抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法.pdf

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1、抗抗氧氧化化酶酶S SO OD DP PO OD DC CA AT T 活活性性测测定定方方法法集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法酶液制备：酶液制备：取 0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 1.6ml 50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在 4、12000g 下离心20min，上清液即为酶液。一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1 1、试剂的配制、试剂的配制（1）0.05mol/L

2、 磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A 母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液:取 Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B 母液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到 1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取 A 母液(Na2HPO4)228.75ml，B 母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至 1000ml。参考文献：参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267268。（2）130mM 甲硫氨酸溶液：取 1.9399

3、g Met 用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至 100ml。（3）100M EDTA-Na2溶液：取 0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 1000ml。（4）20M 核黄素溶液：取 0.0753g 核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。（5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取 0.06133g NBT 用 PBS 定容至100ml，避光保存。2 2、酶活性测定、酶活性测定（1）取 10ml 试管（要求透明度好）测试管：分别依次加入 3.5ml 缓冲液+0.5ml 甲硫氨酸（Met）溶液+0.5ml 氮蓝四唑（NBT）溶液+0.5ml EDTA-Na2溶液+0.4ml

4、蒸馏水(混合后摇匀)+0.1ml 酶液+0.5ml 核黄素溶液；对照管（2 个）：分别依次加入 3.5ml 缓冲液+0.5ml 甲硫氨酸（Met）溶液+0.5ml 氮蓝四唑（NBT）溶液+0.5ml EDTA-Na2溶液+0.5ml 蒸馏水(混合后摇匀)+0.5ml 核黄素溶液；其中 1 支试管照光后测定作为最大光还原管，另 1 支置于暗中测定时用于调零。（2）将一支对照管置于暗处，其余试管置于光照培养箱中在 4000lux 光照下反应 20min；（4）以不照光的对照管调零后，避光测 OD560(出现颜色即可测定)。（5）酶活性计算：SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原 50所需酶量（测

5、的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为 1 个酶活单位（u）。SOD 总活性(Ack-AE)V/（1/2AckWVt）SOD 比活力SOD 总活性/蛋白质含量SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V 为样品液总体积（ml,1.6ml，加入 PBS 的体积)；Vt 为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W 为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量 mg）；蛋白质含量单位为 mg/g。二、POD、CAT 酶活性的测定粗酶液制备同 SOD。1 1、过氧化物酶（过氧化物酶（PODPOD）

6、活性测定（愈创木酚法）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取 A 母液(Na2HPO4)6.15ml 和B 母液(NaH2PO4)43.85ml 混匀即为 100ml PBS；（2）反应混合液配制（以 24 个样为准）：取 75ml PBS(100mM，pH6.0)，加入 42ul 液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入 28.5ul 30的 H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。（3）样品测定：空白对照：3ml 反应混合液+1ml 蒸馏水，作为对照调零；测试管：3ml 反应混合液+1ml 酶液，立即开启秒表；测定 OD47

7、0 值（测定 40 秒），每隔 30s 读一次数。读四分钟,共 8次。（4）酶活性计算：以每 min OD 值变化（升高）0.01 为 1 个酶活性单位（u）。POD=（A470Vt）/（WVs0.01t）(u/g min)A470：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs 为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。2 2、过氧化氢酶（过氧化氢酶（CATCAT）活性测定）活性测定（1）试剂配制：0.15mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）：取 A 母液(Na2HPO4)457.5 ml 和B 母液(NaH2PO4

8、)292.5 ml 混合后用蒸馏水定容至 1000ml。（2）反应液配制：取 200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入 0.3092ml30%的 H2O2（原液）摇匀即可。（3）样品测定：取 3ml 反应液加入 0.1ml（可视情况调整）酶液，以 PBS 为对照调零，测定 OD240（紫外）（每隔 5s 读一次数，测定1min）。（4）酶活性计算：以每 min OD 值减少 0.01 为 1 个酶活性单位（u）。CAT=A240Vt/（WVs0.01t）(u/g min)A240：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提取酶液总体积（ml，

9、1.6ml）；Vs 为测定时取用酶液体积（ml,0.1ml）。五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA：100g 三氯乙酸 1L0.67%TBA：3.35g 硫代巴比妥酸 500ml 10%TCA（避光）2、测定步骤:0.2 样品+1.6ml 10%TCA 研磨12000g 离心 10min 上清 1.5ml+1.50.67%TBA 沸水煮 30min 冷却，离心上清 OD450，OD532，OD6003、计算组织中 MDA 含量：MDA 浓度 C(umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450MDA 含量(umol/g FW)=CV/W式中 V 为提取液体积(1

10、.6ml)，W 为样品鲜重(0.2g)。六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或 15ml 大离心管）中，加10ml 去离子水，在室温下放置 3h 使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1)；（3）再放入恒温水浴锅中在 100沸水浴中煮 20min 以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：相对电导率（%）=R1/R2100%还可以计算植株伤害程度：伤害率=（处理电导率对照电导率）/（煮沸电导率对照电导率）100%