抗生素类药物的分析1.pptx

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1、 定义：抗生素是生物（动物、植物和微生物）在其生命活动中产生的（或并用化学、生物或生化方法衍生的），在低微浓度下有选择性地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。来源：生物合成（发酵）化学合成或半合成第一节第一节 概概 述述 第1页/共129页一、特点1.化学纯度低：同系物多、异构体多、降解产物多2.活性组分易变异：菌株变化、发酵条件改变3.稳定性差（本身分子结构不稳定，易分解，使疗效降低或失效甚至产生毒副作用）第2页/共129页二.分类l 内酰胺类内酰胺类内酰胺类内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类青霉素类、头孢菌素类)l l 氨基糖苷类氨基糖苷类氨基糖苷类氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、依替米星链

2、霉素、庆大霉素、依替米星)l l 四环素类四环素类四环素类四环素类(四环素、金霉素、土霉素四环素、金霉素、土霉素)l 大环内酯类大环内酯类大环内酯类大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素)l 多烯大环类多烯大环类多烯大环类多烯大环类(制霉菌素、两性霉素制霉菌素、两性霉素B)l 多肽类多肽类多肽类多肽类(多黏菌素、放线菌素多黏菌素、放线菌素)l l 酰胺醇类抗生素酰胺醇类抗生素酰胺醇类抗生素酰胺醇类抗生素（氯霉素）（氯霉素）l l 抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素（有丝裂霉素、盐酸多柔比星）（有丝裂霉素、盐酸多柔比星）l l 其它抗生素其它抗生素其它抗生

3、素其它抗生素：盐酸克林霉素、盐酸林可霉素等。：盐酸克林霉素、盐酸林可霉素等。1.1.根据产生抗生素的生物来源分类根据产生抗生素的生物来源分类2.2.根据抗生素的作用对象分类根据抗生素的作用对象分类3.3.根据抗生素的作用机制分类根据抗生素的作用机制分类4.4.根据抗生素的化学结构分类根据抗生素的化学结构分类第3页/共129页（一）鉴别（一）鉴别1.1.理化方法理化方法（1 1）官能团显色反应）官能团显色反应（2 2）光谱法）光谱法 （3 3）色谱法）色谱法2.2.生物学法生物学法三、抗生素的质量分析第4页/共129页1.影响药物稳定性的项目影响药物稳定性的项目酸碱度、水分等。酸碱度、水分等。2

4、影响药物纯度的项目影响药物纯度的项目溶液澄清度与颜色、有关物溶液澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属、吸光度等。质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属、吸光度等。3.与临床安全性密却相关的项目：与临床安全性密却相关的项目：异常毒性、热原异常毒性、热原或细菌内毒素、降压物质、无菌等。或细菌内毒素、降压物质、无菌等。4.其它其它：如注射用普鲁卡因青霉素还规定了悬如注射用普鲁卡因青霉素还规定了悬浮时间与抽针试验等。浮时间与抽针试验等。（二）检查（二）检查第5页/共129页青霉素钠青霉素钠Ch.P.（2010）结晶性结晶性酸碱度酸碱度溶液的澄清度与颜色溶液的澄清度与颜色吸光度吸光度有关物质有关物

5、质青霉素聚合物青霉素聚合物干燥失重干燥失重可见异物可见异物不溶性微粒不溶性微粒细菌内毒素细菌内毒素无菌无菌第6页/共129页（三）含量测定方法（三）含量测定方法1.抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法药典附录药典附录测定抗生素抑菌或杀菌的能力优点优点与临床要求一致与临床要求一致灵敏度高、用量少灵敏度高、用量少适用范围广，可用于未知药物适用范围广，可用于未知药物缺点缺点操作繁琐、测定时间长、操作繁琐、测定时间长、测定误差大测定误差大第7页/共129页2.理化方法以理化方法测定抗生素的效价以理化方法测定抗生素的效价适用于纯度较高的结构确定的抗生素适用于纯度较高的结构确定的抗生素优点优点1.1.准确

6、度高准确度高2.2.简单、快速简单、快速1.1.不一定代表生物效价不一定代表生物效价2.2.易受杂质干扰易受杂质干扰缺点缺点3.抗生素活性表示方法以效价表示，即指每毫升或每毫克中含有抗生以效价表示，即指每毫升或每毫克中含有抗生素的有效成分的多少。素的有效成分的多少。第8页/共129页磺苄西林钠Ch.P.（2010）【含量测定】精密称取本品适量，用灭菌水制成每1ml中约含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法（附录A）测定。1000磺苄西林单位相当于1mg的C16H18N2O7S2。第9页/共129页第二节第二节 -内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 主要药物：主要药物：青霉素类青霉素类头孢菌素类头

7、孢菌素类第10页/共129页青霉素类头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻嗪环 -内酰胺环第11页/共129页青霉素类青霉素类6-氨基青霉烷酸（6APA）*手性C酸性不稳定酰胺侧链第12页/共129页青霉素（苄青霉素）包括青霉素钾、青霉素钠、普鲁卡因青霉素。包括青霉素钾、青霉素钠、普鲁卡因青霉素。包括青霉素钾、青霉素钠、普鲁卡因青霉素。包括青霉素钾、青霉素钠、普鲁卡因青霉素。第13页/共129页氨苄西林（氨苄青霉素）.第14页/共129页阿莫西林（羟氨苄青霉素）.第15页/共129页磺苄西林钠（磺苄青霉素钠）第16页/共129页头孢菌素类头孢菌素类7-氨基头孢菌烷酸（7ACA）*手性C酸性酰胺侧链不稳定U

8、V第17页/共129页头孢氨苄.头孢羟氨苄头孢拉定头孢噻吩钠第18页/共129页一、性质1.1.酸性酸性游离羧基酸性，易与碱成盐。游离羧基酸性，易与碱成盐。2.2.旋光性旋光性 -手性碳手性碳3.3.紫外吸收特性紫外吸收特性青霉素母核无吸收，但通常其侧链有吸青霉素母核无吸收，但通常其侧链有吸收；头孢菌素母核收；头孢菌素母核O=C-N-C=CO=C-N-C=C，在，在260nm260nm处强吸收。处强吸收。第19页/共129页20第20页/共129页4.4.稳定性稳定性 -内酰胺环为四元环，张力大，且内酰胺环为四元环，张力大，且酰胺键易水解，不稳定。酰胺键易水解，不稳定。稳定性与含水量和纯度相关

9、。稳定性与含水量和纯度相关。在水溶液中，易受酸、碱、酶、在水溶液中，易受酸、碱、酶、金属离子或氧化剂的影响，发生水解和金属离子或氧化剂的影响，发生水解和分子重排。分子重排。第21页/共129页22温度温度氧化剂氧化剂（头孢噻吩钠水溶液2524h失活8%）（青霉素钠水溶液3024h失活56%）Cu2+、Pb2+、Hg2+、Ag+第22页/共129页23不同不同pH条件下青霉素钠降解情况条件下青霉素钠降解情况240.41.4129233621812531.29.31.4半衰期(h)234567891011pH第23页/共129页青霉素的降解反应青霉素的降解反应青青霉霉素素青霉噻唑酸青霉噻唑酸H2O

10、/OH青霉素酶青霉素酶青霉酸青霉酸pH2100青霉噻唑酰青霉噻唑酰基羟胺酸基羟胺酸NH2OH青霉烯酸青霉烯酸pH4青霉胺青霉胺CO2青霉醛青霉醛HgCl2第24页/共129页二、鉴别本类药物的鉴别试验，国内外药典中主要采用的方法为IR、HPLC、TLC法。（一）色谱法（一）色谱法1.TLC与对照品比较Rf值与斑点颜色2.HPLC与对照品比较tR值第25页/共129页（二）光谱法（二）光谱法1.IR法特征官能团：酰胺-内酰胺2.UV法第26页/共129页青霉素钠第27页/共129页1.羟肟酸铁反应内酰胺OH-呈色Fe3+H+（三）呈色反应（三）呈色反应头孢哌酮Ch.P.（2010）【鉴别】（1）

11、取本品约10mg，加水2ml与盐酸羟胺溶液3ml，振摇溶解后，放置5分钟，加酸性硫酸铁铵试液1ml，摇匀，显红棕色。红棕色。第28页/共129页2.茚三酮反应注射用头孢拉定Ch.P.（2010）TLC鉴别显色剂:茚三酮第29页/共129页3.三氯化铁反应酚羟基偶合呈色三氯化铁三氯化铁头孢羟氨苄Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品适量，加水适量超声使溶解并稀释制成每1ml中约含12.5mg的溶液，取溶液1ml，加三氯化铁试液3滴，即显棕黄色。第30页/共129页4.各种盐的反应焰色鲜黄色+醋酸氧铀锌黄Na+焰色紫色+0.1%四苯硼钠+Ac白K+K+、Na+反应反应第31页/共129页（一）

12、聚合物 1.1.定义定义 高分子杂质指抗生素药品中分子量高分子杂质指抗生素药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。分子量一般在大于药物本身的杂质的总称。分子量一般在1000100050005000道尔顿，个别可至道尔顿，个别可至1000010000道尔顿。道尔顿。分为分为内源性和外源性内源性和外源性杂质。杂质。三、检查第32页/共129页33例青霉素钠【检查】青霉素聚合物青霉素钾【检查】青霉素聚合物阿莫西林【检查】阿莫西林聚合物（青霉噻唑蛋白+青霉素、青霉噻唑多肽类）头孢他啶【检查】头孢他啶聚合物头孢曲松钠【检查】头孢曲松聚合物头孢哌酮钠【检查】头孢哌酮聚合物第33页/共129页外源性杂质：包括

13、蛋白、多肽、多糖类杂质或其与抗生素的结合物。主要来于自发酵工艺。内源性杂质：自身聚合物。生产或贮藏过程中产生。2.2.来源来源3.3.高分子杂质的分类高分子杂质的分类 （1）青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽（2）青霉素聚合物（3）头孢菌素聚合物第34页/共129页354.4.分析方法分析方法 反相色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法（分子排阻色谱法）第35页/共129页聚合物检查方法：聚合物检查方法：多用分子排阻色谱法。即根据分子量差异进行分离的凝胶色谱法。凝胶色谱具有分子筛的作用，让药物分子自由的进入凝胶颗粒表面，而高分子杂质被排阻，不能进入颗粒内部；色谱过程中凝胶对药物的吸附作用大于对高分子杂质的

14、吸附作用，可使高分子杂质与药物分离。第36页/共129页37第37页/共129页38高分子杂质定量测定法：1.主成分自身对照法 2.面积归一化法3.限量法4.自身对照外标法第38页/共129页-内酰胺类抗生素的高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性，故无法制备内酰胺类抗生素的高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性，故无法制备对照品，不能采用对照品法定量。对照品，不能采用对照品法定量。在以水，在以水，0.01%SDS或或0.5%葡萄糖溶液作为流动相时，葡萄糖溶液作为流动相时，-内酰胺类抗生素可内酰胺类抗生素可缔合形成表观分子量较大的缔合物，该缔合物在缔合形成表观分子量较大的缔合物，该缔合物在Se

15、phadexG10凝胶色谱系统中的凝胶色谱系统中的色谱行为与高分子杂质一样，表现为单一的色谱峰。利用这一特点，在色谱行为与高分子杂质一样，表现为单一的色谱峰。利用这一特点，在SephadexG10凝胶色谱系统中制定了新的定量方法凝胶色谱系统中制定了新的定量方法-自身对照外标法。自身对照外标法。第39页/共129页40例例11青霉素钠青霉素钠Ch.P.（2010）【检查】青霉素聚合物照分子排阻色谱法（附录H）测定。填充剂葡聚糖凝胶G-10（40120m）流动相A0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）0.1mol/LNa2HPO4-0.1mol/LNaH2PO4（61:39)流动相B水流速1.

16、5ml/min波长254nmn700（按蓝色葡聚糖2000计）杂质限量0.08%第40页/共129页头孢呋辛酯-HPLC异构体规定峰面积大小比值有关物质主成分自身对照法（二）异构体和有关物质第41页/共129页（三）2-乙基己酸-内酰胺环制备过程中，采用游离酸与内酰胺环制备过程中，采用游离酸与2-乙基乙基己酸钠作用生成钠盐，并在己酸钠作用生成钠盐，并在2-乙基己酸中直接析乙基己酸中直接析出钠盐结晶，易残留出钠盐结晶，易残留2-乙基己酸。乙基己酸。检查方法：GC（杂质对照品法）第42页/共129页头孢哌酮钠头孢哌酮钠Ch.P.（2010）【检查检查】吸光度吸光度吸光度吸光度取本品约取本品约1g精

17、密称定，置精密称定，置10ml量瓶量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照紫外中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光可见分光光度法（附录光度法（附录A），在），在430nm的波长处测定吸光度，的波长处测定吸光度，不得大于不得大于0.15。（四）吸光度（五）有机溶剂部分药物需检查有机溶剂。部分药物需检查有机溶剂。第43页/共129页（六）结晶性固态物质分为结晶质和非结晶质两大固态物质分为结晶质和非结晶质两大类，可用下列方法检查物质的结晶性。类，可用下列方法检查物质的结晶性。（1）偏光显微镜法；）偏光显微镜法；（2）X射线粉末衍射法。射线粉末衍射法。（七）水分影响稳定性的重要因素影响稳定性

18、的重要因素。（八）其他特殊杂质第44页/共129页头孢克洛含量测定Ch.P.（2010）【含量测定】填充剂十八烷基硅烷键合硅胶流动相磷酸二氢钾溶液乙腈（928）（pH3.4)对照品头孢克洛（含头孢克洛-3-异构体）两者分离度应大于1.5四、含量测定（一）高效液相色谱法第45页/共129页（二）碘量法原理：原理：内酰胺类不直接与碘反应；内酰胺类不直接与碘反应；内酰胺类水解产物可与碘发生定量反应。内酰胺类水解产物可与碘发生定量反应。第46页/共129页反应分两步进行：应：严格控制反应条件应：严格控制反应条件 采用标准品平行操作采用标准品平行操作 （2）氧化-还原反应（无固定量关系，易受温度、pH值

19、和时间等因素影响）（1）水解反应（按化学计量进行）青霉素中本身含有降解杂质，或样品中含其它杂质，可能消耗碘，碘挥发也带来损失。以未经水解的样品做空白。以未经水解的样品做空白。第47页/共129页方法：方法：供试液供试液+缓冲液+碘液+回滴（空白）+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴对照液对照液+缓冲液+碘液+回滴（空白）+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴 要求做空白及应与标准对照平行测定要求做空白及应与标准对照平行测定第48页/共129页测定条件（1）必须碱性水解完全后才能测定（2）该法用不加碱水解的样品作空白，可消除降解产物及其他耗碘杂质的干扰（3）1mol样品消耗4mol I2，灵敏度高（4）碘与青霉噻

20、唑酸作用以pH4.5，温度在2426为好（5）采用对照品平行测定 第49页/共129页（三）汞量法水解水解水解水解青霉胺络汞第50页/共129页1.1.原理原理 青霉素分子不与汞盐反应，但其碱水解产物青霉噻唑酸及继续水解产物青霉胺都可与汞盐定量反应，根据消耗的汞盐量可计算青霉素的含量 第51页/共129页2.2.测定方法测定方法（1 1 1 1）样品测定）样品测定）样品测定）样品测定第52页/共129页（2 2 2 2）降解物测定）降解物测定）降解物测定）降解物测定 第53页/共129页3.测定条件（1）第二次突跃为终点，反应摩尔比11（2）水解必须完全（3）该法用不加碱水解的样品作空白，可消

21、除降解产物的干扰（4）本法的优点是不需要对照品对照 第54页/共129页（四）硫醇汞盐法325-345nm处最大吸收（咪唑）（咪唑）第55页/共129页（五）酸碱滴定法过量的NaOH以盐酸滴定第56页/共129页酸碱滴定法（水解后剩余滴定法）1.原理 青霉素或头孢菌素可被碱水解，并青霉素或头孢菌素可被碱水解，并且碱性水解定量完成。且碱性水解定量完成。第57页/共129页2.测定条件（1）所用的水必须是新沸的，临用时用氢氧化钠液调至pH8（2）测定中避免吸收空气中的二氧化碳 第58页/共129页59第二节第二节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素一、化学结构与性质一、化学结构与性质1.1.化学结构

22、化学结构碱性环己多元醇第59页/共129页60链霉素streptomycin（碱性环己多元醇）链霉胍链霉糖N-甲基葡萄糖胺（氨基糖）链霉双糖胺第60页/共129页第61页/共129页庆大霉素gentamycin（复合物）（氨基糖）绛红糖胺（氨基糖）加洛糖胺脱氧链霉胺（碱性环己多元醇）第62页/共129页庆大霉素C复合物庆大霉素C1R1、R2=CH3R3=H庆大霉素C2R1=CH3R2=R3=H庆大霉素C1aR1、R2、R3=H庆大霉素C2aR1=R2=HR3=CH3第63页/共129页64巴龙霉素paromomycin（碱性环己多元醇）脱氧链霉胺D-核糖D-葡萄糖胺（氨基糖）巴龙霉糖（氨基糖）

23、巴龙胺巴龙二糖胺第64页/共129页65奈替米星netilmicin脱氧链霉胺（碱性环己多元醇）（氨基糖）绛红糖胺（氨基糖）加洛糖胺第65页/共129页662.2.性质性质（1）溶解性与碱性溶解性水溶性（多-OH）碱性-NH2可与酸成盐临床上多用硫酸盐第66页/共129页67（2）旋光性）旋光性手性手性C硫酸庆大霉素硫酸庆大霉素硫酸巴龙霉素硫酸巴龙霉素硫酸卡那霉素硫酸卡那霉素50mg/ml水溶液水溶液第67页/共129页68（3）稳定性链霉素链霉素pH5-7.5pH5-7.5稳定稳定OH-葡萄糖胺链霉糖OH-麦芽酚反应坂口反应第68页/共129页坂口反应麦芽酚反应第69页/共129页70链霉素

24、（4）UV链霉素max=230nm第70页/共129页71（一）茚三酮反应（一）茚三酮反应 -氨基醇、羟基胺类蓝紫色二、鉴别试验二、鉴别试验第71页/共129页茚三酮茚三酮-氨基、伯胺氨基、伯胺某些羟基胺类某些羟基胺类酮式酮式烯醇式烯醇式+缩合缩合第72页/共129页73例硫酸小诺霉素Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约5mg，加水溶解后，加0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，在水浴中加热5分钟，即显蓝紫色。第73页/共129页74（二）（二）Molisch反应反应水解水解或蒽酮或蒽酮第74页/共129页751.-萘酚呈色原理萘酚呈色原理2.蒽酮呈色原理第75页/共

25、129页例阿米卡星Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约10mg，加水1ml溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即显蓝紫色。第76页/共129页77（三）（三）N-甲基葡萄糖胺反应甲基葡萄糖胺反应乙酰丙酮乙酰丙酮 OH-吡咯衍生物吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛 H+樱桃红色樱桃红色（Elson-Morgan反应）反应）水解第77页/共129页对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛H+Elson-Morgan反应OH-(缩合)乙酰丙酮第78页/共129页例硫酸新霉素Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约10mg，加水1ml溶解后，加盐酸溶液（9100）2ml，在水浴中加热1

26、0分钟，加8%氢氧化钠溶液2ml与2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加热5分钟，冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液1ml，即显樱桃红色。第79页/共129页（四）麦芽酚（四）麦芽酚（Maltol）反应）反应链霉素特征反应链霉素特征反应H+紫红色紫红色第80页/共129页81Maltol反应H+Fe3+分子重排麦芽酚麦芽酚第81页/共129页82例硫酸链霉素Ch.P.（2010）【鉴别】（2）取本品约20mg，加水5ml溶解后，加氢氧化钠试液0.3ml，置水浴上加热5分钟，加硫酸铁铵溶液（取硫酸铁铵0.1g，加0.5mol/L硫酸溶液5ml使溶解）0.5ml，即显紫红色。第82页/共129页83（五

27、）坂口（五）坂口（Sakaguchi）反应）反应链霉胍特有反应链霉胍特有反应水解橙红色次溴酸钠次溴酸钠8-羟基喹啉羟基喹啉（或-萘酚）第83页/共129页84SakaguchiSakaguchi反应反应反应反应+第84页/共129页例硫酸链霉素Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约0.5mg，加水4ml溶解后，加氢氧化钠试液2.5ml与0.1%8-羟基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至约15，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色。第85页/共129页（七）色谱法（七）色谱法TLC、HPLC法（八）光谱法（八）光谱法IR、UV法（六）硫酸盐反应（六）硫酸盐反应多为硫酸盐，显硫酸盐的鉴别反应。见Ch.P

28、.（2010）附录。第86页/共129页例庆大霉素BP（2010）取硫酸庆大霉素10mg，加水1ml和40%的硫酸溶液5ml，在水浴中加热100分钟，冷却，用水稀释至25ml。取该溶液进行紫外扫描，在240-330nm范围应无最大吸收。第87页/共129页三、有关物质及组分分析三、有关物质及组分分析（一）有关物质（二）硫酸盐测定EDTA测定法或HPLC法（三）组分测定第88页/共129页89庆大霉素C1、C2、C1a*对微生物的活性无明显差异*毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致组分比例不一致规定各组分的相对百分含量规定各组分的相对百分含量Ch.P.、BPUSPHPLC法法

29、庆大霉素庆大霉素C组分测定组分测定第89页/共129页C125%-50%C1a15%-40%C2a+C220%-50%要求：方法：HPLC第90页/共129页庆大霉素本身无紫外吸收，可衍生化max=330nmmax=330nmpH10.4巯基醋酸1.HPLC（紫外检测）（紫外检测）USP(29)、Ch.P(2000)第91页/共129页92第92页/共129页932.离子对HPLC法（电化学检测器）BP（2005）3.HPLC法（蒸发光散射检测器）法（蒸发光散射检测器）Ch.P.（2010）第93页/共129页硫酸庆大霉素Ch.P.（2010）【检查】庆大霉素C组分照高效液相色谱法（附录D）测

30、定。填充剂十八烷基硅烷键合硅胶(pH0.88.0)流动相0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92:8）检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器标准品庆大霉素、小诺霉素小诺霉素与庆大霉素各组分峰应满足分离度要求。第94页/共129页95硫酸庆大霉素硫酸庆大霉素C组分的组分的HPLC-ELSD色谱图色谱图庆大霉素标准品（庆大霉素标准品（A）及其样品（）及其样品（B）的）的HPLC-ELSD色谱图色谱图1-硫酸盐；硫酸盐；2-庆大霉素庆大霉素C1a；3-庆大霉素庆大霉素C2；4庆大霉素庆大霉素C2b；5-庆大霉素庆大霉素C2a；6-庆大霉素庆大霉素C1；7-未知杂质未知杂质AB第95页/共129页蒸发光散

31、射检测器（EvaporativeLight-scatteringDetector）是质量型检测器，只与待测物质的量相关，无所谓其光学性质或电化学性质。因此对于许多没有光学吸收特征的生物性物质的检测，蒸发光散射检测器提供了新一代的检测方法。第96页/共129页三、含量测定三、含量测定主要用微生物检定法。部分药物采用HPLC法。例硫酸链霉素Ch.P.（2010）【含量测定】精密称取本品适量，加灭菌水定量制成每1ml中约含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法（附录A）测定，1000链霉素单位相当于1mgC21H38N7O12。第97页/共129页第四节第四节 四环素类抗生素四环素类抗生素一、化学

32、结构与性质一、化学结构与性质（一）化学结构（一）化学结构ABCD第98页/共129页432156789101112碳原子编号碳原子编号第99页/共129页四环素（TC）tetracycline第100页/共129页101金霉素（CTC）chlortetracycline氯四环素第101页/共129页102土霉素（OTC）oxytetracycline氧四环素第102页/共129页103多西环素（DOTC）doxycycline强力霉素脱氧土霉素第103页/共129页104美他环素（METC）metacycline第104页/共129页105两性弱酸性、UV、旋光性弱碱性第105页/共129页二

33、甲胺基弱碱性酚羟基、烯醇型羟基弱酸性1.酸碱性（二）性质（二）性质 两性溶解性第106页/共129页2.旋光性手性C3.UV共轭体系4.与金属离子生成有色配位化合物与金属离子生成有色配位化合物酚羟基、烯醇基酚羟基、烯醇基Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+第107页/共129页108pH37.5有强烈荧光第108页/共129页109（1）差向异构化）差向异构化5.不稳定性第109页/共129页110土霉素、多西环素不易差向异构化土霉素、多西环素不易差向异构化第110页/共129页111（2）降解性质A.酸性降解第111页/共129页112第112页/共129页113pH2pH2第113页/共

34、129页114B.碱性降解（荧光）（荧光）第114页/共129页二、鉴别二、鉴别（一）（一）HPLC法法例盐酸土霉素Ch.P.（2010）【鉴别】（2）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致第115页/共129页（二）（二）TLC法法固定相：硅藻土EDTA：克服痕量金属离子存在引起的拖尾现象。黏合剂：EDTA+甘油流动相：含EDTA第116页/共129页例盐酸土霉素Ch.P.（2010）【鉴别】（2）取本品与土霉素对照品，分别加甲醇制成每1ml中含1mg的溶液；另取土霉素与盐酸四环素对照品，加甲醇制成每1ml中各含1mg的混合溶液，照薄层色谱法（

35、附录B）试验，吸取上述三种溶液各1 l，分别点于同一薄层板上，取4%乙二胺四醋酸二钠溶液（pH7.0）5ml，加至乙酸乙酯-三氯甲烷-丙酮（2:2:1）200ml中为展开剂，展开后，晾干，用氨蒸气熏后，置紫外光灯（365nm）下检视，混合溶液应显示2个完全分离的斑点，供试品溶液所显主斑点的荧光强度及位置应与相应的对照品溶液的主斑点相同。第117页/共129页（三）（三）IR法法（四）（四）UV法法第118页/共129页（五）化学鉴别法（五）化学鉴别法1.H2SO4反应例盐酸金霉素Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约0.5mg，加硫酸2ml即显蓝色，渐变为橄榄绿色，加水1ml后，显金黄色

36、或棕黄色。第119页/共129页2.三氯化铁反应酚羟基与三氯化铁反应。酚羟基与三氯化铁反应。例盐酸四环素Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约0.5mg，加硫酸2ml，即显深紫色，再加三氯化铁试液1滴，溶液变为红棕色。第120页/共129页三、检查三、检查（一）盐酸四环素中有关物质（一）盐酸四环素中有关物质4-差向四环素脱水四环素差向脱水四环素土霉素盐酸金霉素检查方法：检查方法：HPLC（加校正因子的主成份自身对照法）（加校正因子的主成份自身对照法）第121页/共129页例盐酸四环素Ch.P.（2010）【检查】有关物质取本品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含0

37、.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取2ml，置100ml量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10 l注入液相色谱仪，调节检测灵敏度使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%。精密量取供试品溶液和对照溶液各10 l，分别注入液相色谱仪。记录色谱图至主成份保留时间的2.5倍。供试品溶液色谱图中记录色谱图至主成分如有杂质峰，按校正后的峰面积计算（土霉素、4-差向四环素、盐酸金霉素、脱水四环素和差向脱水四环素的校正因子分别为1.0、1.42、1.39、0.48和0.62），分别不得大于对照溶液主峰面积的0.25倍（0.5%）、1.5倍

38、（3.0%）、0.5倍（0.5%）、0.25倍（0.5%）、0.25倍（0.5%）。其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（1.0%）。第122页/共129页（二）杂质吸收度（二）杂质吸收度四环素类药物产生异构化和降解反应后会发生颜色改变。检查方法为规定一定溶剂、一定浓度、一定波长下杂质吸收度的限量.例盐酸四环素（注射用）Ch.P.（2010）【检查】杂质吸光度取本品，在2025时加0.8%氢氧化钠溶液制成每1ml中含10mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录A），置4cm的吸收池中，在530nm的波长处测定，自加0.8%氢氧化钠溶液起5分钟时，其吸光度不得过0.12（供注射

39、用）。第123页/共129页四、含量测定四、含量测定HPLC法法例盐酸四环素Ch.P.（2010）填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：醋酸铵溶液0.15mol/L醋酸铵溶液-0.01mol/L的EDTA溶液-三乙胺（100:10:1）用醋酸调节pH至8.5-乙腈（83:17）色谱系统适用性：制备四环素和有关物质的混合溶液，要求能完全分离。第124页/共129页第五节、高分子杂质的检查1.1.基本结构基本结构第125页/共129页2.2.特点特点（1 1）发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片均可带入产品中，相）发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片均可带入产品中，相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分

40、子，形成青同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子，形成青霉素噻唑多肽类杂质。霉素噻唑多肽类杂质。（2 2）有不同聚合度和不同机理聚合反应形成的聚合物，聚合）有不同聚合度和不同机理聚合反应形成的聚合物，聚合物发生不同程度的降解作用。物发生不同程度的降解作用。（3 3）以异构体存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。）以异构体存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。（4 4）高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结）高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结晶、喷雾干燥）晶、喷雾干燥）第126页/共129页3.3.杂质控制方法杂质控制方法反相高效液相、离子交换色谱和凝胶色谱。葡聚糖凝胶SephadexC10自身对照外标法第127页/共129页生产过程贮存过程使用不当高分子杂质内源性(药物自身聚合物)外源性(蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物)发酵过程控制重点第128页/共129页感谢您的观看。第129页/共129页