合酶T7 DNA polymerase来源于T7 phage感染的E.coli,为两种紧密结合

41、的蛋白质复合体(基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白)T7DNApoly为持续合成能力最强的一个 平均长度要大得多,在测序时具有优势活性/功能与T4DNApoly、Klenow类似 但3 5外切活性长Klenow的1000倍修饰的 T7 DNA polymerase99%3-5外切活性被除去（Version1.0）完全除去（V2.0）用于测序反应（测序酶）Sequenase USB Biochemical用途:A.替代T4的功能 B.长模板的引物延伸五、耐热DNA聚合酶简略，详见PCR Taq,Vent,Pfu,Pwo,Tth 等六、反转录酶 Reverse transcriptaseReverse

42、transcriptase依赖于RNA的DNA聚合酶1种类 来自AMV 禽成髓细胞瘤病毒 Mo-MLV(或称M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒5 3合成DNA无3 5外切活性 AMV 二链多肽(62kDa/94kDa),具5 3DNA聚合活性具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA)在反应开始时,引物和mRNA模板杂交体可成为 RNase H 的底物,此时模板的降解和cDNA的合成相竞争反应终止时，Rnase H 可在正在增长的 DNA链近3端切割模板 趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度但在42(鸡的正常体温),能有效发挥DNA合成作用，能有效地拷贝较复杂的mRNA 早期提纯过

43、程中易被内切酶污染,cDNA不超过1kb,现已解决 M-Mulv 单肽 84kDa RNase H 活性弱利于合成较长cDNA纯度高 工程产品42失活2用途 cDNA克隆 测转录起始点（引物延伸法）5突出DNA的补平 测序反应,当用DNApolyI,Klenow或测序酶不理想时 其它 RT-PCR RNA二级结构3.活性 53DNA聚合活性（Mg+）RNA or DNA 模板,带3OH的RNA或DNA引物 RNase H 活性4.注意事项 无3 5外切校正作用，在高dNTP和Mn2+时，每500个bases会有一个误掺入。为防止新合成的DNA提前终止，需高浓度dNTP。单链拷贝，也可双链合成（

44、自身序列为引物，但效率低）,50g/ml 放线菌毒D，抑制第二链合成。七、末端转移酶来源于小牛胸腺,存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNApoly在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端T,C 首选 Co2+A,G首选Mg2+Terminal transferase1.底物DNA,可短至3个核苷酸,3突出低离子强度时,平端或3凹出端DNA 亦可 但效率低2.用途 在3端加同聚尾，cDNA或载体，用于克隆，或标记 末端标记 ddNTP(标记的)37 15min 随时间的延长尾亦长。3.同尾的长度第四节第四节 RNA聚合酶 RNA polymera

45、se来源于噬菌体感染宿主后所产生SP6噬菌体聚合酶:来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株T7或T7噬菌体聚合酶:来源于感染的大肠杆菌1.活性这些RNA聚合酶实际上为转录过程中RNA合成的酶，识别DNA中特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。与DNA聚合酶不同，无需引物，但识别特异性位点2.用途 体外：将这些RNA聚合酶特异性的启动子安装在载体,如pGEM-3Z载体(2.74kb,p13)中，用于体外转录（合成）与外源DNA同源的RNA，从而用作杂交探针，体外翻译系统中的mRNA，体外剪接反应的底物 体内：用于表达外源基因A.Ecoli先构建宿主菌，将T7 poly RNA基因置

46、于 lacUV5 启动子之下，插入到噬菌体中，感染E.coli建立稳定的溶原菌Ecoli BL21(DE3)：lacUV5启动子+T7RNA聚合酶基因，置于噬菌体DE3区，该区整合于染色体的BL21处。若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中在IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导启动外源基因的表达另一种方法是，先导入重组质粒，再用（带T7 RNApoly）感染，激活目的基因的表达B酵母菌酵母启动子+T7 RNApoly in 稳定载体T7启动+外源基因 in 另一载体第五节第五节 连结连结酶(Ligase)将两段核酸连接起来的酶催化DNA 5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二脂

47、键1.T4 DNA ligase 68kDa T4噬菌体感染大肠杆菌产生 底物：DNA or RNA(效率低)粘端，切口，平端 影响因素：PEG（低浓度）10%单价阳离子（150-200mM NaCl）提高平端连接速率 Weiss单位 在37下20min催化1 nmol 32p从焦磷酸根置换到,-32PATP所需的酶量。NEB单位 (New England Biolabs)20l,16,30 min,300g/ml(0.12M 5末端)/HindIII,连接50%所需的酶量/HindIII(7 个切点)23.1 (kb)9.4 6.6 4.4 2.3 2.0 564 (bp)125 48502

48、bp 1 Weiss=67粘端连接单位 (NEB 单位)(Molecular cloning 写为 60 NEB unit)1 NEB单位=0.015 Weiss单位 条件(需ATP)16 4hr 4 overnight5min 连接 T4 DNA ligaseRoom temperature (Boehringer Meinnham 公司)2.E.coli DNA 连接酶与T4DNA ligase相似,但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+)参与平端连接效率低，用于置换合成法作cDNA克隆（不将RNA连接到DNA,不连接RNA）3.Taq DNA连接酶在两个寡核苷酸之间连接同时必须与另一DNA

49、链形成杂交体相当于连接dsDNA中的缺口作用于4565 需NAD+在PCR扩增中引入寡核苷酸不可替代T4 DNA Lisase用于检测等位基因的变化/定点诱变4.T4 RNA 连接酶 催化ss DNA或 RNA的 5-磷酸与 3羟之间形成共价连接DNA DNA 5P +3-OH or pNp RNA RNA用途：标记RNA的 3末端 单链DNA或 RNA连接 合成寡核苷酸第六节第六节 核酸核酸酶(nuclease)一、BAL 31 核酸酶 来源于Alteromonas espej iana BAL3主要活性为3外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3端去掉除单核苷酸，还是一个内切核酸(单链，n

50、ick,gap)依赖 Ca+EGTA可抑制活性 连续去除3端单核苷酸后形成的单链DNA，可被内切核酸活性降解用途：从两头缩短DNA(用于缺失突变等），活性发挥均匀，活性与酶浓度成线性关系确定DNA二级结构DNA限制酶切图注：可能有单链突出，可用DNA poly补平，单链突出的长度与酶浓度有关，如：2-5u/ml,平均有5个bases单链，10-20%保持平端二、Sl核酸酶 来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)降解单链DNA或RNA，产生带5磷酸的单核苷酸或寡核苷酸对dsDNA，dsRNA；DNA:RNA不敏感 酶量大可完全消化双链，中量，可在切口或小缺口处切割双链作用：用于分析