分子生物学研究法下.ppt

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1、无忧无忧无忧无忧PPTPPT整理发布整理发布整理发布整理发布第第六六章章分分子子生生物物学学研研究究法法（下下）content一、基因表达研究技术一、基因表达研究技术content 1995 1995年年VelculescuVelculescu等提出了基等提出了基因表达系列分析因表达系列分析(Serial Analysis(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)of Gene Expression,SAGE)技术，技术，能同时对上千个转录物进行研究。能同时对上千个转录物进行研究。A.A.基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术contentSAGESA

2、GE的主要依据有两个。的主要依据有两个。第一，一个第一，一个9 91010碱基的短核苷酸序列标签碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。例如，一个物。例如，一个9 9碱基顺序能够分辨碱基顺序能够分辨262144262144个不同的转录物个不同的转录物(4(49 9)，而人类基因组估计仅，而人类基因组估计仅能编码能编码8000080000种转录物，所以理论上每一个种转录物，所以理论上每一个9 9碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。第二，如果能将第二，如果能将9 9碱基的标签集中于一个克碱基的标签

3、集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的就能对数以千计的mRNAmRNA转录物进行分析。转录物进行分析。content 以以biotinylated oligo(dT)biotinylated oligo(dT)为引物反为引物反转录合成转录合成cDNAcDNA；以一种限制性内切酶以一种限制性内切酶(锚定酶锚定酶 Anchoring EnzymeAnchoring Enzyme，AE)AE)酶切。酶切。锚定酶要求至少在每一种转录物上有一个锚定酶要求至少在

4、每一种转录物上有一个酶切位点，一般酶切位点，一般4 4碱基限制性内切酶能达到这种碱基限制性内切酶能达到这种要求，因为大多数要求，因为大多数mRNAmRNA要长于要长于256256碱基碱基(4(44 4)。通过链霉抗生物素蛋白珠收集通过链霉抗生物素蛋白珠收集cDNA3cDNA3端部分。端部分。对每一个对每一个mRNAmRNA只收集其只收集其polyApolyA尾与最近尾与最近的酶切位点之间的片段。的酶切位点之间的片段。SAGESAGE的实验路线的实验路线content 将将cDNAcDNA等分为等分为A A和和B B两部分，分别两部分，分别连接接头连接接头A A或接头或接头B B。每一种接头都含

5、有标签酶每一种接头都含有标签酶(Tagging Enzyme TE)(Tagging Enzyme TE)酶切位点序列酶切位点序列(标签酶是一种标签酶是一种类限制酶，它能在距类限制酶，它能在距识别位点约识别位点约2020碱基的位置切割碱基的位置切割DNADNA双链双链)。接头的结构为引物接头的结构为引物A/BA/B序列序列+标签标签酶识别位点酶识别位点+锚定酶识别位点。锚定酶识别位点。content用标签酶酶切产生连有接头的短用标签酶酶切产生连有接头的短cDNAcDNA片段片段(约约9 91010碱基碱基)，混合并连接两个，混合并连接两个cDNAcDNA池的短池的短cDNAcDNA片段，构成双

6、标签后，片段，构成双标签后，以引物以引物A A和和B B扩增。扩增。用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签(Ditga)(Ditga)片段并克隆、测序。一般每一片段并克隆、测序。一般每一个克隆最少有个克隆最少有1010个标签序列，克隆的个标签序列，克隆的标签数处于标签数处于10105050之间。之间。对标签数据进行处理。对标签数据进行处理。contentcontentB.RNAB.RNA的选择性剪接技术的选择性剪接技术通过不同的剪接方式有一个通过不同的剪接方式有一个mRNAmRNA前前体产生不同的体产生不同的mRNAmRNA剪接异构体的过剪接异构体的过程程RNARNA

7、的选择性剪接的选择性剪接平衡剪接平衡剪接5 5/选择性剪接选择性剪接3 3/选择性剪接选择性剪接外显子遗漏性剪接外显子遗漏性剪接相互排斥性剪接相互排斥性剪接content使用使用RT-PCRRT-PCR技术技术对不同组织来源的对不同组织来源的RNARNA样品进行扩增样品进行扩增PCRPCR产物是否存在大小差异产物是否存在大小差异测序，差异产生的原因是否是选择性剪接测序，差异产生的原因是否是选择性剪接contentC.C.原位杂交技术原位杂交技术原位杂交技术原位杂交技术(In situ hybridizationIn situ hybridization，ISHISH)是分子生物学、组织化学及细

8、胞学相是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于结合而产生的一门新兴技术，始于2020世纪世纪6060年代。年代。19691969年美国耶鲁大学的年美国耶鲁大学的GallGall等首先用爪蟾等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时基因进行定位，与此同时BuongiornoBuongiornoNardelliNardelli和和AmaldiAmaldi等等(1970)(1970)相继利用同位相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。定位，从

9、而创造了原位杂交技术。content 原位杂交技术的原位杂交技术的基本原理基本原理是利用是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸将有放射性或非放射性的外源核酸(即即探针探针)与组织、细胞或染色体上待测与组织、细胞或染色体上待测DNADNA或或RNARNA互补配对，结合成专一的核互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。置显示出来。content为显示特定的核酸序列必须具备为显示特定的核酸序列必须具备3 3个重要

10、条件：个重要条件：u组织、细胞或染色体的固定；组织、细胞或染色体的固定；u具有能与特定片段互补的核苷具有能与特定片段互补的核苷 酸序列酸序列(即探针即探针)；u有与探针结合的标记物。有与探针结合的标记物。content基因组原位杂交技术基因组原位杂交技术 基因组原位杂交基因组原位杂交(Genome in situ(Genome in situ hybridizationhybridization，GISH)GISH)技术是技术是2020世纪世纪8080年代末发展起来的一种原位杂交技年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间术。它主要是利用物种之间DNADNA同源性同源性的差异，用另

11、一物种的基因组的差异，用另一物种的基因组DNADNA以适以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。原位杂交。GISHGISH技术最初应用于动物技术最初应用于动物方面的研究方面的研究content荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 荧光原位杂交荧光原位杂交(Fluorescence in situ(Fluorescence in situ hybridizationhybridization，FISH)FISH)技术是在已有的放射性技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性性DNADNA分子原位杂交技术

12、。分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或色体上或DNADNA显微切片上的特异显微切片上的特异fl-Nfl-N：-行杂交，行杂交，通过荧光检测系统通过荧光检测系统(荧光显微镜荧光显微镜)检测信号检测信号DNADNA序列在染色体或序列在染色体或DNADNA显微切片上的目的显微切片上的目的DNADNA序列，序列，进而确定其杂交位点。进而确定其杂交位点。FISH FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。和异常

13、染色体检测等领域。content多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交技术 多彩色荧光原位杂交多彩色荧光原位杂交(Multicolor(Multicolor fluorescence in situ hybridizationfluorescence in situ hybridization，mFISH)mFISH)是在荧光原位杂交技术的基础上发是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术。展起来的一种新技术。它用几种不同颜色的荧光素单独或混它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和

14、照片各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩上的颜色不同，呈现多种色彩，因而被称，因而被称为多彩色荧光原位杂交。为多彩色荧光原位杂交。它克服了它克服了FISHFISH技术的局限，能同时检技术的局限，能同时检测多个基因，在检测遗传物质的突变和染测多个基因，在检测遗传物质的突变和染色体上基因定位等方面得到了广泛的应用色体上基因定位等方面得到了广泛的应用contentcontentcontentcontentD.D.基因定点突变技术基因定点突变技术 定点突变定点突变是指通过聚合酶链式反应（是指通过聚合酶链式反应（PCR PCR）等方法向目的等方法向目的 DNA DNA 片段（可以是基片段

15、（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高迅速、高效的提高 DNA DNA 所表达的目的蛋白所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。常有用的手段。content点突变，也称作点突变，也称作 单碱基替换单碱基替换 （single single base substitution base substitution），），指由单个碱基改指由单个

16、碱基改变发生的突变。变发生的突变。可以分为转换（可以分为转换（transitions transitions）和颠换（和颠换（transversions transversions）两类。两类。转换：转换：嘌呤和嘌呤之间的替换，或嘧啶和嘌呤和嘌呤之间的替换，或嘧啶和嘧啶之间的替换。嘧啶之间的替换。颠换：颠换：嘌呤和嘧啶之间的替换。嘌呤和嘧啶之间的替换。content点突变可依发生位置对基因功能的影点突变可依发生位置对基因功能的影响而作以下分类：响而作以下分类：无义突变无义突变（nonsense mutation nonsense mutation）：）：使原本可制造使原本可制造 蛋白质蛋白质

17、的密码变成停的密码变成停止密码。止密码。错义突变错义突变（missense mutation missense mutation）：）：使密码所对应的氨基酸改变。使密码所对应的氨基酸改变。沉默突变沉默突变（silent mutation silent mutation）：）：密密码改变，但对应的氨基酸不变。码改变，但对应的氨基酸不变。contentcontentcontentcontent二、基因敲除技术二、基因敲除技术content 经典遗传学经典遗传学的认知路线为由表及里，即通过的认知路线为由表及里，即通过杂交等手段观察表型性状的变化而推知遗传基杂交等手段观察表型性状的变化而推知遗传基因的

18、存在与变化。因的存在与变化。反向遗传学反向遗传学是一条由里及表的认知路线，是一条由里及表的认知路线，即通过即通过DNADNA重组等技术有目的地、精确定位地重组等技术有目的地、精确定位地改造改造基因的精细结构以确定这些变化对表改造改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响。型性状的直接影响。content利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤基因载体的构建：基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的异片段同源的DNA DNA 分子都重组到带有分子都重组到带有标记基因标记基因(如如neo neo 基因

19、，基因，TK TK 基因等基因等)的载体上，成为重组载体。的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型其生理功能，所以一般设计为替换型载体载体contentES ES 细胞的获得：细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是及其常用的鼠的种系是及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的

20、理想实验动物。而其是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。被发展应用。content同源重组：同源重组：将重组载体通过一定的方式将重组载体通过一定的方式(电穿电穿孔法或显微注射孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细导入同源的胚胎干细胞胞(ES cell)(ES cell)中，使外源中，使外源DNADNA与胚胎干与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的将重组载体中的DNADNA序列整合到内源基序列整合到内源基因组中，从而得以表达。因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，一般地，显

21、微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用微注射低，但便于使用content选择筛选已击中的细胞：选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为低，动物的重组概率为10102 21010-5-5，植物的，植物的概率为概率为10104 410105 5。因此如何从众多细胞中。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。重要。目前常用的方法是正负筛选法（目前常用的方法是正负筛选法（PNSPNS法），法），标记基因的特异

22、位点表达法以及标记基因的特异位点表达法以及PCRPCR法。其中法。其中应用最多的是应用最多的是PNSPNS法。法。content 表型研究：表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。学形状的改变，达到研究目的基因的目的。得到纯合体：得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中体上中一条染色体中,所以如果要所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。型

23、，需要进行至少两代遗传。content基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤content由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠content 条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定义为将某个基可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶上，利用重组酶CreCre介导的位点特异性重介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范

24、围上组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的设置一个可调控的“按钮按钮”，从而使对小，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。控状态。content 利用利用CreCreLoxP LoxP 和来自酵母的和来自酵母的FLPfrt FLPfrt 系统可系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。致的表型。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的个同向排列的1oxP1oxP，并以此两侧装接上并以此两侧装接上loxP loxP 的

25、的(“loxP floxed”)ES(“loxP floxed”)ES 细胞产生细胞产生“loxP floxed”loxP floxed”小鼠小鼠,然后，通过将然后，通过将“loxP floxed”loxP floxed”小鼠与小鼠与Cre Cre 转转基因鼠杂交基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入也可以其他方式向小鼠中引入Cre Cre 重重组酶组酶)，产生靶基因发生特定方式，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特如特定的组织特异性异性)修饰的条件性突变小鼠。修饰的条件性突变小鼠。content 在在“loxP floxed”loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两小鼠，虽然靶基因的两

26、侧已各装上了一个侧已各装上了一个loxPloxP，但靶基因并没有发生但靶基因并没有发生其他的变化，故其他的变化，故“1oxP noxed”1oxP noxed”小鼠表型仍同小鼠表型仍同野生型的一样。野生型的一样。但当它与但当它与Cre Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有代中将同时带有“loxP floxed”loxP floxed”靶基因和靶基因和Cre Cre 基因。基因。Cre Cre 基因表达产生的基因表达产生的Cre Cre 重组酶就会介导靶重组酶就会介导靶基因两侧的基因两侧的1oxP 1oxP 间发生切除反应，结果将一个间发生切除反应，结果将一

27、个loxP loxP 和靶基因切除。这样，靶基因的修饰和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切切除除)是以是以Cre Cre 的表达为前提的。的表达为前提的。content Cre Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰的表达特性决定了靶基因的修饰(切除切除)持性：即持性：即Cre Cre 在哪一种组织细胞中表在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰达，靶基因的修饰(切除切除)就发生在哪种组织就发生在哪种组织细胞；而细胞；而Cre Cre 的表达水平将影响靶基因在此的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制所以只要控制Cre Cre 的表达特异性和表的

28、表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。性和程度。content条条件件性性基基因因敲敲除除的的基基因因重重组组及及切切除除步步骤骤content 诱导性基因敲除也是以诱导性基因敲除也是以Cre/loxp Cre/loxp 系统系统为基础，但却是利用控制为基础，但却是利用控制Cre Cre 表达的启动表达的启动子的活性或所表达的子的活性或所表达的Cre Cre 酶活性具有可诱酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用或利用Cre Cre 基因定位表达系统中载体的宿基因定位表达系统中载体

29、的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP 1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。基因敲除技术。content 人们可以通过对诱导剂给予时间的预人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。物出生后不久即死亡的现

30、象。常见的几种诱导性类型如下：四环素常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。病毒介导型。content四环素诱导的基因敲除过程四环素诱导的基因敲除过程content 基因捕获法是最近发展起来的利用随基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。机插入突变进行基因敲除的新型方法。通常基因捕获载体还包括一个无启动通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是子的报道基因，通常是neo neo 基因，基因，neo neo 基基因插入到因插入到ES ES 细胞染色体组中，并利用捕细胞染色体组中，并利用

31、捕获基因的转录调控元件实现表达的获基因的转录调控元件实现表达的ES ES 克克隆可以很容易地在含隆可以很容易地在含G418 G418 的选择培养基的选择培养基中筛选出来。中筛选出来。从理论上讲，在选择培养基中存活的从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该克隆应该100100地含有中靶基因。中靶基地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNAcDNA或染色体组序列分析来获得。或染色体组序列分析来获得。content需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白content插入了靶目标的基因转录翻译出无活插入了靶目标的基因转录

32、翻译出无活性的目标蛋白随机插入内含子中性的目标蛋白随机插入内含子中content需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白content 农杆菌农杆菌Ti(tumor inducing)Ti(tumor inducing)或或Ri(root inducing)Ri(root inducing)质粒中的一段质粒中的一段DNADNA序列序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中到植物核基因组中,已成为植物分子生物学中广泛应用已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。的遗传转化载体。农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴农杆菌是普遍存

33、在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有有TiTi质粒和质粒和RiRi质粒，其上有一段质粒，其上有一段T-DNAT-DNA，农杆菌通农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNAT-DNA插入到植插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的

34、传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNAT-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。术，再生出转基因植株。contentcontent三、蛋白质及三、蛋白质及RNARNA相互作用技术相互作用技术content 酵母单杂交技术最早是酵母单杂交技术最早是19931993年由年由LiLi等从酵母等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析检测，分析DNADNA与蛋白之间的相互作用，以研究与

35、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。化手段难以纯化的特定转录因子。A.A.酵母单杂交系统酵母单杂交系统content 酵母单杂交酵母单杂交(Yeast one-hybrid)(Yeast one-hybrid)是根据是根据DNADNA结合蛋白结合蛋白(即转录因子即转录因子)与与DNADN

36、A顺式作用元件结顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因异结合的转录因子基因(cDNA)(cDNA)的有效方法。的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由子由物理和功能上独立的物理和功能上独立的DNADNA结合区结合区(DNA-(DNA-binding domain BD)binding domain BD)和转录激活区和转录激活区(Activation domain AD)(Activation domain AD)组成，因此可构建组成，因此可构建各种基因与各种基因与ADA

37、D的融合表达载体，在酵母中表达的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。contentv将将已已知知顺顺式式作作用用元元件件构构建建到到最最基基本本启启动动子子（PminPmin）的的上上游游，把把报报告告基基因因连连接接到到PminPmin下下游游。将将编编码码待待测测转转录录因因子子cDNAcDN

38、A与与已已知知酵酵母母转转录录激激活活结结构构域域（ADAD）融融合合表表达达载载体体导导入入酵酵母母细细胞胞，该该基基因因产产物物如如果果能能够够与与顺顺式式作作用用元元件件相相结结合合，就就能能激激活活 PminPmin启动子，使报告基因得到表达。启动子，使报告基因得到表达。content从从拟拟南南芥芥cDNA文文库库中中 筛筛选选与与顺顺式式元元 件件DRE结结合合的的 转转录录因因子子示示意意图。图。contentB.B.酵母双杂交系统酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是将待研究的酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子

39、表达质粒的转录激活因子(如如GAL4GAL4等等)的的DNADNA结合结构域基因和结合结构域基因和GAL4GAL4激活激活结构域基因，构建成融合表达载体，结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。用的系统。content 转录激活因子在结构上是组件式的转录激活因子在结构上是组件式的(modular),(modular),即这些因子往往由两个或两个以即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成上相互独立的结构域构成,其中有其中有DNADNA结合结结合结构域构域(DNA binding domain,(DNA binding dom

40、ain,简称为简称为DB)DB)和转录和转录激活结构域激活结构域(activation domain,(activation domain,简称为简称为AD)AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的单独的DBDB虽然能和启动子结合虽然能和启动子结合,但是不能但是不能激活转录。激活转录。而不同转录激活因子的而不同转录激活因子的DBDB和和ADAD形形成的成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。content 酵母双杂交的基本原理示意图酵母双杂交的基本原理示意图contentcontentC.C.体外蛋白质相互作

41、用技术体外蛋白质相互作用技术Far WesternFar Western印迹技术印迹技术用用32P32P标标记记的的体体外外表表达达蛋蛋白白作作探探针针,直直接接检检测测 与与该该蛋蛋白白发发生生相相互互作作用用的的蛋蛋白白或表达该蛋白或表达该蛋白 的的cDNAcDNA。contentcontentGSTGST融合蛋白沉降技术融合蛋白沉降技术利利用用GSTGST对对谷谷胱胱甘甘肽肽偶偶联联的的琼琼脂脂糖糖球球珠珠的的亲亲 和和性性，从从混混合合蛋蛋白白质质样样品品中中纯纯化化得到相互作得到相互作 用蛋白。用蛋白。contentcontent蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术蛋蛋白白质质芯芯片片可可以

42、以用用来来大大规规模模筛筛选选蛋蛋白白之之间间的的 相相互互作作用用。将将荧荧光光标标记记的的探探针针蛋蛋白白与与蛋蛋白白质质 芯芯片片孵孵育育，洗洗脱脱非非特特异异性性结结合合的的蛋蛋白白后后，可可 以以通通过过扫扫描描芯芯片片上上的的荧荧光光点点检检测测到到稳定的相稳定的相 互作用蛋白点。互作用蛋白点。contentcontent免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术将将靶靶蛋蛋白白的的抗抗体体连连接接到到固固体体基基质质上上，再再将将可可 能能与与靶靶蛋蛋白白发发生生相相互互作作用用的的待待筛筛选选蛋蛋白白加加入入 反反应应体体系系中中，用用低低离离心心力力沉沉淀淀或或微微膜膜过过滤滤法法 在在固

43、固体体基基质质和和抗抗体体的的共共同同作作用用下下将将蛋白复合蛋白复合 物沉淀到试管的底部或微膜上。物沉淀到试管的底部或微膜上。contentcontentD.D.细胞内蛋白质相互作用研究细胞内蛋白质相互作用研究荧光共振能量转移法（荧光共振能量转移法（FRETFRET）vFRETFRET荧光能量转移有三个基本条件：荧光能量转移有三个基本条件：n给体与受体在合适的距离（给体与受体在合适的距离（1 110 nm10 nm）；）；n给给体体的的发发射射光光谱谱与与受受体体的的吸吸收收光光谱谱有有一一定定的重叠（这是能量匹配的条件）；的重叠（这是能量匹配的条件）；n给给体体与与受受体体的的偶偶极极具具

44、有有一一定定的的空空间间取取 向向（这是偶极（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。偶极耦合作用的条件）。contentcontentE.RNAiE.RNAi（RNARNA干涉）技术及其应用干涉）技术及其应用 利用双链小利用双链小RNARNA高效、特异性降解高效、特异性降解细胞内同源细胞内同源mRNAmRNA从而阻断靶基因表达，从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。使细胞出现靶基因缺失的表型。content这些小的双链这些小的双链RNARNA称为称为siRNA siRNA（Small/short Small/short interfering RNA interfering RNA，siR

45、NAsiRNA）。研究发现，双链研究发现，双链RNARNA是是RNAiRNAi的触发物，引的触发物，引 发发与之互补的单链与之互补的单链RNARNA（ssRNA,single-ssRNA,single-stranded RNAstranded RNA）的降解。）的降解。content发现发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。又先后发现小鼠早期几乎所有的真核生物中细胞。又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在干扰现象胚胎中和大肠杆菌中

46、也存在干扰现象 siRNA在细胞内在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶再与体内一些酶(包包括内切酶、外切酶、解旋酶等括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成结合形成RNA诱导诱导的沉默复合物的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。contentcontentcontentcontent四、基因芯片及数据分析四、基因芯片及数据分析content基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析基基因因芯芯片片（DNA DNA chipchip），又又称称DNADNA微微阵阵列

47、列 （DNA DNA microarraymicroarray）技技术术是是能能同同时时监监测测大大量量靶靶 基基因因表表达达的的实实验验手手段段，从从而而迅迅速速准准确确地地在在基基因因组组水水平平上上阐阐述不同生物组织或细胞中各种转录述不同生物组织或细胞中各种转录 本的变化规律。本的变化规律。该技术系指将大量（通常每平方厘米点该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于阵密度高于 400 400）探针分子固定于支持）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和

48、序列信息。而获取样品分子的数量和序列信息。content在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAGTATGCAATCTAG，与基因芯片与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。据此可重组出靶核酸的序列。content基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定研制方向的确定基因

49、组序列分析与待检基基因组序列分析与待检基因探针序列的确定因探针序列的确定检测样品检测样品 的制备的制备探针阵列的探针阵列的准备准备检测设备的检测设备的研制研制杂交检测与数据分析杂交检测与数据分析content基因芯片技术的主要特点：基因芯片技术的主要特点：技术操作简单技术操作简单 自动化程高自动化程高 序列数量大序列数量大 检测效率高检测效率高 应用范围广应用范围广 成本相对低成本相对低contentcontent五、利用酵母鉴定五、利用酵母鉴定靶基因功能靶基因功能content六、其他分子生物学技术六、其他分子生物学技术content凝胶阻滞实验凝胶阻滞实验（electrophoretic

50、mobility shift assay,EMSAelectrophoretic mobility shift assay,EMSA）又叫作又叫作DNADNA迁移率变动试验（迁移率变动试验（DNA mobility DNA mobility shift assayshift assay），是用于体外研究），是用于体外研究DNADNA与蛋与蛋白质白质 相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。content原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的裸露的DNADNA朝正电极移动的距离与其分朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。子量