金黄色葡萄球菌的测定.pdf

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1、金黄色葡萄球菌的测定 1 卫生学意义 金黄色葡萄球菌定性检验(增菌培养法)：适用于检查含有受损伤的金黄色 葡萄球菌的加工食品。2 检验方法 2.1 术语与定义 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为一种革兰氏染色阳性球形细 菌。显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽抱、鞭毛，大多数无荚膜。是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。2.2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：(1)恒温培养箱：36C 1C。(2)冰箱：2C5C。(3)恒温水浴箱：37C65C。(4)天平：感量 0.1g。(5)无菌吸管：1mL(具 0.

2、01m 该 U 度)、10mL(具 0.1m 该 U 度)或微量移液 器及吸头。(6)无菌锥形瓶：容量 100mL 500mL(7)无菌培养皿：直径 90mm(8)pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。2.3 培养基和试剂(1)7.5%氯化钠肉汤 1)成分：蛋白胨：10.0g;牛肉膏：5.0g;氯化钠：75g;蒸馏水：1000mL pH:7.4;2)制法：将上述成分加热溶解，调节 pH,分装，每瓶 225mL 121C高压灭 菌 15mi n。(2)B P 琼脂平板 1)成分：胰蛋白胨：10.0g;牛肉膏：5.0 g;酵母膏：1.0g;丙酮酸钠：10.0g;甘氨酸：12.0g;氯化锂(L

3、iCI 6H2O:5.0g;琼脂：20.0g;蒸馏水：950mL pH:7.0 0.2 2)增菌剂的配法：30%卵黄盐水 50ml 与经过除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10mL 混合，保存于冰箱内。3)制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节 pHo 分装每 瓶95mL 121C高压灭菌 15min。临用时加热溶化琼脂，冷至 50C，每 95m 加入预 热至50 C 的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5mL 摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过 48h。（3）脑心浸出液肉汤（BHI）1）成分：胰蛋白质胨：1 0.0g；氯化钠：5.0g；磷酸氢二钠（K2HPO4）：2

4、.5g；葡萄糖：2.0g；牛心浸出液：500mL；pH：7.40.2；2）制法：加热溶解，调节 pH,分装 16 mm 160 mm 试管，每管 5m 置 121C,15mi n 灭菌。（4）磷酸盐缓冲液 1）成分：磷酸二氢钾（KHPQ）:34.0g;蒸馏水：500mL pH:7.2;2）制法：贮存液：称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500m!蒸馏水中，用大约 175ml 的 1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.2，用蒸馏水稀释至 1000m 后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液 1.25mL，用蒸馏水稀释至 1000mL 分装于适宜容器中，121C高压灭菌 15mi n。（5）革兰

5、氏染色液 结晶紫染色液 1）成分：结晶紫：1.0g;95乙醇：20.0mL;1草酸铵水溶液：80.0mL;2）制法：将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液 1）成分：碘：1.0g;碘化钾：2.0g；蒸馏水：300mL 2）制法：将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解 后，再加蒸馏水至 300mL。沙黄复染液 1）成分：沙黄：0.25g;95%乙醇：10.0mL;蒸馏水：90.0mL 2）制法：将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。染色法 1）涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染 1min，水洗。2）滴加革兰氏碘液，作用 1min，水洗。3）滴加 95%乙醇

6、脱色 15s30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。4）滴加复染液，复染 1 min，水洗、待干、镜检。（6）无菌生理盐水 1）成分：氯化钠：8.5g；蒸馏水：1000mL；2）制法：称取 8.5g 氯化钠溶于 1000m 蒸馏水中，121C高压灭菌 15min。2.4 检验程序 2.5 操作步骤(1)样品的处理 称取 25g 样品至盛有 225mL7.58 氯化钠肉汤或10/氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无 菌均质杯内，8000r/min10000 r/min 均质 1min2 min,或放入盛有 225mL7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1

7、min2min。若样品为液态，吸取 25m!样品至盛有 225mL7.5%K 化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶中，振荡混匀。(2)增菌和分离培养 1)将上述样品匀液于 36C 1C培养 18h24h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化 钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。2)将上述培养物，分别划线接种到 B-P 平板和血平板，血平板 36C 1C培 养 18 h 24 h。B-P 平板 36C 1C培养 18 h 24 h 或 45 h 48 h。3)金黄色葡萄球菌在 B-P 平板上，菌落直径为 2mm-3mm 颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，

8、周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶 油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外 观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄 色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染 色镜检及血浆凝固酶试验。（3）鉴定 1）染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽 胞，无荚膜，直径约为 0.5 卩1 11 m 2）血浆凝固酶试验：挑取、B-P 平板或血平板上可疑菌落 1 个或 1 以上，分别 接种到 5mLBH

9、和营养琼脂小斜面，36C 1C培养 18h24h。取新鲜配置兔血浆 0.5mL,放入小试管中，再加入 BHI 培养物 0.2mL0.3mL,振荡摇匀，置 36C 1 C 温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察 6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒 置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血 浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的 试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面 的菌落到 5mL BHI,36C 1C培养 18h48h，重复试验。（4）葡萄球菌肠毒素的检验 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应 按附录 B 检测葡萄球菌肠毒素。2.6 结果与报告（1）结果判定：符合上述增菌和分离培养中的 3）、（3）鉴定，可判定为 金黄色葡萄球菌。（2）结果报告：在 25 g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。