SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.docx

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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的：1.2掌握分子电泳的基本步骤，掌握计算蛋白质相对分子质量的方法。二、实验内容和原理：2. 1电泳（electrophoresis）：是指带电颗粒在电场中向着与它电 性相反的电极移动的现象。许多重要的生物分子都含有可电离基团（如氨 基酸、多肽、蛋白质、核甘酸、核酸等），在非等电点条件下可解离成带 有电荷分子，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。 电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异， 在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合 技术。可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。2. 2

2、影响带电粒子在电场中泳动的因素：生物分子的性质：待分离 生物大分子所带电荷的多少、性质、分子大小和形状都会对电泳产生明显 影响。缓冲液：缓冲液pH值直接影响生物分子的解离程度和带电性质。 溶液pH值距离等电点愈远，生物分子所带净电荷就越多，电泳时速度就 越快。当缓冲液pH大于等电点时，生物分子带负电荷，电泳时向正极移 动；当缓冲液pH小于等电点时，生物分子带正电荷，电泳时向负极移动。 电场强度：电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位 降）。一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。但随着电场强度的增大 会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最 终导致介质温度升

3、高。降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间, 引起生物分子扩散增加，同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当 的电场强度。电渗：液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电 渗。由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有竣基，琼脂含 有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷 的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。当电渗 方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时， 则降低电泳速度。支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对生物大分子 的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之则泳 动速度慢。2.3电泳技术

4、的分类：根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳 和区带电泳：自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行；区带电泳需 使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和 凝胶电泳等。根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直 板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉等。根据电泳时电压的高低分为 高压电泳和常压电泳：高压电泳使用的电压在5001000V,这类电泳分 离速度快，但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化合物 的快速分离；常压电泳使用的电压在500 V以下，电位梯度为210 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但对电泳设备要求简单。根据电泳系 统pH是否连续分为

5、连续pH电泳和不连续pH电泳：连续pH电泳是指电 泳全过程中pH保持不变；不连续pH电泳是指电极缓冲液和电泳支持介质 中的pH不同，甚至电泳支持介质不同区段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺 凝胶电泳。根据工作目的和分离样品的数量多少分为分析电泳和制备电 泳。.根据结合配套的技术种类不同分为免疫电泳、层析电泳、等电聚 焦电泳、转移电泳、双相电泳、脉冲梯度电场凝胶电泳和相互垂直交替电 场凝胶电泳等。根据电泳物质类别不同分为细胞电泳、核酸电泳、蛋白 质电泳等。2. 4电泳示踪剂：电泳常用的示踪剂有澳酚兰和二甲苯青FF。示踪剂 一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比 重增加，以确

6、保样品均匀沉入加样孔内。2. 5聚丙烯酰胺凝胶：是由丙烯酰胺(Acr)与交联剂亚甲基双丙烯 酰胺(Bis)在催化剂作用下，经过聚合交联形成含有亲水性酰胺基侧链 的脂肪族长链，相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来的三维网状结构的凝 胶。具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备 简单、样品量小(1-100 ng),分辨率高等优点，并可通过控制单体浓 度或与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。可用于蛋白质、核酸等 不同大小的生物分子的分离、定性和定量分析；还可结合解离剂十二烷基 硫酸钠(SDS)以测定蛋白质亚基的相对分子质量。2. 6聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：化学聚合：通常采

7、用过硫 酸钱(AP)为催化剂,四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在TEMED加速作 用下，过硫酸镂可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺, 从而引发聚合作用。光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素在光照 下光解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。光聚合的凝胶 孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的凝胶孔径 较小，且各次制备的重复性好。故一般采用化学聚合。2. 7不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：浓缩效应、电荷效应和 分子筛效应。浓缩效应在浓缩胶中进行；分子筛效应在分离胶中进行； 电荷效应在浓缩胶和分离胶中都有。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时, 它的迁

8、移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。2.8SDS：是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和疏基 乙醇后，疏基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的非 共价键(氢键、疏水键)打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质SDS 复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷 的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原 有的电荷差异；SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变；蛋白 质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋 白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的 大小成

9、正比地变化；这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再 受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相 对分子质量的函数。二、实验器材和材料1. 1实验器材：垂直板型电泳装置，直流稳压电源(电压300600V, 电流50100mA) , 50 uL、200 uL、1000 u L的微量注射器,小烧杯。2. 2实验试剂：2% (V/V) TEMED溶液，10% (W/V)过硫酸镂溶液，蛋 白质样品溶解液，分离胶缓冲溶液，浓缩胶缓冲溶液，凝胶贮液，10烬DS 溶液，电极缓冲溶液，染色液，脱色液。3. 3实验对象：标准蛋白质纯品、小鼠肝的蛋白质提取物三、实验方法和步骤3.1安

10、装垂直板型电泳装置：3.1.1 将玻璃板用蒸储水洗净烘干，是否洗净可通过是否有水珠悬挂 于板上判断。3. 1.2把玻璃板在灌胶支架上固定好。固定玻璃板时，两边用力一定 要平均，防止夹坏玻璃板，同时也要注意大小两块板要对齐，夹紧，防止 溶液漏出。3. 2凝胶的制备：3.2. 1分离胶的制备：在小烧杯中配制溶液，先加入4. 0mL凝胶贮液、1.25mL分离胶缓冲 溶液、0.液L10%SDS溶液、4.0mLddH20、0.06mL10%过硫酸锭,然后加入 0. 6mL2% (V/V) TEMED溶液。将所配凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的内面加 至长、短玻璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘1cm。用滴

11、管沿玻 璃片内壁加一层蒸馆水，使胶面平整。等分离胶面不会因倾斜而倾斜时， 去掉水封层，并用滤纸条吸干。3. 2. 2浓缩胶的制备：在另一个干净的小烧杯中，先加入0.75mL凝胶贮液、0. 83mL浓缩胶 缓冲溶液、0. lmL10%SDS溶液、3. 0mLddI120 0. 02mL 10%过硫酸钱,然后 加入0.2mL2% (V/V) TEMED溶液。混匀后将凝胶溶液加到已聚合的分离胶 上方，直至距短玻璃片上缘0.5cm处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶中，使 凝胶顶部形成无数个相互隔开的凹槽，然后放置30min。之后小心拔去 “梳子”。4. 3加样：将PH8. 3的电极缓冲液倒入内外贮槽中，内槽

12、中液面应没过短玻璃片, 如果内槽漏水，则外槽液面应与内槽液面相同。在同一块凝胶上两组分别 用微量注射器在样品凹槽内依次加入牛血清，E1样品1, E1样品2,蛋白 marker, E2样品1, E2样品2,牛血清样本。加样体积为：蛋白质样品液, 牛血清样品液均为15 u L；蛋白质marker为5 u L。3.4电泳:将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电压控制在70V, 待样品进入分离胶后，改为90V。待蓝色染料迁移至下端约1cm左右时， 停止电泳。3. 5剥胶：将电泳槽中的凝胶板取出，将凝胶取出放入一大培养皿中。剥完胶之 后同时做染色和转膜。3. 6染色和脱色：加入染色液，染色45m

13、in。染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。 2030min换一次脱色液，23次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜, 直至背景清晰。3. 7Mr的计算：通常以相对迁移率(Mr)来表示迁移率。相对迁移率的计算方法如下： 用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离，按下式计算：相 对迁移率(Mr)=样品迁移距离(cm) /染料迁移距离(cm)。以标准蛋白质 相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测样品的 相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。四、实验数据记录和处理表一 Marker标准蛋白质相对分子质量及对应迁移率注：11为两条条带A的样品迁移距离的平均值，染料迁移距离1

14、2 =5.25cm业二样品迁移距离11/染料迁移距离12根据标准蛋白质相对分子质量对数值IgM,对相对迁移率Mr作图，得到标准曲线：图二蛋白质相对分子质量标准曲线五、实验结果和分析由图二可知，标准曲线为y=2. 11T.23X讲标曲带入计算可得各样品中蛋白质亚基的相对分子质量：表二待测样品蛋白质亚基相对分子质量注：染料迁移距离12 =5. 25cm, Mr=样品迁移距离11 /染料迁移距 离12实验结果：E1样品中检测出6种亚基，它们的相对分子质量为167.87、146.82、 105.04、43.97、27. 5R 15. 06E2样品中检测出三种亚基：它们的相对分子质量为43. 97、27

15、.51、15. 06B蛋白只有一种亚基：其相对分子质量为80. 35六、注意事项1、玻璃板在使用前一定要确定洗净，因为制胶过程中要保证两块玻 璃板严密地合在一起，如果有脏物附着的话无法保证这一点。是否洗净可 通过观察洗涤后玻璃板表面是否有水滴残留。2、在制备凝胶时，当所有试剂都加入后，烧杯可进行稍微混匀，切 不可用力摇匀，否则会产生气泡。当分离胶凝胶时间基本足够时，可稍微 倾斜垂直板，若分离胶与封水层之间的界面没有倾斜时则说明凝胶完成。3、在倒电极缓冲液时，若内槽有漏水，则内外槽需保持液面一致； 若无漏水，则只需内槽液面没过短玻璃片即可。4、电泳结束后需马上将凝胶从电极缓冲液中拿出来，否则蛋白质会 扩散。