分子生物学与医学诊断.ppt

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1、分子生物学与医学检验分子生物学与医学检验医学检测技术进展医学检测技术进展Molecular Biology and Laboratory Medicine分子诊断学的发展分子诊断学的发展分子诊断学分子诊断学 以分子生物学理论为基础，利用分子以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的构或表达调控的变化，为疾病的预防、预预防、预测、诊断、治疗和转归测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依提供信息和决策依据。据。分子生物学与医学检验分子生物学与

2、医学检验历史回顾历史回顾常规技术常规技术边缘技术边缘技术未来发展未来发展历史回顾历史回顾KanKan等用液相等用液相DNADNA分子杂交技术成功的进行分子杂交技术成功的进行镰形细胞贫血症的基因诊断镰形细胞贫血症的基因诊断 检验诊断进入基因诊断时代检验诊断进入基因诊断时代分子诊断学的发展分子诊断学的发展分子诊断学的发展分子诊断学的发展1988 Polymerase Chain Reaction(PCR)技术发表技术发表1990s 人类基因组计划人类基因组计划（HGP）启动启动1999 The journal of Molecular Diagnostics 出版出版分子诊断学的发展分子诊断学的发

3、展三大阶段：三大阶段：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断PCRPCR技术技术病原体检测及多基因遗传病病原体检测及多基因遗传病组学技术（组学技术（The Age of“Omics”）高通量密集型检测技术高通量密集型检测技术常规技术常规技术常规技术常规技术细胞水平细胞水平分子水平分子水平组学技术组学技术DNA免疫印迹免疫印迹ProteinELISAPCR测序测序流流氏氏细细胞胞仪仪各类各类Microarray常规技术常规技术基因结构异常基因结构异常基因表达异常基因表达异常蛋白质蛋白质m-RNADNA核酸分子杂交核酸分子杂交PCRDNA测序测序逆转录逆转录PCRRe

4、al-time PCRNothern-blotWestern-blot蛋白质组织化学染色蛋白质组织化学染色ELISA分子杂交类型分子杂交类型分子杂交技术分子杂交技术DNA of various sizesElectrophorese on agarose gelgelDenature-transfer to filter paperblot分子杂交技术分子杂交技术Hybridize to probe Visualize分子杂交技术分子杂交技术细胞遗传学细胞遗传学产前诊断产前诊断病原体诊断病原体诊断PCRPCR高灵敏度高灵敏度高特异性高特异性快速快速优优 势势PCRPCRPCRPCR法检测乙肝的

5、优势表现在：法检测乙肝的优势表现在：早期诊断，因为早期诊断，因为PCRPCR扩增极其敏感，在感染潜伏扩增极其敏感，在感染潜伏期即可被期即可被PCRPCR法检出。法检出。对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用一般酶标试剂无法检出，可以用PCRPCR法检出。法检出。疗效跟踪及病程判断，因为疗效跟踪及病程判断，因为PCRPCR能半定量检测乙能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指

6、标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。Western-blot 原理原理:在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测抗体来检测Western-blot蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 凝胶电泳凝胶电泳l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色流程流程新兴技术新兴技术新兴技术新兴

7、技术脉冲场凝胶电泳技术脉冲场凝胶电泳技术流式细胞仪的新应用流式细胞仪的新应用脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（PFGE）原理原理:这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，进行的，DNADNA分子在交替变换方向的电场中作出反分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNADNA越大，越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之

8、，动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的较小的DNADNA移动较快，于是不同大小的分子被成功移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。分离。脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（PFGE）The size of DNA is 3050 kbThe size of DNA larger than50 kb脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（PFGE）How we separated the larger DNA fragments,such as chromosome?脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（PFGE）原理原理:细菌包埋于琼脂块中细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原用适当的内切酶在原位对

9、整个细菌染色体进行酶切位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。好的分离。流式细胞仪流式细胞仪 流式细胞仪流式细胞仪(flow cytometer(flow cytometer，FCM)FCM)是进是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论、细胞荧光算机技术、激光技术、流体理论、细胞荧光化学技术及单克隆抗体技术于一体，被誉为化学技术及单克隆抗体技术于一体，被誉为实验室的实

10、验室的“CT”CT”。流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪Microbead流式细胞仪流式细胞仪A schematic illustration of using fluorescently microbeads 流式细胞仪流式细胞仪应用应用 细胞因子的联合检测细胞因子的联合检测 感染性疾病的联合诊断感染性疾病的联合诊断 研究研究RNARNA与蛋白质之间的相互作用与蛋白质之间的相互作用临床应用临床应用遗传性疾病的诊断遗传性疾病的诊断Sickle-cell anemia（镰状细胞性贫血）镰状细胞性贫血）Cystic Fibrosis（囊性纤维化）（囊性纤维化）Alpha-1-Antitryp

11、sin Deficiency （-1-抗胰蛋白酶缺乏症抗胰蛋白酶缺乏症）Sickle cell anemia-backgroundSickle cell anemiaSickle cell anemiaDNA Hybridization 1 Normal(AA)2 Abnormal(AS)3 Abnormal(SS)感染性疾病的诊断和检测感染性疾病的诊断和检测莱姆病莱姆病感染性疾病的诊断和检测感染性疾病的诊断和检测伯氏螺旋体伯氏螺旋体PCR法检测法检测感染性疾病的诊断和检测感染性疾病的诊断和检测厌氧菌、苛氧菌及不能人工培养的病原体厌氧菌、苛氧菌及不能人工培养的病原体的鉴定的鉴定治疗检测治疗检测

12、耐药基因的检测耐药基因的检测疾病的预测疾病的预测实验表明：实验表明：氨基糖苷类药物诱发非综合征耳聋的分氨基糖苷类药物诱发非综合征耳聋的分子基础为线粒体子基础为线粒体DNADNA中中12S rRNA12S rRNA基因基因A1555G A1555G 突变和突变和 C1494TC1494T突变。突变。疾病的预测疾病的预测P P5353基因突变使细胞增值加速，若同时基因突变使细胞增值加速，若同时其等位基因丢失则增值更为加速其等位基因丢失则增值更为加速一部分人直接由息肉转变成癌一部分人直接由息肉转变成癌C-mycC-myc的过量表达的过量表达K-rasK-ras的突变的突变癌基因激活癌基因激活抗癌基因

13、丢失抗癌基因丢失遗传型遗传型FAPFAP突变突变FAPFAP丢失丢失DCCDCC基因丢失基因丢失P53P53基因丢失基因丢失转移转移大肠癌大肠癌腺癌或息肉腺癌或息肉正常肠上皮细胞正常肠上皮细胞人大肠癌癌变的分子机理人大肠癌癌变的分子机理检测检测rasras方法方法PCR-ASOPCR-ASOPCR-SSCPPCR-SSCPDNADNA测序列测序列检测检测P53P53方法方法PCR小小 结结检验医学的发展方向检验医学的发展方向（1）分子诊断的内容从传统的）分子诊断的内容从传统的DNA诊断发展诊断发展到核酸及其表达产物（到核酸及其表达产物（mRNA、蛋白质）、蛋白质）的全面诊断；的全面诊断；（2）

14、分子诊断的策略从利用分子杂交、）分子诊断的策略从利用分子杂交、PCR等单一技术的诊断发展到有机组合多项技等单一技术的诊断发展到有机组合多项技术的联合诊断；术的联合诊断；（3）分子诊断的方法从定性诊断发展到半定）分子诊断的方法从定性诊断发展到半定量和定量诊断，核酸标记技术，特别是荧量和定量诊断，核酸标记技术，特别是荧光标记技术的发展，荧光定量光标记技术的发展，荧光定量PCR技术等技术等方法日益成熟；方法日益成熟；检验医学的发展方向检验医学的发展方向（4）分子诊断的范围从单基因疾病（孟德尔）分子诊断的范围从单基因疾病（孟德尔遗传性疾病，诸如白血病、早老症、血红蛋遗传性疾病，诸如白血病、早老症、血红

15、蛋白病、甲型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，白病、甲型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，人乳头瘤病毒等）的诊断发展到多基因病人乳头瘤病毒等）的诊断发展到多基因病（肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统（肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等）的诊断。疾病、自身免疫性疾病等）的诊断。（5）分子诊断的应用多治疗性诊断发展到预）分子诊断的应用多治疗性诊断发展到预防性分析评价，特别是针对高危人群进行疾防性分析评价，特别是针对高危人群进行疾病基因或疾病相关基因的筛查。病基因或疾病相关基因的筛查。检验医学的未来检验医学的未来在检验中，更多的应用核酸检测技术而非在检验中，更多的应用核酸检测技术而非针对抗体的检测技术针对抗体的检测技术使用微量技术使用微量技术在单一测定过程中同时分析得到多个结果在单一测定过程中同时分析得到多个结果使用非侵入性的方法采集标本使用非侵入性的方法采集标本