分子生物学ppt课件：转基因.ppt

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1、基因的生物学功能基因的生物学功能鉴定技术鉴定技术 复旦大学复旦大学复旦大学What is gene?基因：基因：是遗传信息的载体是遗传信息的载体 编码编码RNARNA或多肽链的核酸片段或多肽链的核酸片段 控制生物性状的基本遗传单位控制生物性状的基本遗传单位 上游上游增增强强子子启启动动子子ATG外外显显子子1外外显显子子2外外显显子子3外外显显子子4内含子内含子内含子内含子内含子内含子终终止子止子 下游下游增增强强子子TGA5-非翻非翻译译区区3-非翻非翻译译区区调调控区控区 结结构基因构基因终终止区止区 mRNA Protein 执行生物学功能问：问：不同的两个人，若患有同一种疾病，不同的两

2、个人，若患有同一种疾病，致病基因致病基因是否相是否相同同？再问：再问：同卵双生的孪生兄弟，他们患病的机会是否一样，命同卵双生的孪生兄弟，他们患病的机会是否一样，命运是否相同运是否相同？基因功能与人体健康及疾病的关系人类基因组计划（Human Genome Project,HGP）宗旨：测定组成人类染色体中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。人类基因组研究的目的不只是为了读出全部的DNA序列，更重要的是读懂每个基因的功能。如何解读这部天书？在已知的2.5万-3万个人类基因中：大约70%的基因我们还不清楚它们

3、的功能；有90%的基因我们不知道它们在体内的确切生理作用。后人类基因组计划利用各种技术手段研究基因组中功能未知基因的作用。你认为研究基因功能的方法是什么样的呢？你认为研究基因功能的方法是什么样的呢？基因功能获得基因功能获得基基因因敲敲入入转转基基因因技技术术基因功能缺失基因功能缺失基基因因敲敲除除基基因因沉沉默默观察基因在细胞或生物个体中所导致的细胞生物学行为或个体遗传性状的变化，正反两方面对基因的功能进行鉴定。ProteinProteinDNADNARNARNAProteinProteinGeneGenemRNAmRNADNA水平水平 动物或细胞获得新基因或额外拷贝的基因：动物或细胞获得新基

4、因或额外拷贝的基因：（转基因技术）（转基因技术）使相应基因缺失而失活使相应基因缺失而失活:（基因敲除）（基因敲除）mRNA水平：水平：封闭或降解封闭或降解mRNA 反义反义RNA，RNAi 利用生物信息学数据库预测的基因功能利用生物信息学数据库预测的基因功能基因功能的研究是基因功能的研究是2121世纪生命科学研究的重点之一，这对于我们深世纪生命科学研究的重点之一，这对于我们深入理解疾病的发生机理、探索新的治疗途径非常重要！入理解疾病的发生机理、探索新的治疗途径非常重要！基因生物学功能鉴定的基本思路基因生物学功能鉴定的基本思路 第一节第一节 转基因技术转基因技术第二节第二节 基因敲除技术基因敲除

5、技术第三节第三节 RNA 干涉干涉 基因功能的鉴定技术主要方法：主要方法：一、一、哺乳动物细胞的基因转染哺乳动物细胞的基因转染 二、二、转基因动物转基因动物 三、三、基因敲入基因敲入 转基因技术转基因技术必要条件：必要条件：必要条件：必要条件：1.1.目的基因目的基因 (purpose genepurpose gene)2.2.真核表达载体真核表达载体 (expression vectorexpression vector)3.3.宿主细胞宿主细胞 (host cellshost cells)一、哺乳动物细胞的基因转染一、哺乳动物细胞的基因转染 (gene transfection)-细胞水平

6、转基因细胞水平转基因细胞获得新基因、细胞获得额外拷贝的基因，通过细胞生细胞获得新基因、细胞获得额外拷贝的基因，通过细胞生物性状的变化来研究基因的功能。物性状的变化来研究基因的功能。1.1.目的基因目的基因 (purpose genepurpose gene)一、哺乳动物细胞的基因转染一、哺乳动物细胞的基因转染 (gene transfection)一、哺乳动物细胞的基因转染一、哺乳动物细胞的基因转染 (gene transfection)2.2.真核表达载体真核表达载体 (expression vectorexpression vector)复制起始点，筛选标记：真核筛选标记基因多克隆酶切位点

7、：目的基因序列：起始密码和终止密码必要的顺式作用元件如:真核启动子,Kozak 序列等Kozak 序列：是真核核糖体高效率起始翻译所必需的序列。+4G 和-3A 对于核糖体识别AUG 有显著的促进作用，是翻译起始所必需的。Kozak sequenceCoding sequence(gcc)gccRccATGG-TAA-6-5-4-3-2-1+1+2+3+4一般是嘌呤一般是嘌呤(A 或或G)一、哺乳动物细胞的基因转染一、哺乳动物细胞的基因转染 (gene transfection)3.宿主细胞：宿主细胞：哺乳动物细胞哺乳动物细胞瞬时转染：瞬时转染：外源基因外源基因存在于游离的载体上存在于游离的载

8、体上，可表达但不被复制，可表达但不被复制，表达通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中丢失为表达通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中丢失为止。止。稳定转染：稳定转染：在少数转染细胞中，在少数转染细胞中，外源基因可整合到细胞的基因外源基因可整合到细胞的基因组中组中，成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这是稳定转染，成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这是稳定转染细胞的标志。子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转细胞的标志。子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。染的细胞系。外源外源DNA导入哺乳细胞有两种类型：导入哺乳细胞有两种类型：选稳定转染，还是瞬时转染呢？这要

9、看我们打算进行长期研究还是短期实验。举例：将举例：将GFPGFP（绿色荧光蛋白基因）转入乳腺癌细胞（绿色荧光蛋白基因）转入乳腺癌细胞荧光显微镜观察荧光显微镜观察PEnhancer NeoR 拓展内容拓展内容：蛋白：蛋白质分子分子间相互作用相互作用n荧光共振能量转移荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)n传统研究方法：传统研究方法：酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等。荧光、放射性标记等。nFRET:FRET:在活细胞中对蛋白质实时进行动态检测。在活细胞中对蛋白质实时进行动态检测。FRET

10、技技术基本原理基本原理n荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRET):FRET):是指两个荧光发色基是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生荧光共振能量转移）。的受体分子转移（即发生荧光共振能量转移）。FRET 发生必生必备条件条件1.1.供体和受体的激供体和受体的激发光要能分的足发光要能分的足够开；够开；2.2.供体的发射光谱供体的发射光谱与

11、受体的吸收光与受体的吸收光谱要重叠谱要重叠 nCFPCFP吸收波长吸收波长433nm433nmnCFPCFP发射波长发射波长476nm476nmnYFPYFP发射波长发射波长527nm527nmCFP&YFP荧光参数光参数设置置H9c2细胞细胞PKC-YFP与与Cav-3-CFP表达表达20 二、二、转基因动物转基因动物主要内容：主要内容：概念概念 制作过程制作过程 应用应用 存在问题存在问题*母鼠注射激素，受精卵超排收集胚胎胚胎操作DNA载体线性化，胶回收，纯化雄鼠结扎假孕鼠胚胎移植PCR/Southernblot基因型鉴定转基因小鼠育种基本流程示意图基本流程示意图转基因技术（转基因技术（t

12、ransgenic technologytransgenic technology）是指将外源基是指将外源基因导入因导入受精卵受精卵或或胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonic stem cellembryonic stem cell，即，即ESES细细胞），通过胞），通过随机重组随机重组使外源基因插入细胞染色体使外源基因插入细胞染色体DNADNA。随后将受精卵或随后将受精卵或ESES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得细胞植入假孕受体动物的子宫，使得转基因细胞发育成转基因细胞发育成携带外源基因携带外源基因，并能，并能稳定遗传稳定遗传的动物的动物。转基因动物（转基因动物（transgenic an

13、imaltransgenic animal）指应用转基因技术培指应用转基因技术培育出的育出的携带外源基因携带外源基因，并能，并能稳定遗传稳定遗传的动物。的动物。转基因小鼠最为转基因小鼠最为常见。常见。*1 1.概念概念 转基因载体的构建转基因载体的构建将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞将转基因将转基因ES细胞或受精卵细胞移植胚泡中细胞或受精卵细胞移植胚泡中将转基因胚泡移植入假孕小鼠的子宫腔中将转基因胚泡移植入假孕小鼠的子宫腔中鉴定并筛选转基因小鼠鉴定并筛选转基因小鼠2.转基因动物的制备基本流程转基因动物的制备基本流程*2.转基因动物的制备基本流程转基因动物的制备基

14、本流程*（1 1）转基因表达载体的构建）转基因表达载体的构建 Ptarget geneEnhancer NeoR 将目的基因通过转基因技术整合到小鼠的染色体中，从而将目的基因通过转基因技术整合到小鼠的染色体中，从而获得携带目的基因的转基因小鼠。获得携带目的基因的转基因小鼠。2.转基因动物的制备基本流程转基因动物的制备基本流程*(2)胚胎操作和显微注射：将外源基因导入受精卵（或ES cell）细胞核内受精卵（或受精卵（或ES cell）具有全能性。）具有全能性。具有的分化成机体所有类型细胞和形成完全胚胎的能力。具有的分化成机体所有类型细胞和形成完全胚胎的能力。两种方法：两种方法：原核显微注射法原

15、核显微注射法胚胎干细胞法胚胎干细胞法pronucleipronucleiFertilized eggFertilized egg原核显微注射法原核显微注射法注射的外源基因融合到受精卵的基因组中。外源基因直接注射到雄性前核中优点：优点：1 1.可导入基因片段较长可导入基因片段较长2 2.外源基因整合于所有组织细胞中的概率高外源基因整合于所有组织细胞中的概率高缺点：缺点：1 1.整合率随机整合率随机2.2.有些动物的原核看不清，需经特殊处理才能有效导入有些动物的原核看不清，需经特殊处理才能有效导入3.3.需要精密仪器，费用昂贵需要精密仪器，费用昂贵原核显微注射法特点原核显微注射法特点胚胎干细胞法胚

16、胎干细胞法 胚胎干细胞是从着床前的胚胎中分离的多能干细胞，胚胎干细胞是从着床前的胚胎中分离的多能干细胞，它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官器官，包括生殖细胞。器官，包括生殖细胞。ES cellsES cells注射的外源基因通过随机插入或者同源重组整合到胚胎干细胞的基因组中。把转基因胚胎干细胞移植入正常发育的囊胚中Inner cell massInner cell mass1)Original inner cell mass2)Injected transfectant ES cells.There are two diff

17、erent There are two different inner cell mass in one inner cell mass in one blastocyst after injection.blastocyst after injection.胚胎干细胞法特点胚胎干细胞法特点优点：优点：可用多种方法将外源基因导入可用多种方法将外源基因导入ESES细胞，其细胞的鉴定和细胞，其细胞的鉴定和筛选比较方便筛选比较方便缺点：缺点：后代多为嵌合体，所需时间长后代多为嵌合体，所需时间长ESES细胞系培养、保存和维持不易。细胞系培养、保存和维持不易。2.转基因动物的制备基本流程转基因动物的制备

18、基本流程*Psuedopregnantmouse(3)整合外源基因的早期胚胎移植入假孕小鼠的子宫腔中；移植入的胚胎干细胞与囊胚细胞一起分化发育成相应的组织和器官，最后产生出具有转入基因功能的嵌合体。Inner cell massInner cell mass2.转基因动物的制备基本流程转基因动物的制备基本流程*(4)通过杂合子后代交配，获得纯合子转基因动物通过杂合子后代交配，获得纯合子转基因动物胚胎干细胞保持分化的全能性，可以发育成为生殖细胞。嵌合鼠的生殖细胞中含有的转基因，可以代代相传。胚胎干细胞法生产转基因动物示意图胚胎干细胞法生产转基因动物示意图用什么方法可以鉴定转基因小鼠？用什么方法可

19、以鉴定转基因小鼠？要求：要求：确定转基因是否存在确定转基因是否存在转基因整合到染色体的转基因整合到染色体的拷贝数拷贝数思考思考1：用什么方法可以鉴定转基因小鼠？用什么方法可以鉴定转基因小鼠？思考思考1：方法方法1 1：qPCRqPCR尾静脉采血尾静脉采血-提取小鼠基因组提取小鼠基因组-扩增目的基因扩增目的基因-PCR检测是否存在（定性）检测是否存在（定性）-qPCR鉴定目的基因的拷贝数鉴定目的基因的拷贝数引物如何设计？引物如何设计？方法方法2.Southern blot2.Southern blot 尾静脉采血尾静脉采血-提取小鼠基因组提取小鼠基因组-Southern-Southern blo

20、tblot 检测。检测。核酸探针的选择：核酸探针的选择：核酸探针的序列选取核酸探针的序列选取(转基因序列？阳性筛选标记基因序列转基因序列？阳性筛选标记基因序列?)思考思考1：如果将外源基因导入小鼠受精卵,则外源基因可能随机插入到小鼠受精卵DNA中.这种受精卵有的可发育成转基因小鼠,有的却死亡.请分析因外源基因插入导致受精卵死亡的最可能原因是_外源基因的插入使受精卵内生命活动必需的某些基外源基因的插入使受精卵内生命活动必需的某些基因不能正常表达因不能正常表达转基因动物存在的问题(1)随机插入，可能破坏抑癌基因等宿主基因；(2)外源基因整合到宿主染色体上的拷贝数不确定；(3)整合外源基因遗传丢失而

21、导致转基因动物症状不稳定遗传。基因敲入（gene knock-in）是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。基因敲入是基因打靶技术的一种。如何解决？基因敲入基因敲入 基因敲入把胚胎干细胞技术和基因敲入把胚胎干细胞技术和DNADNA同源重组技术结合同源重组技术结合起来，实现对染色体上某一基因的定向修饰和改造。起来，实现对染色体上某一基因的定向修饰和改造。胚胎干细胞技术和胚胎干细胞技术和DNADNA同源重组技术结合起来同源重组技术结合起来转基因技术的应用转基因技术的应用(1)(1)基因功能的研究基因功能的研究(2)(2)动物

22、模型动物模型 ：人乳化牛：人乳化牛/羊，生物反应器羊，生物反应器(3)(3)改良动物（植物）品种改良动物（植物）品种？基因功能的研究-生长激素（rGH）1982年美国哈佛大学的一个科学家小组，将大鼠的生长激素（rGH）基因与小鼠的金属硫蛋白基因的启动子顺序连接，再引入质粒中。科学家把这种重组的质粒直接注射入小鼠受精卵中，经过充分发育后终于分娩出了21小鼠，其中有七只带有融合基因，六只生长迅速，每只体重平均可达44g，超过同窝无融合基因小鼠（平均体重29g）的1.5倍，这就是闻名于世的“超级小鼠”。转基因小鼠转基因小鼠A A的生长的生长速度要比普通小鼠速度要比普通小鼠B B的生长速度平均快的生长

23、速度平均快50%50%。动物模型动物模型-举例举例1 1：人乳化的羊奶：人乳化的羊奶-羊乳汁中可分羊乳汁中可分泌人乳球化蛋白泌人乳球化蛋白“人乳化人乳化”奶是最好的奶是最好的医用营养保健品医用营养保健品动物模型动物模型-举例举例2 2：携带人血清白蛋白的基因的转基因牛携带人血清白蛋白的基因的转基因牛改良动物（植物）品种改良动物（植物）品种-转基因棉花植物的制造过转基因棉花植物的制造过程程【重点内容】1、定义 *转基因技术（转基因技术（transgenic technologytransgenic technology）是指将外源基是指将外源基因导入因导入受精卵受精卵或或胚胎干细胞胚胎干细胞（e

24、mbryonic stem cellembryonic stem cell，即，即ESES细细胞），通过胞），通过随机重组随机重组使外源基因插入细胞染色体使外源基因插入细胞染色体DNADNA。随后将受精卵或随后将受精卵或ESES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得细胞植入假孕受体动物的子宫，使得转基因细胞发育成转基因细胞发育成携带外源基因携带外源基因，并能，并能稳定遗传稳定遗传的动物的动物。转基因动物（转基因动物（transgenic animaltransgenic animal）指应用转基因技术培指应用转基因技术培育出的育出的携带外源基因携带外源基因，并能，并能稳定遗传稳定遗传的动物。的动物。转基因小鼠最为转基因小鼠最为常见。常见。*2、基本流程 *转基因载体的构建转基因载体的构建将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞将转基因将转基因ES细胞或受精卵细胞移植胚泡中细胞或受精卵细胞移植胚泡中将转基因胚泡移植入假孕小鼠的子宫腔中将转基因胚泡移植入假孕小鼠的子宫腔中鉴定并筛选转基因小鼠鉴定并筛选转基因小鼠