平板色谱法学习.pptx

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1、1.1.层析缸层析缸 2.2.滤纸滤纸 3.3.原点原点 4.4.展开剂展开剂 5.5.前沿前沿 6.7.6.7.斑点斑点12345673第1页/共89页二、比移值（二、比移值（R Rf f）及其影响因素）及其影响因素 比移值比移值Rf:x:斑点中心到原点的距离斑点中心到原点的距离 y:溶剂前沿到原点的距离溶剂前沿到原点的距离 Rf 介于介于01之间。之间。Rf 的大小取决于溶质在二相间的分配的大小取决于溶质在二相间的分配系数及系数及 滤纸的性质滤纸的性质.不同的组分具有不同的分配系数不同的组分具有不同的分配系数,因因 而也就有不同的而也就有不同的Rf.这就是定性的依据这就是定性的依据.第2页

2、/共89页影响影响R Rf f的因素的因素(1)(1)欲分离物的本性欲分离物的本性:物质在两相的分配系数物质在两相的分配系数,决定了它的决定了它的R Rf f 大小大小;(2)(2)展开剂展开剂:同一组分在不同溶剂中同一组分在不同溶剂中R Rf f不同。展开剂的类型、不同。展开剂的类型、浓度浓度/比例、比例、pHpH等都会对等都会对R Rf f有影响。所选择的层析剂，通有影响。所选择的层析剂，通常应使溶质的常应使溶质的R Rf f在在0.05 0.05 0.85 0.85之间之间,不同组分的不同组分的R Rf f差值差值0.050.05.(3)(3)滤纸滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机械强

3、度、不含质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、不含杂质。杂质。因此，应该注意：因此，应该注意：滤纸最好用同一批，预处理方滤纸最好用同一批，预处理方法应相同法应相同（通常用（通常用2-3M2-3M盐酸浸泡）；滤纸使用前最好在盐酸浸泡）；滤纸使用前最好在有机相的蒸汽中放置一段时间；有机相的蒸汽中放置一段时间；切纸应注意方向切纸应注意方向（横？（横？纵？应该同一方向），切口光滑等纵？应该同一方向），切口光滑等第3页/共89页(4)(4)温度应基本相同温度应基本相同，层析罐，层析罐/槽应密闭好，防槽应密闭好，防止有机溶剂的挥发导致有机相组成的改变。止有机溶剂的挥发导致有机相组成的改变。温度会影响溶质的

4、分配系数及流动相的扩散温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。层析操作应在恒温下进行。速度。层析操作应在恒温下进行。(5)(5)展开方式不同展开方式不同,Rf也不同：下行法的也不同：下行法的Rf最最大，环行法其次，大，环行法其次，上行法较小。上行法较小。第4页/共89页三、操作技术三、操作技术1 1、滤纸的选择与准备、滤纸的选择与准备a.a.要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐；要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐；b.b.要求滤纸的纤维松紧适宜；要求滤纸的纤维松紧适宜；c.c.滤纸的杂质含量少。滤纸的杂质含量少。预处理：预处理：以以0.1-0.4 mol/L HCl(或或 2 mol/L

5、 HAc)浸泡数小时浸泡数小时,除去无机杂质后除去无机杂质后,取取出用蒸馏水洗净出用蒸馏水洗净,再将滤纸放在丙酮再将滤纸放在丙酮-乙乙醇醇(1(1:1):1)中浸泡中浸泡 一周时间一周时间,除去有机杂质除去有机杂质,再取再取出风干备用出风干备用.第5页/共89页型型号号杯重杯重G/m2厚度厚度(mm)吸水性吸水性(30min内水上升内水上升mm)灰分灰分G/m2性能性能1900.17150 1200.08快速快速2900.17120 900.08中速中速3900.1590 600.08慢速慢速41800,34151 1210.08快速快速51800.32120 910.08中速中速61800.

6、3090 600.08慢速慢速常用层析滤纸的性能与规格常用层析滤纸的性能与规格第6页/共89页2 2、点样、点样 先用铅笔在距纸条一端先用铅笔在距纸条一端2 3 cm处处划一条划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一直线（起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置；用微量注射器、毛细号表示点样位置；用微量注射器、毛细滴管（滴管（0.5mm)等做点样工具吸取试液轻等做点样工具吸取试液轻轻与轻与“x”号接触，使点样的号接触，使点样的斑点直径为斑点直径为0.2 0.5 cm,每次点样每次点样2 20 l于滤纸上，以冷于滤纸上，以冷风吹干；风吹干；干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式干后，将

7、纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。置于层析缸中展开。第7页/共89页点样方法 用铅笔在距纸条一用铅笔在距纸条一端端23cm处划一条直线（起始线）并在处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一线上隔一定距离划一“x”号表示号表示点样位置；点样并风干后，将纸点样位置；点样并风干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。第8页/共89页3 3、展开、展开 展开剂的选择展开剂的选择：a.a.欲分离物在两相中的溶解欲分离物在两相中的溶解度；度；b.b.展开剂的极性展开剂的极性;c.;c.展开剂与欲分离物间展开剂与欲分离物间应无化学反应应

8、无化学反应;d.;d.欲分离物在展开剂中的分配欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响系数最好不受温度的影响;e.;e.欲分离物在两相欲分离物在两相间瞬间达到的分配平衡间瞬间达到的分配平衡.常用的展开剂有常用的展开剂有：水饱和的正丁醇、正戊醇、：水饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿酚、四氯化碳、氯仿 、苯、丁酮、丙酮、有、苯、丁酮、丙酮、有机酸、有机碱，有时也加入一定比例的无机酸、机酸、有机碱，有时也加入一定比例的无机酸、无机碱、甲醇、乙醇等无机碱、甲醇、乙醇等.。第9页/共89页 展开前展开前，层析缸与已点样滤纸必须予先经水，层析缸与已点样滤纸必须予先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。蒸汽

9、、溶剂蒸气饱和。方法是方法是：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水层放入小烧杯内，置于层荡，分层后，将水层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时间，使滤纸吸饱蒸汽，然析缸中平衡一段时间，使滤纸吸饱蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层第10页/共89页展开方法一、上行法展开方法一、上行法将点有试样的滤纸条的下端将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂（但浸入溶剂（但不能浸没点样处不能浸没点样处）上端固定在层析缸的上部，保持上端固定在层析缸的上部，

10、保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离上升而展层。待溶液上升到距离纸上端纸上端34cm时，将滤纸取出，时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前沿处画线作记号用铅笔在溶剂前沿处画线作记号（见右图）（见右图）第11页/共89页对于对于Rf十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法a.a.纸条的上端暴露在层析缸外，纸条的上端暴露在层析缸外，以便令上升的溶剂挥发；以便令上升的溶剂挥发；b.b.只要保持纸条下端与溶剂面只要保持纸条下端与溶剂面接触，溶剂便能不断地上升接触，溶剂便能不断地上升而挥发，展层过程就自动连而挥发，展层过程就自动

11、连续地进行；续地进行；第12页/共89页玻片玻片玻璃棒玻璃棒原点原点玻皿剪成锯齿状，便于溶剂滴下剪成锯齿状，便于溶剂滴下展开方法二展开方法二下行法下行法溶剂自纸的上端溶剂自纸的上端向下降（借助于向下降（借助于重力的作用），重力的作用），具有分离速度快具有分离速度快及连续挥发色谱及连续挥发色谱的优点。的优点。第13页/共89页展开方法三展开方法三环行法环行法又叫径向色谱法又叫径向色谱法。这是一种既快又方便的方法。取一张。这是一种既快又方便的方法。取一张圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤

12、纸夹在两个剪至圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸夹在两个大小相同培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。大小相同培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。第14页/共89页展开方法四展开方法四双向展开法双向展开法有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。一种展开

13、剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。若前后二次展开若前后二次展开剂选择适当，可使各剂选择适当，可使各种组份完全分离。例种组份完全分离。例如，氨基酸的分离可如，氨基酸的分离可用此法。双向展开法用此法。双向展开法也可以二次使用同一也可以二次使用同一种展开剂展层。种展开剂展层。第15页/共89页4 4、显色、显色 展开后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在展开后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿作记号。有色物：直接观察各个色斑。溶剂前沿作记号。有色物：直接观察各个色斑。无色物则采用显色法观察。无色物则采用显色法观察。(A)(A)物理法显色；物理法显色；用紫外灯照，观察有无吸收或发出各种不用紫外灯照

14、，观察有无吸收或发出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置及大小。及大小。第16页/共89页(B)(B)化学法显色化学法显色 利用各种物质的特性反应，喷洒适当利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂，的显色剂，若被分离的物质含有羧酸，可喷若被分离的物质含有羧酸，可喷酸碱指示剂溴甲酚绿，当斑点呈黄色，说明酸碱指示剂溴甲酚绿，当斑点呈黄色，说明羧酸确实存在；若被分离的物质含有氨基酸，羧酸确实存在；若被分离的物质含有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨则可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手基酸呈黄色。其它

15、化合物所用显色剂可从手册里查阅。册里查阅。第17页/共89页四、定性、定量分析四、定性、定量分析：定性：测量相同条件下的比移值，并且与内标物比较定性：测量相同条件下的比移值，并且与内标物比较。定量：定量：测量斑点大小、颜色扫描等；将斑点剪下后利用测量斑点大小、颜色扫描等；将斑点剪下后利用 化学反应测量，如灼烧称量；溶解后滴定、比化学反应测量，如灼烧称量；溶解后滴定、比色等。色等。剪洗法：剪洗法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱，然后用各种将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱，然后用各种仪仪 器方法（如红外、紫外、原子吸收、发射光谱），器方法（如红外、紫外、原子吸收、发射光谱），也可将斑点剪下灰化，再用适当

16、的溶剂溶解，也可将斑点剪下灰化，再用适当的溶剂溶解，测之。测之。比较法：比较法：经纸色谱将各种组份分开后，可在相同条件下，经纸色谱将各种组份分开后，可在相同条件下，制得标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积进行制得标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积进行比比 较，确定其可能的含量。反射散射光谱法（即扫较，确定其可能的含量。反射散射光谱法（即扫描描 光度法；反射分光光度法）。光度法；反射分光光度法）。第18页/共89页应用举例应用举例FeCuCoNiNiNiNiTiMo黑毛红毛黄毛白毛兔毛的色谱图兔毛的色谱图取不同颜色兔毛取不同颜色兔毛(300500mg),干法灰化干法灰化,溶于溶于稀稀HCl中中,用

17、用丙酮丙酮:丁醇丁醇:HCl=10:4:2,展开后展开后,显色显色第19页/共89页例例:其它类的分离（固定相为水其它类的分离（固定相为水）流动相流动相分离情况分离情况正丁醇：浓氨水：正丁醇：浓氨水：水水4:1:5磺胺嘧啶、磺胺噻睉、磺胺嘧啶、磺胺噻睉、Sulfamerzine、p,p-sulfonyldianiline正丁醇：醋酸：水正丁醇：醋酸：水 4:1:5对胺基苯甲酸、维生素对胺基苯甲酸、维生素C、N甲基甲基菸酰胺、菸碱酰胺、菸酸、潘妥宁、菸酰胺、菸碱酰胺、菸酸、潘妥宁、泛酸、泛酸、VB6、VB1甲苯：石油醚：乙甲苯：石油醚：乙醇：水醇：水200:100:30:70雌酮、雌二酮、雌三酮

18、、马烯雌酮、雌酮、雌二酮、雌三酮、马烯雌酮、脱氢皮质甾酮酸、孕甾酮、顺式睾丸脱氢皮质甾酮酸、孕甾酮、顺式睾丸甾酮甾酮第20页/共89页流动相流动相分离情况分离情况丁醇：醋酸：水丁醇：醋酸：水32:2:22甲状腺素、二碘酪氨酸甲状腺素、二碘酪氨酸流动相流动相：丁醇：丁醇：HAc:H2O=4:1:5流动相：流动相：M甲酚酚：甲酚酚：pH=9.33硼酸缓冲液硼酸缓冲液=1 :1亮氨酸、异亮氨酸、苯亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、苏氨酸、门冬氨酸、酸、苏氨酸、门冬氨酸、谷氨酰酸、门冬酰氨

19、、谷氨酰酸、门冬酰氨、精氨酸、组氨酸、赖氨精氨酸、组氨酸、赖氨酸、胱氨酸等酸、胱氨酸等第21页/共89页例例:用纸色谱法分离用纸色谱法分离A、B两种物质，在某条件下两物质的比移两种物质，在某条件下两物质的比移值值Rf分别为分别为0.36、0.40。设。设A、B两物质斑点的直径分别为两物质斑点的直径分别为0.2cm,0.4cm,当展开剂的前沿达到当展开剂的前沿达到10cm时，时，A、B能否完全分能否完全分离离?解解:设设A、B两物质色谱斑点的中心距原点分别为两物质色谱斑点的中心距原点分别为x1,x2cm,则则x1/10=0.36 x2/10=0.40 x2-x1=(0.40-0.36)10=0.

20、4(cm)欲分离两物质，两斑点中心距离至少为欲分离两物质，两斑点中心距离至少为(0.20+0.40)/2=0.30cm,而实际两斑点中心距离为而实际两斑点中心距离为0.4cm,故在此条件下故在此条件下AB两物质可得到完全分离。两物质可得到完全分离。比移值与分离度比移值与分离度第22页/共89页分离度是薄层色谱法的重要分离参分离度是薄层色谱法的重要分离参数。数。两相邻斑点中心距离与两斑点两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度平均宽度(直径直径)的比值称为分离度或的比值称为分离度或分辨率。分辨率。R2d/(W1W2)上式中上式中d为两斑点中心间的距离，为两斑点中心间的距离，W1、W2分别为两斑点的宽度

21、；分别为两斑点的宽度；在在HPLC中，中，d为两色谱峰顶间距离，为两色谱峰顶间距离，W1、W2分别为两色谱峰宽。分别为两色谱峰宽。分离度也可以用比移值来计算：分离度也可以用比移值来计算：R2L(Rf1Rf2)/(W1W2)第23页/共89页例例:纸色谱法分离混合离子纸色谱法分离混合离子,若混合离子极性大小顺序为若混合离子极性大小顺序为ABC,用弱极性有机用弱极性有机溶剂展开后其溶剂展开后其Rf值大小顺序为值大小顺序为_。C,B,A第24页/共89页一、特点：一、特点：（a）分离迅速，一般分离仅需）分离迅速，一般分离仅需1530min，纸色谱常以小时计；，纸色谱常以小时计；（b）分离效率高；其有

22、效塔板数要比柱色谱高）分离效率高；其有效塔板数要比柱色谱高10100倍倍；(有有机合成中先机合成中先“爬板爬板”后后“过柱过柱”）（c）薄层色谱法适于分析小量样品）薄层色谱法适于分析小量样品(检出灵敏度有时可达检出灵敏度有时可达0.01gg的物质的物质)，也适于大量样品的分离（可以分离出甚，也适于大量样品的分离（可以分离出甚至几十毫克组分）；至几十毫克组分）；（d）可用腐蚀性显色剂显色；适于分析热不稳定，难挥发的样）可用腐蚀性显色剂显色；适于分析热不稳定，难挥发的样品品。（e e）制备、操作简单而且有效。）制备、操作简单而且有效。也可以采用多种展开方式也可以采用多种展开方式。第二节、薄层色谱法

23、第二节、薄层色谱法（ThinLayerChromatography，TLC)第25页/共89页二、二、原理原理 将将固固定定相相吸吸附附剂剂均均匀匀地地涂涂在在玻玻璃璃上上制制成成薄薄层层板板，试试样样中中的的各各组组分分在在固固定定相相和和作作为为展展开开剂剂的的流流动动相相之之间间不不断断地地发发生生溶溶解解、吸吸附附、再再溶溶解解、再再吸吸附附的的过过程程。不不同同物物质质因因为为与与固固定定相相吸吸附附作作用用的的不不同同而而上上升升的的距距离离不不一一样样，从从而而形形成成相互分开的斑点从而达到分离。相互分开的斑点从而达到分离。分离原理有分离原理有吸附吸附，分配分配，离子交换离子交换

24、等。等。第26页/共89页基本的操作过程基本的操作过程基本的操作过程基本的操作过程第27页/共89页三、固定相与展开剂三、固定相与展开剂(1)(1)固定相：固定相：决定吸附性能的因素有：吸附剂的化学决定吸附性能的因素有：吸附剂的化学 组成（类型）、活性、表面积等。组成（类型）、活性、表面积等。（a a）硅胶：微酸性极性固定相，适用于）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性酸性、中性 物质分离物质分离（b b）氧化铝：碱性极性固定相，适用于）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性碱性 、中、中 性性物质分离（可以制备成中性或酸性氧化铝扩物质分离（可以制备成中性或酸性氧化铝扩 大使用范围）大使用范围

25、）（c c）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、酚类、醇类醇类化合物的分离化合物的分离（d d）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离 亲水性亲水性物质物质第28页/共89页关于固定相（吸附剂）关于固定相（吸附剂）青岛海洋化工厂是国内著名的生产薄层色谱用硅胶的厂家青岛海洋化工厂是国内著名的生产薄层色谱用硅胶的厂家。规格一般为：硅胶规格一般为：硅胶G表示含石膏；表示含石膏；H表示不含石膏；表示不含石膏；F表示含荧光剂表示含荧光剂。如。如硅胶硅胶GF365(含石膏含石膏13%及荧光剂），硅胶及荧光剂），硅胶HF

26、254(不含粘合剂，含荧光剂）不含粘合剂，含荧光剂）荧荧光剂有两种，在光剂有两种，在254nm紫外光下能发出绿色荧光的是紫外光下能发出绿色荧光的是3%锰激活的硅酸锌锰激活的硅酸锌（ZnSiO4 Mn)；层析后在绿色荧光底上样品呈暗紫色斑点。激发波长为；层析后在绿色荧光底上样品呈暗紫色斑点。激发波长为365nm的是用银激活的硫化锌、硫化镉（的是用银激活的硫化锌、硫化镉（ZnS、CdS Ag）有时加有机粘合剂：加入有时加有机粘合剂：加入CMC的的0.41%水溶液调制，但显色时不能用硫水溶液调制，但显色时不能用硫酸。长期放置易发霉酸。长期放置易发霉硅胶及氧化铝等的吸附能力与他们吸附的水量有关硅胶及氧

27、化铝等的吸附能力与他们吸附的水量有关。使用前应根据样品情。使用前应根据样品情况进行况进行活化活化。所谓活化就是指它们在一定的温度下烘烤以除去吸附的水而言所谓活化就是指它们在一定的温度下烘烤以除去吸附的水而言（如果吸附了水，那么吸附其他物质的能力就降低）。硅胶薄层一般在（如果吸附了水，那么吸附其他物质的能力就降低）。硅胶薄层一般在105110活化活化3060min；氧化铝薄层如果不加粘合剂，活化温度可达；氧化铝薄层如果不加粘合剂，活化温度可达150左右。左右。第29页/共89页硅胶的表面结构硅胶的表面结构:表面的羟基是吸附作用的活性中心表面的羟基是吸附作用的活性中心！因此，硅胶必须活化，但是温度

28、不能高于因此，硅胶必须活化，但是温度不能高于200200。当硅胶加热。当硅胶加热到到200200以上时，失水转化成以上时，失水转化成 硅氧环而失活。硅氧环而失活。氧化铝则不能高于氧化铝则不能高于600600。（。（一般一般150300）硅醇基团:强吸附的极性基团硅氧烷键:疏水基团第30页/共89页氧化铝的活性测定硅胶的活性测定第31页/共89页吸附色谱吸附色谱:是利用试样中各组分是利用试样中各组分对吸附剂吸附能力的对吸附剂吸附能力的不同来进行分离的，不同来进行分离的，一般是用非极性或弱极性展开剂一般是用非极性或弱极性展开剂来处理弱极性化合物来处理弱极性化合物。必须根据试样中各组分的极性、。必须

29、根据试样中各组分的极性、吸附剂的活化程度来选择适当的弱极性的溶剂或混合吸附剂的活化程度来选择适当的弱极性的溶剂或混合溶剂作展开剂。利用各种不同极性的溶剂来配制展开溶剂作展开剂。利用各种不同极性的溶剂来配制展开剂。几种常用溶剂，按其极性增强次序排列如下：石剂。几种常用溶剂，按其极性增强次序排列如下：石油醚、环己烷、四氯化碳、苯、甲苯、氯仿、乙醚、油醚、环己烷、四氯化碳、苯、甲苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇，正丙醇、乙酸乙酯、正丁醇，正丙醇、1 1，2 2一二氯乙烷、丙酮一二氯乙烷、丙酮、乙醇、甲醇、水、吡啶、醋酸。、乙醇、甲醇、水、吡啶、醋酸。第32页/共89页分配色谱分配色谱:一般一般是用极

30、性展开剂处理极性化合物是用极性展开剂处理极性化合物，例，例如蒽醌磷酸薄层色谱中的展开剂，是用极性溶剂正如蒽醌磷酸薄层色谱中的展开剂，是用极性溶剂正丁醇，氨水丁醇，氨水(相对密度相对密度0-88)0-88)、水按、水按2 2：1 1：1 1配成的。配成的。分配色谱是利用试样中各组分在流动相和固定分配色谱是利用试样中各组分在流动相和固定相中溶解度的不同，在两相间不断进行分配而达到相中溶解度的不同，在两相间不断进行分配而达到分离分离目的。目的。展开剂是流动相，吸附剂中的少量水分展开剂是流动相，吸附剂中的少量水分是固定相。是固定相。吸附色谱展开速度较快，约需吸附色谱展开速度较快，约需101030m30

31、m，分配，分配色谱往往需色谱往往需1 12h2h。吸附色谱受温度影响较小，分配。吸附色谱受温度影响较小，分配色谱受温度影响较大。色谱受温度影响较大。第33页/共89页Al2O3活性的测定：活性的测定：取取20L染料溶液（偶氮苯染料溶液（偶氮苯30mg、对、对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨基偶氮苯各甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨基偶氮苯各20mg，溶解于，溶解于50mLCCl4中），加到薄板上，用中），加到薄板上，用CCl4展层，根据展层，根据下表确定活性下表确定活性。活性活性 Rf,偶氮苯偶氮苯 0.59 0.74 0.85 0.95Rf,对对-甲氧基偶氮苯甲氧基偶氮苯 0.16

32、0.49 0.69 0.89Rf,苏丹黄苏丹黄 0.01 0.25 0.57 0.78Rf,苏丹红苏丹红 0.00 0.10 0.33 0.56Rf,对氨基偶氮苯对氨基偶氮苯 0.00 0.03 0.08 0.19第34页/共89页硅胶活性的测定：硅胶活性的测定：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各各40mg溶于溶于100mL苯中，将此混合液滴加于薄层苯中，将此混合液滴加于薄层上，用石油醚展开上，用石油醚展开10cm，混合物应不动；如用苯展，混合物应不动；如用苯展开，则应分成三个斑点，其开，则应分成三个斑点，其Rf值分别为：二甲黄值分别为：二甲黄0.58，苏丹红，苏丹红0.1

33、9，靛酚蓝，靛酚蓝0.08（展层时间（展层时间3045min），则认为此硅胶合格。经本法测定的活性与），则认为此硅胶合格。经本法测定的活性与Al2O3活性活性级相当。级相当。第35页/共89页(2)(2)展开剂：展开剂：展开剂的洗脱作用展开剂的洗脱作用实质是实质是展开剂分子与欲分展开剂分子与欲分离组分竟争占据表面吸附中心的过程。离组分竟争占据表面吸附中心的过程。强极性展开剂分子占据吸附中心的能力强，强极性展开剂分子占据吸附中心的能力强，所以，有强的洗脱作用，非极性展开剂分子占据所以，有强的洗脱作用，非极性展开剂分子占据吸附中心的能力弱，所以有弱的洗脱作用。吸附中心的能力弱，所以有弱的洗脱作用。

34、选择展开剂须满足：选择展开剂须满足：（a a）对被分离物质有一定的解吸能力和溶解度。）对被分离物质有一定的解吸能力和溶解度。（b b）极性比被分离物质略小（极性比被分离物质略小（淋洗、置换、前淋洗、置换、前 沿色谱？沿色谱？）第36页/共89页展开剂的极性：展开剂的极性：石油醚石油醚环己烷环己烷二硫化碳二硫化碳四氯化碳四氯化碳三氯乙三氯乙烯烯苯苯甲苯甲苯二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿乙醚乙醚乙酸乙乙酸乙酯酯丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇吡啶吡啶酸酸欲分离组分的极性欲分离组分的极性：取代基团极性越强，整个分子极性越强取代基团极性越强，整个分子极性越强。常见。常见功能团按其极性增加的顺序是：功能团按其极性增加

35、的顺序是：烷烃烷烃烯烃烯烃醚类醚类硝基化合物硝基化合物二甲胺二甲胺酯类酯类酮类酮类醛醛类类硫醇硫醇胺类胺类酰胺酰胺醇类醇类酚类酚类羧酸类羧酸类第37页/共89页(3)(3)吸附剂和展开剂的一般选择原则是：吸附剂和展开剂的一般选择原则是：非极性组分的分离选用活性强的吸附剂，非极性组分的分离选用活性强的吸附剂，用非极性展开剂用非极性展开剂；极性组分的分离，选用活性弱的吸附剂，极性组分的分离，选用活性弱的吸附剂，用极性展开剂。用极性展开剂。极性组分极性组分-弱吸附剂（含水多）弱吸附剂（含水多）-极性展开剂极性展开剂非极性组分非极性组分-强吸附剂（含水少）强吸附剂（含水少）-非极性展非极性展开剂开剂（

36、常根据实验情况采用混合展开剂，如在硅胶板上分常根据实验情况采用混合展开剂，如在硅胶板上分离氨基酸需要用正离氨基酸需要用正1:1:1:11:1:1:1的丁醇的丁醇-乙酸乙酯乙酸乙酯-醋酸醋酸-水水作展开剂作展开剂）第38页/共89页展开剂的选择展开剂的选择第39页/共89页四、薄层色谱技术四、薄层色谱技术（1 1）薄层板的制备）薄层板的制备（2 2）点样）点样（3 3）展开）展开（4 4）显色）显色第40页/共89页第41页/共89页（1 1）薄层板的制备（）薄层板的制备（“铺板铺板”）一般为一般为520cm，或者，或者2020cm，23cm厚玻璃板。厚玻璃板。使用前应该洗净除去油污使用前应该洗

37、净除去油污等。等。吸附剂加水调成糊状，均匀铺在薄层板上，吸附剂加水调成糊状，均匀铺在薄层板上，厚度约厚度约0.250.30mm。活化后（风干、烘干）活化后（风干、烘干）放入干燥器中备用。放入干燥器中备用。有市售的涂布器，也有标准化的薄层板。有市售的涂布器，也有标准化的薄层板。另外还有高效薄层色谱仪。另外还有高效薄层色谱仪。第42页/共89页（2 2）点样）点样 适当的点样量，集中的斑点是得到一个好的色适当的点样量，集中的斑点是得到一个好的色谱的必要条件。谱的必要条件。点样量点样量：不同的分离要求、不同的薄板（有厚有：不同的分离要求、不同的薄板（有厚有薄）、不同的吸附剂（性能不一），需要不同的点

38、样薄）、不同的吸附剂（性能不一），需要不同的点样量。量。点样量少了，不易检出；点样量多了，易拖尾或点样量少了，不易检出；点样量多了，易拖尾或扩散，影响分离效果。扩散，影响分离效果。纯物质的鉴定，若又有高灵敏纯物质的鉴定，若又有高灵敏度的显色剂，度的显色剂，点样量只需点样量只需 g或或ng；若进行天然物或；若进行天然物或中间产物的分离时，点样量需中间产物的分离时，点样量需50 g几百微克；若几百微克；若进行制备色谱，进样量可达进行制备色谱，进样量可达1mg。点样时可用内径约。点样时可用内径约1mm，管，管口平整的毛细管或微量吸管吸取试液后，口平整的毛细管或微量吸管吸取试液后，轻轻接触板面，分数次

39、滴加样品。轻轻接触板面，分数次滴加样品。第43页/共89页注意事项注意事项a.a.溶解试样的溶剂最好是溶解试样的溶剂最好是挥发性挥发性的；的；b.点样宜分点样宜分几次点加几次点加,即点一次后即点一次后,用吹风机的用吹风机的冷风吹干冷风吹干,再点再点,再吹干再吹干,.,反复反复,直到直到点完所要求的量；点完所要求的量；c.点样量的点样量的体积尽可能小体积尽可能小些些(2 10 L左右左右)；d.点样最好是在密闭的室中或比较干燥的环点样最好是在密闭的室中或比较干燥的环境下完成境下完成,避免薄板吸水降低活性避免薄板吸水降低活性.第44页/共89页0.12503000.50.30.1Rfg第45页/共

40、89页（3 3）展开）展开 薄层的展开需在密闭的器皿中进薄层的展开需在密闭的器皿中进行，密闭容器应用展开溶剂予先饱和。行，密闭容器应用展开溶剂予先饱和。展开方式和纸层析基本相同。但不加展开方式和纸层析基本相同。但不加粘合剂的薄板只能作近水平式（与平粘合剂的薄板只能作近水平式（与平面成面成20 10oC角）的上行或下行的角）的上行或下行的展层而不能垂直展层。展层而不能垂直展层。第46页/共89页（4 4）检测）检测直接观察法：直接观察法：（a a）本身是）本身是有色物有色物，可以直接观测斑点的位置，可以直接观测斑点的位置和和 颜色颜色（b b）本身）本身无色但在紫外线的照射无色但在紫外线的照射（

41、254254、365nm365nm）下会发出不同颜色的荧光下会发出不同颜色的荧光。*硝基化合物硝基化合物能能 猝灭荧光，在紫外灯下是棕黑色的点。猝灭荧光，在紫外灯下是棕黑色的点。（c）薄板本身有荧光（硅胶薄板本身有荧光（硅胶HFHF254+366254+366,硅胶硅胶 GFGF254254,.),.),欲测物吸收紫外线欲测物吸收紫外线,在在 荧光背景下呈暗色。荧光背景下呈暗色。第47页/共89页显色方法：显色方法：1.碘蒸汽熏：碘蒸汽熏：几乎与所有的有机物（卤代烃除外）生成黄色或几乎与所有的有机物（卤代烃除外）生成黄色或 棕色的斑点，但不是发生化学反应，一旦离开碘蒸汽，斑点棕色的斑点，但不是

42、发生化学反应，一旦离开碘蒸汽，斑点 就消失（利用碘的升华）。就消失（利用碘的升华）。2.2.硫酸显色法硫酸显色法：多数有机物多数有机物,喷喷1050%H2SO4(或铬硫酸或铬硫酸)并并在在100120oC加热加热,使有机物碳化使有机物碳化,观察加热中有机物颜色观察加热中有机物颜色变变化及碳化斑点位置化及碳化斑点位置,可以推断物质的化学性质可以推断物质的化学性质3.高锰酸钾氧化法高锰酸钾氧化法（用（用1%的高锰酸钾溶液）：适用于糖类，醇的高锰酸钾溶液）：适用于糖类，醇类。结果是红颜色的底上有黄色的点类。结果是红颜色的底上有黄色的点，（高锰酸钾消耗后红，（高锰酸钾消耗后红 色褪去）色褪去）4.4.

43、指示剂法：指示剂法：酸碱物质可用指示剂酸碱物质可用指示剂 第48页/共89页主要显色试剂主要显色试剂试剂试剂配制及使用方法配制及使用方法检出范围检出范围浓浓H2SO4喷雾喷雾,100 120oC ,观察观察颜色变化颜色变化高级醇、醛、酮、高级醇、醛、酮、甾体甾体H2SO4-K2Cr2O75g K2Cr2O7+100mL H2SO4,喷雾喷雾,280oC观察观察颜色变化颜色变化全部有机物全部有机物2,7-二氯荧光二氯荧光黄黄(0.2%乙醇乙醇)喷雾，紫外线照射喷雾，紫外线照射全部有机物全部有机物I2-KI1g I2+10gKI溶于溶于50mLH2O中，加入中，加入2mLHAc，稀释至，稀释至10

44、0mL，喷雾，喷雾生物碱生物碱第49页/共89页试剂试剂配制及使用方法配制及使用方法检出范围检出范围溴甲酚绿溴甲酚绿0.04g溶于溶于100mL乙醇中，以乙醇中，以0.1 mol/L NaOH调至蓝色调至蓝色刚消失，刚消失，600oC，Al2O3进一步脱水并开始烧结进一步脱水并开始烧结第74页/共89页由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，每批生产的每批生产的Al2O3，其表面积和表面孔穴结构并不，其表面积和表面孔穴结构并不一致，活性也不相同。一致，活性也不相同。Al2O3活性的测定：取活性的测定：取20L染料溶液（偶氮苯染料溶液（偶氮苯30mg、对甲氧基

45、偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨、对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨基偶氮苯各基偶氮苯各20mg，溶解于，溶解于50mLCCl4中），加到中），加到薄板上，用薄板上，用CCl4展层，根据下表确定活性。展层，根据下表确定活性。第75页/共89页活性活性 Rf,偶氮苯偶氮苯 0.59 0.74 0.85 0.95Rf,对对-甲氧基偶氮苯甲氧基偶氮苯 0.16 0.49 0.69 0.89Rf,苏丹黄苏丹黄 0.01 0.25 0.57 0.78Rf,苏丹红苏丹红 0.00 0.10 0.33 0.56Rf,偶氮苯偶氮苯 0.00 0.03 0.08 0.19第76页/共89页市售的供薄层色谱用的

46、市售的供薄层色谱用的Al2O3有有:Al2O3H氧化铝中无粘合剂氧化铝中无粘合剂Al2O3G氧化铝中含煅石膏（一般氧化铝中含煅石膏（一般5煅石膏）煅石膏）煅石膏煅石膏CaSO4，作为粘合剂，作为粘合剂Al2O3HF254氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指示剂（在示剂（在254nm下呈黄绿色荧光）下呈黄绿色荧光）Al2O3GF254氧化铝中既含煅石膏又含荧光指氧化铝中既含煅石膏又含荧光指示示剂（在剂（在254nm下呈黄绿色荧光）下呈黄绿色荧光）上述商品可以直接调料涂敷（上述商品可以直接调料涂敷（1份料，份料，2份水调合份水调合）第77页/共89页（）硅胶（）硅胶（吸附性

47、较（吸附性较Al2O3弱）弱）硅胶是微酸性吸附剂，且适用于酸性、中性物质硅胶是微酸性吸附剂，且适用于酸性、中性物质的分离（如有机酸、氨基酸、萜类、甾体）的分离（如有机酸、氨基酸、萜类、甾体）.碱性物质碱性物质则能与硅胶作用（则能与硅胶作用（当用中性溶剂展层，碱性物质有时当用中性溶剂展层，碱性物质有时停留在原点不动，或者得到拖尾的斑点，而不能很好停留在原点不动，或者得到拖尾的斑点，而不能很好的分离）的分离）活性活性 含水量（）含水量（）0 5 15 25 35注注:硅胶薄层的活化温度不能高于硅胶薄层的活化温度不能高于200oC第78页/共89页硅胶的结构为硅胶的结构为:第79页/共89页硅胶活性

48、的测定：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝硅胶活性的测定：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各各40mg溶于溶于100mL苯中，将此混合液滴加于薄层苯中，将此混合液滴加于薄层上，用石油醚展开上，用石油醚展开10cm，混合物应不动；如用苯，混合物应不动；如用苯展开，则应分成三个斑点，其展开，则应分成三个斑点，其Rf值分别为：二甲黄值分别为：二甲黄0.58，苏丹红，苏丹红0.19，靛酚蓝，靛酚蓝0.08（展层时间（展层时间3045min），则认为此硅胶合格。经本法测定的活性与），则认为此硅胶合格。经本法测定的活性与Al2O3活性活性级相当。级相当。第80页/共89页薄层用商品硅胶有：硅胶薄层用商品硅胶有：硅胶H（

49、不含粘结剂）、（不含粘结剂）、硅胶硅胶G（含粘结剂煅石膏）、硅胶（含粘结剂煅石膏）、硅胶HF254（含荧光（含荧光物质的硅胶）硅胶物质的硅胶）硅胶GF254（含有煅石膏和荧光剂）（含有煅石膏和荧光剂）此外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤此外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤维素也可用作吸附剂。维素也可用作吸附剂。第81页/共89页(3)(3)选择吸附剂的规律：选择吸附剂的规律：v极性物质被极性表面的吸附剂吸附；极性物质被极性表面的吸附剂吸附；v亲水性的吸附剂适用于在非水溶液中吸附物质亲水性的吸附剂适用于在非水溶液中吸附物质v疏水性的吸附剂适用于在水溶液中吸附物质疏水性的吸附剂适用于在

50、水溶液中吸附物质第82页/共89页展开剂（流动相）展开剂（流动相）展开剂的洗脱作用实质是展开剂的洗脱作用实质是展开剂分子与欲分展开剂分子与欲分离组分竟争占据表面吸附中心的过程。离组分竟争占据表面吸附中心的过程。强极性展开剂分子占据吸附中心的能力强，强极性展开剂分子占据吸附中心的能力强，所以，有强的洗脱作用，非极性展开剂分子占据所以，有强的洗脱作用，非极性展开剂分子占据吸附中心的能力弱，所以，有弱的洗脱作用。吸附中心的能力弱，所以，有弱的洗脱作用。（1 1）常用展开剂的极性：）常用展开剂的极性：石油醚石油醚环己烷环己烷二硫化碳二硫化碳四氯化碳四氯化碳三氯乙三氯乙烯烯苯苯甲苯甲苯二氯甲烷二氯甲烷氯