常用分子生物学技术原理及应用.ppt

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1、第二十一章第二十一章常用分子生物学技常用分子生物学技术的原理及应用术的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology:The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and ApplicationPrinciple and Application生物化学教研室 分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization&Molecular Hybridization&Blotting TechnologyBlotting Technology第第 一一 节节DN

2、ADNA变性的本质是双链间变性的本质是双链间氢键氢键的断裂的断裂例：例：变性引起紫外吸收值的改变变性引起紫外吸收值的改变DNADNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNADNA变性时其溶液变性时其溶液A A260260增高的现象。增高的现象。热变性热变性解解链链曲曲线线：如如果果在在连连续续加加热热DNADNA的的过过程程中中以以温温度度对对A A260260（absorbanceabsorbance，A A，A A260260代代表表溶溶液液在在260nm260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。Tm：(meltingte

3、mperature)变性是在一个变性是在一个相当窄的温度范相当窄的温度范围内完成，在这围内完成，在这一范围内，紫外一范围内，紫外光吸收值达到最光吸收值达到最大值的大值的50%50%时的时的温度称为温度称为DNADNA的的解链温度，又称解链温度，又称融解温度融解温度。其大小与其大小与G+CG+C含量成正比。含量成正比。DNADNA的复性的复性 复性复性(renaturation):(renaturation):在适当条件下，变性在适当条件下，变性在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNADNADNA的两条互补链可恢的两条互补链可恢的两条互补链可恢的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。复天然的

4、双螺旋构象。复天然的双螺旋构象。复天然的双螺旋构象。退火退火(annealing):(annealing):热变性的热变性的热变性的热变性的DNADNADNADNA经缓慢冷却后即可复性经缓慢冷却后即可复性经缓慢冷却后即可复性经缓慢冷却后即可复性复性条件：复性条件：Tm Tm 25250 0C C 4 4度以下几乎不复性度以下几乎不复性（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization)(nucleic acid hybridization)在在DNADNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNADNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中

5、，或或把把DNADNA与与RNARNA放放在在一一起起，只只要要在在DNADNA或或RNARNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂杂化双链化双链(heteroduplex)(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理DNA-DNADNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNADNA分子分子核酸分子杂交核酸分子杂交 (hybridization)(hybridization)复性复性RNADNA1.1.原理原理 变性与复性变性与

6、复性2.2.常见条件：加热常见条件：加热 S S形曲线形曲线 解链温度（解链温度（T Tmm）A A260260增高的原因增高的原因3.3.分子杂交的目的分子杂交的目的核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用研究研究DNADNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置鉴定两种核酸分子间的序列相似性鉴定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 （二）探针技术（二）探针技术 探针探针 (probe)(probe)一一小小段段用用同同位位素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料标标标标记记其其末末端端或或

7、全全链链的的已已知知序序列列的的多多聚聚核核苷苷酸酸，与与固固定定在在NCNC膜膜上上的的核核苷苷酸酸结结合合，判判断断是是否否有有同同源源的的核酸分子存在。核酸分子存在。探针标记方法探针标记方法:放射性：放射性：3232P P、3535S S和和3 3H H 非放射性：非放射性：生物素、地高辛素、生物素、地高辛素、荧光素荧光素 (FITCFITC、罗丹明、罗丹明)二、印迹技术二、印迹技术（印迹杂交）（印迹杂交）将在凝胶中分离的生物大分子转移将在凝胶中分离的生物大分子转移（印迹）或直接放在固定化介质上并（印迹）或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。加以检测分析的技术。广泛应用于广泛应用于

8、DNADNA、RNARNA、蛋白质检测蛋白质检测电转移印迹技术、真空吸引转移印迹电转移印迹技术、真空吸引转移印迹印迹技术的分类及应用印迹技术的分类及应用（一）（一）DNADNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting)(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒、重组质粒和噬菌体的分析。和噬菌体的分析。（二）（二）RNARNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting)(Northern blotting)用于用于RNARNA的定性定量分析。的定性定量分析。其他其他斑点印迹斑点印迹 (dot blotting)(dot blotti

9、ng)原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)(in situ hybridization)DNADNA点阵点阵 (DNA array)(DNA array)DNADNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)(DNA chip)（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)(Western blotting)用于蛋白质定性、定量及相互作用用于蛋白质定性、定量及相互作用 研究。研究。（一）（一）DNADNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting)(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNADNA、重组质

10、粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。从组织或细胞中从组织或细胞中提取提取基因组基因组DNADNA限制性限制性内切内切酶酶消化消化琼脂糖琼脂糖凝胶凝胶电泳电泳将将DNADNA按大小分按大小分离离含有含有DNADNA区带的凝胶在变性溶液中区带的凝胶在变性溶液中变性变性 DNA DNA 变性后从变性后从凝胶凝胶转移转移到固相支持物上到固相支持物上特特异性探针与固着于膜上的异性探针与固着于膜上的DNADNA杂交杂交杂交结果杂交结果反映待测核酸样品的有关反映待测核酸样品的有关基因信息基因信息。Southern印迹法印迹法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转

11、移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜SouthernSouthern和和和和WesternWestern印迹法印迹法印迹法印迹法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiog

12、ramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody,Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography分子杂交实验分子杂交实验（二）（二）RNARNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting)(Northern blotting)(Northern blotting)(Northern blotting)基本过程与基本过程与Souther

13、n blottingSouthern blotting相似。用于相似。用于RNARNA的定性定量的定性定量分析。分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)(Western blotting)(Western blotting)(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。常用常用A Ab b来检测蛋白质，也被称为来检测蛋白质，也被称为免疫免疫印迹技术印迹技术 。靠靠电转移电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。将蛋白质从凝胶转移到膜上。实验操作实验操作 1 1 细胞裂解物的准备；细胞裂解物的准备；2

14、 2 细胞裂解物的蛋白定量；细胞裂解物的蛋白定量；3 3 细胞裂解物的细胞裂解物的SDS-PAGESDS-PAGE；4 4 蛋白质的转移；蛋白质的转移；6 6 目的蛋白质的检测。目的蛋白质的检测。蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量测定相对含量时，需要内参照测定相对含量时，需要内参照选择合适的反应条件：选择合适的反应条件：SDS-PAGESDS-PAGE胶浓度；胶浓度；转移膜的选择；转移时间的选择转移膜的选择；转移时间的选择注意电极的正负极注意电极的正负极抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡抗体反应时，

15、注意驱除反应袋内气泡操作要轻柔。操作要轻柔。蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较12月24日上午9：00分子杂交实验分子杂交实验放放射射自自显显影影照照片片DNA点阵点阵1、印迹技术的分类、印迹技术的分类本节要点聚合酶链反应聚合酶链反应Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction第二节第二节PCR概述概述 概念：概念：PCR是体外模拟天然是体外模拟天然DNADNA复制过程的核酸扩增技术。复制过程的核酸扩增技术。PCR类似于类似于DNADNA在细胞内的复在细胞内的复制过程，可以将微量目的基因扩增制过程，可以将

16、微量目的基因扩增一百万倍以上。一百万倍以上。19851985年，美国年，美国PE CetusPE Cetus公司的公司的Kary MullisKary Mullis建立了建立了PCRPCR技术，使人们能够通过试技术，使人们能够通过试管内的数小时反应将特定的管内的数小时反应将特定的DNADNA片段扩增数百万倍，片段扩增数百万倍，Kary Kary MullisMullis因此获因此获19931993年度诺贝尔年度诺贝尔化学奖。化学奖。聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应 (Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction(Polymerase

17、Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction，PCR)PCR)PCR)PCR)原理原理 类似于类似于DNADNA的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增DNADNA模板加热模板加热变性变性解链，随之将反应混合物解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生序列发生退火退火，再将温度升高使退火引物在，再将温度升高使退火引物在DNADNA聚合酶作用下得以聚合酶作用下得以延伸延伸。这种这种热变性热变性-复性复性-延伸延伸的过程就是一个的过程就是一个PCRPCR循环，循环，PCRPCR就是在合适条件

18、下的这种循环的就是在合适条件下的这种循环的不断重复。不断重复。一、一、PCRPCR反应体系反应体系MgMg2+2+模板模板DNADNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶dNTPsdNTPsn1 1、DNADNA聚合酶聚合酶nTaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶：水生栖热菌水生栖热菌(thermusthermus aquaticus,Taqaquaticus,Taq)的的DNADNA聚合酶聚合酶 作用：作用：553DNA3DNA聚合酶活性；聚合酶活性；无无3355外切酶活性外切酶活性，3535轮轮0.25%0.25%错配错配，与原始模板有差别；与原始模板有差别；最适温度：最

19、适温度：7272，选择，选择7272延伸延伸半衰期：半衰期：92.5 130min 92.5 130min 95 40min 95 40min 97.5 5 97.5 56min6min 延伸温度（延伸温度（7272）9595使其在使其在整个扩增循环中保持足够活性整个扩增循环中保持足够活性pfu DNApfu DNA聚合酶聚合酶作用：作用：5 53 3DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 3 355外切酶活性外切酶活性优点：优点：耐热、耐热、精确度精确度 pfu Taqpfu Taq不足：不足：但但pfupfu扩增效率通常比扩增效率通常比TaqTaq酶略差酶略差文献报道：文献报道：Taq+pfu

20、Taq+pfu 会起到较好效果会起到较好效果 n 2 2.引物引物n 人人工工合合成成短短寡寡核核苷苷酸酸20bp-25bpTm=55-6020bp-25bpTm=55-60，nTmTm值要相近，每条值要相近，每条10-50pmol/10010-50pmol/100 l l n 设计原则：设计原则：（1 1）靠近靠近55上游上游PrimerPrimer与双链与双链DNADNA正链相同正链相同 （2）Primer本身不要出现内部互补序列形成本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构环，内部二级结构（3）注意减少注意减少Primer间互补序列间互补序列导致导致2个个Primer形成形成d

21、imer一般不要超过一般不要超过3个互补个互补bp（4）Primer5未端可修饰、突变未端可修饰、突变（5）primer5端增加碱基端增加碱基 3.3.模板：模板：可选：可选：DNADNA mRNAmRNA逆转录逆转录cDNAcDNA DNA DNA包括：包括：质粒质粒 噬菌体噬菌体 染色体染色体DNADNA 模板用量模板用量 Plasmid:lngPlasmid:lng Chromosome:300-500ng Chromosome:300-500ng 注意：注意：防止交叉污染防止交叉污染4.dNTP4.dNTP：四种脱氧核苷酸：基本原料四种脱氧核苷酸：基本原料终浓度：终浓度：5050 M

22、M 注意：不稳定，保存时间长会失效注意：不稳定，保存时间长会失效 5.Mg5.Mg2+2+TaqDNA TaqDNA聚合酶作用时需要聚合酶作用时需要MgMg2+2+不同的酶需不同不同的酶需不同MgMg2+2+外界影响：外界影响：EDTAEDTA鳌合鳌合MgMg2+2+选较低浓度选较低浓度TE(10mM TE(10mM Tris,1mMEDTA)Tris,1mMEDTA)；DNADNA模板、引物和模板、引物和dNTP dNTP 的磷酸基团均可与的磷酸基团均可与MgMg2+2+结合，结合，降低降低MgMg2+2+有效浓度。有效浓度。如果扩增产如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的物或效率不理想

23、，要注意调整合适的MgMg2+2+浓度浓度 （1 1）变性温度：）变性温度：94-9594-95 GCGC比例高、长度很长，比例高、长度很长，TT （2 2）退火：）退火：温度越高，扩增特异性越好温度越高，扩增特异性越好取决于取决于TmTm值：值：TmTm退火退火TT；TmTm退火退火TT若若TmTm较高，可使退火和延伸在同一温度较高，可使退火和延伸在同一温度（3 3）延伸：）延伸：500nt-1min 500nt-1min 500nt500nt3min3min一般：一般：404060sec60sec6.6.温度温度二、二、PCRPCR技术的工作原理技术的工作原理变性变性95C延伸延伸72C7

24、2C退火退火TmTm5C5C5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 基本工作原理基本工作原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNADNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析三、三、

25、PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途四、几种重要的四、几种重要的PCRPCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCRPCR技术技术（二）原位（二）原位PCRPCR技术技术（三）实时（三）实时PCRPCR技术技术 利用实时荧光定量利用实时荧光定量PCRPCR的原理，对的原理，对DNADNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系统。该方法精确、灵敏、污染途径小。是国统。该方法精确、灵敏、污染途径小。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。际公认的核酸分子定量的标准方法。它是在它是在PCRPCR体系中加入荧光基团，利用体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实

26、时检测整个荧光信号积累实时检测整个PCRPCR过程，最后过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。法。它已逐渐代替了它已逐渐代替了Norther blot Norther blot 以及以及semiRT-PCRsemiRT-PCR技术。技术。Real-time PCR实时实时PCRPCR技术原理技术原理本节要点1、PCR技术的基本原理技术的基本原理第三节第三节 核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert(Max

27、am-Gillbert法法)DNADNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (sanger(sanger法法)DNADNA测序的基本战略测序的基本战略 设设法法产产生生带带标标记记的的不不同同长长度度的的成成套套DNADNA片片段段，各各带带有有标标记记的的片片段段起起点点相相同同、终终点点不不同同，使使待待测测的的DNADNA链链中中的的相相应应每每个个核核苷苷酸酸处处都都有有断断裂裂或或终终止止。通通过过PAGEPAGE电电泳泳，能能够够将将相相差差一一个个核核苷苷酸酸的的DNADNA片片段段分分开开，放放射射自自显显影影后后，根根据据长长短短排排列列，根根据据特特定定末末端端碱碱基基的

28、的DNADNA片片段段就就可可读出待测读出待测DNADNA的碱基序列。的碱基序列。酶法酶法 化学法化学法 测序技术进展测序技术进展酶酶法法序序列列分分析析的的原原理理 酶酶反反应应电电泳泳方方向向模板模板CCGGTAGCAACT35GG53引物引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTA C G TAGTTGC

29、TACC35TCAACGATGG53读出模板读出模板互补序列互补序列读出模板读出模板序列序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNADNA的的的的SangerSanger测序法测序法测序法测序法(酶法酶法酶法酶法)读出模板互读出模板互补序列补序列dNTP 凝胶电泳凝胶电泳 较大片段较大片段 较小片段较小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反应混合物反应混合物Klenow酶酶 未知序列的单链未知序列的单链DNA 读出待测读出待测序列序列CTGACTTCGACAAAGAA

30、53 放射性标记的引物放射性标记的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT35CTGACTTCGACAA53DNA的测序仪示意图的测序仪示意图computer analysis凝胶中凝胶中DNA移动方向移动方向样品槽样品槽激光器激光器输入光学系统输入光学系统成象透镜成象透镜聚焦透镜聚焦透镜高灵敏度相机高灵敏度相机旋光镜旋光镜/棱镜组件棱镜组件DNA的化学测序示意图的化学测序示意图 反应试剂反应试剂G反应：硫酸二甲酯反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸反应：甲酸T+C反应：肼反应：肼C反应：反应：NaCl+肼肼一、化学裂解法一、化学裂解法(Maxam-Gillbe

31、rt法法)基本原理基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1 1个或个或2 2个个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的的DNADNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的55末端，经放末端，经放射自显影即可在射自显影即可在X X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序

32、列。二、二、DNADNA链末端合成终止法链末端合成终止法爱咪出版社公司内部档案数据目录 爱咪出版社公司内部档案数据目录 三、三、DNADNA自动测序自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNADNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行SangerSanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNADNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出

33、四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧荧光光信信号号，并并依依此此确确定定DNADNA碱基的排列顺序碱基的排列顺序。DNADNA自动测序结果举例自动测序结果举例基基 因因 文文 库库Gene LibraryGene Library第四节第四节基因组基因组DNADNA文库文库 (genomic DNA library)cDNAcDNA文库文库 (cDNA library)基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列的克隆群体。序列的克隆群体。基因组基因组DNA文库文库第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选

34、第三轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部件下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、二、cDNA文库文库 第五节第五节 生物芯片技术生物芯片技术BiologicalChipTechnology是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段或片段或cDNAcDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定片段作为探针，有规律地紧密排列

35、固定于单位面积的支持物上于单位面积的支持物上 ，然后与待测的，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用激光荧光标记样品进行杂交，杂交后用激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一探针位点的荧光通过计算机系统对每一探针位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。得出定性和定量的结果。一、基因芯片一、基因芯片(genechip)目目 录录基基因因芯芯片片技技术术原原理理 是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当

36、与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白白进行定性和定量分析的一种技术。进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片第六节第六节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换

37、效应分析噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融标签融合蛋白合蛋白沉淀实

38、沉淀实验流程验流程示意图示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途n酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BDBD基因融合基因融合成为成为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选ADAD基因融基因融合的合的“猎物猎物”基因表达

39、文库，筛选未知的相基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。互作用蛋白质。电电 泳泳 迁迁 移移 率率 变变 动动 测测 定定(electrophoretic(electrophoretic mobility mobility shift shift assayassay，EMSA)EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动实实验验(gel(gel shift shift assay)assay)最最初初用用于于研研究究DNADNA结结合合蛋蛋白白与与相相应应DNADNA序序列列间间的的相相互互作作用用，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究的的经经典

40、典方方法法。目目前前这这一一技技术术也也被被用用于于研研究究RNARNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定RNARNA序列间的相互作用。序列间的相互作用。二、二、DNA-DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀技技术术(chromatin(chromatin immunoprecipitati

41、on immunoprecipitation assay,assay,ChIP)ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体体内内DNADNA与与蛋蛋白白质质相相互互作作用用的主要方法。的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图遗传修饰动物模型的建立及应用遗传修饰动物模型的建立及应用T The Establishment and Application of he Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model Heredity-Mod

42、ified Animal Model 第七节第七节n转基因技术转基因技术采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵细细胞胞或或胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导导入入动动物物子子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)(transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术n核转移技术核转移技术 即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物的的一一个个体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个体体

43、的的去去胞胞核核的的的的激激活活的的卵卵细细胞胞内内，使使之发育成个体，即克隆之发育成个体，即克隆(clone)(clone)。二、核转移技术二、核转移技术n基因剔除技术基因剔除技术(gene knock(gene knock out)out)也称也称基因靶向基因靶向(gene targeting)(gene targeting)灭活灭活，有目的去除动物体内某种基因有目的去除动物体内某种基因的技术。的技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术将灭活的基因放入胚胎干细胞将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonic stem cell(embryonic stem cell，ES)ES)中，使这一灭

44、中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。体小鼠。n操作方式操作方式n建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function(gain-of-function mutation)mutation)多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型四、基因转移和基因

45、剔除在医学四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用发展中的作用疾病相关基因的疾病相关基因的克隆与鉴定克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Cloning and Identification of Disease Relative GenesRelative Genes第第 八八 节节克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆(functional cloning)(functional cloning)（二）定位克隆（二）定位克隆(positional cloning)(positional cloning)（

46、三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略(position-(position-independent candidate gene independent candidate gene approaches)approaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positional (positional candidate gene approaches)candidate gene approaches)定义定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。克隆该致病基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆应用应用

47、 生化机制已明确、基因表达产物较易生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。得到部分纯化的遗传性疾病。克隆方式克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNAcDNA文库；文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选酸作探针，筛选cDNAcDNA文库。文库。功能互补试验功能互补试验 (functional complementation assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩从一种致病基因的染色体

48、定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析(确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常(缺失、易位等缺失、易位等)分析、基分析、基因文库的筛选与基因克隆因文库的筛选与基因克隆（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种定位，直接根据病理学变化和对各种基因

49、产物功能的了解，预测出候选致基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。病基因。（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。致病基因。基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗第九节第九节GeneDiagnosisandGeneTherapyn定义定义直接检测基因结构及其表达水平是否正常，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。从而对疾病作出诊断的方法。一、基因诊断一、基因诊断(Gen

50、e Diagnosis)(Gene Diagnosis)n特点特点以基因作为检查材料和探察目标，属于以基因作为检查材料和探察目标，属于“病因诊断病因诊断”。针对特定基因，特异性强。针对特定基因，特异性强。所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高。所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高。适用性强，诊断范围广。适用性强，诊断范围广。1.1.DNADNA序列分析序列分析用于基因突变类型已经明确的遗传用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断病的诊断及产前诊断 。2.2.PCRPCR技术技术快速检出样品中的痕量病原微生物。快速检出样品中的痕量病原微生物。微量微量DNA DNA 样品中的基因及基因变异分