仪器分析-紫外—可见分光光度法PPT课件.ppt

《仪器分析-紫外—可见分光光度法PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《仪器分析-紫外—可见分光光度法PPT课件.ppt（123页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、仪 器器 分分 析析1.学学 习习 内内 容容（第（第 69 周）周）紫外紫外-可可见见分光光度法（第分光光度法（第3 3章）章）分子分子发发光分析法（第光分析法（第5 5章）章）红红外光外光谱谱法（第法（第4 4章）章）分子分子?光光谱2.第第3 3章章 紫外紫外-可可见见分光光度法分光光度法ultraviolet and visible spectrophotometry（UV-Vis）3.1 紫外紫外-可可见吸收光吸收光谱3.2 光的吸收定律光的吸收定律3.3 紫外紫外-可可见分光光度分光光度计3.4 分析条件的分析条件的选择3.5 紫外紫外-可可见吸收光吸收光谱法的法的应用用3.基本概

2、念基本概念spectrum：复色光被色散系复色光被色散系统分光后按照波分光后按照波长或或频率的大小依次排列的率的大小依次排列的图像。像。spectrum4.spectroscopic analysis：利用利用物物质的光的光谱进行定性、定量和行定性、定量和结构构分析的方法。分析的方法。(是以光与物是以光与物质的的相互作用相互作用为基基础建立起来的建立起来的仪器分析方法。器分析方法。)基本概念基本概念 250 500 5.基本概念基本概念 UV-Vis：利用某些物利用某些物质质分子分子对对200200800nm800nm 光光谱谱区域内区域内辐辐射能的射能的吸收吸收来研究物来研究物 质质的的性性

3、质质、结结构构和和含量含量的方法。的方法。UV-VisUV-Vis主要反映共主要反映共轭轭体系和芳香族化合物的体系和芳香族化合物的结结构特征。构特征。6.3.1 紫外紫外-可可见吸收光吸收光谱(基本原理基本原理)500 250邻甲苯胺紫外甲苯胺紫外-可可见吸收光吸收光谱图7.3.1 紫外紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱光的基本性光的基本性质质；物物质对质对光的光的选择选择性吸收；性吸收；分子吸收光分子吸收光谱谱的形成；有机化合物的的形成；有机化合物的紫外紫外-可可见见光光谱谱；无机化合物的紫外；无机化合物的紫外-可可见见光光谱谱；紫外紫外-可可见见光光谱谱中的常用中的常用术语术语；影响紫外影响紫

4、外-可可见见吸收光吸收光谱谱的因素的因素8.光的基本性光的基本性质质光是一种光是一种电电磁波，具有波磁波，具有波 粒二象性。粒二象性。E h c/波波长长越越长长，光量子能量越小，反之能量越大。，光量子能量越小，反之能量越大。E=hc/9.举例：例：白光白光硫酸硫酸铜溶液溶液？色的光被吸收？色的光被吸收呈呈蓝色色互互补色光：如果两种色光：如果两种颜色的光按一定比例混合后色的光按一定比例混合后 可成可成为白色光，白色光，这两种光称互两种光称互补色光。色光。（黄色）（黄色）物物质对光的光的选择性吸收性吸收10.11.物物质对质对光的光的选择选择性吸收性吸收l是物是物质质与与辐辐射能射能相互作用的一

5、种形式。相互作用的一种形式。l只有当入射光的能量（只有当入射光的能量（E）与吸光物）与吸光物质质分子从分子从基基态态跃跃迁到某一迁到某一激激发态发态所需能量所需能量（E）相等相等时时才会被吸收。才会被吸收。12.激激发态发态 E1 E=E 基基 态态 E0跃迁几率越大，物迁几率越大，物质的的摩摩尔吸光系数吸光系数越大。越大。13.3.1.1 紫外紫外-可可见见分子吸收光分子吸收光谱谱的形成的形成 UV-Vis 是分子吸收光是分子吸收光谱谱，它的，它的产产生可以生可以 看做是看做是分子分子对对紫外紫外-可可见见光光子光光子选择选择性性俘俘获获 的的过过程，程，本本质质上是分子内价上是分子内价电电

6、子子跃跃迁的迁的结结果。果。14.分子的分子的价价电子子在吸收在吸收电磁磁辐射并射并跃迁到高能迁到高能级后所后所产生的吸收光生的吸收光谱，通常被称，通常被称为电子光子光谱，由于其波由于其波长范范围是在光是在光谱的的紫外和紫外和可可见区区，所以，所以电子光子光谱又叫又叫紫外紫外/可可见光光谱。紫外可紫外可见见光光谱谱的的产产生生15.3.1.1 紫外紫外-可可见见分子吸收光分子吸收光谱谱的形成的形成 分子内部运分子内部运动价价电子运子运动 Ee核的振核的振动 Ev分子分子绕其重心的其重心的转动 Er E=Ee+Ev+Er Ee Ev Er16.带状光状光谱线光光谱17.化合物的紫外化合物的紫外-

7、可可见见光光谱谱决定于分子的决定于分子的结结构构和和分子分子轨轨道上道上电电子子的性的性质质。300400500600700/nm350525 545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance35018.化合物分子的特征吸收波化合物分子的特征吸收波长长（maxmax）决定于）决定于分子的分子的激激发态发态与与基基态态之之间间的能量差。的能量差。19.3.1.2 有机化合物的紫外有机化合物的紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱 O：n C H H H H *n 与紫外与紫外-可可见吸收光吸收光谱产生有关的生有关的电子：子：20.有机化合物分子内有机化合物分子内电电子子跃

8、跃迁迁类类型型 *n *n *分子的分子的电电子能子能级级跃迁迁*n E21.3.1.2 有机化合物的紫外有机化合物的紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱（1）*跃跃迁：迁：发发生在生在远远紫外区，紫外区，实际应实际应用价用价值值不大。不大。例：甲例：甲烷烷max125nm.（2）n n *跃跃迁：含有未共享迁：含有未共享电电子子对对的取代基的取代基 都可能都可能发发生生这这一一跃跃迁，所需能量取决于迁，所需能量取决于n 电电子所子所属原子的性属原子的性质质。例：碘甲例：碘甲烷烷max259nm.1.饱和有机化合物和有机化合物22.3.1.2 有机化合物的紫外有机化合物的紫外-可可见见吸收光吸收光谱

9、谱 *跃跃迁可迁可发发生在任何具有生在任何具有不不饱饱和和键键的的 有机化合物分子中。有机化合物分子中。特征是特征是较较大，大，为为强强吸收（吸收（K K带带，共，共轭轭作用得名作用得名）。）。n *跃跃迁迁发发生在含有生在含有杂杂原子双原子双键键的不的不饱饱 和有机化合物中，和有机化合物中，吸收吸收强强度弱（度弱（R R 带带，杂杂原子不原子不饱饱和基和基团团得名得名）。）。2.不不饱和脂肪族化合物和脂肪族化合物23.3.1.2 有机化合物的紫外有机化合物的紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱3.芳香族化合物芳香族化合物E1和和E2是由苯是由苯环中的中的 *跃迁迁产生，生，B带由苯得名，是芳香由苯

10、得名，是芳香族化合物特征吸收族化合物特征吸收带。24.3.1.3 无机化合物的紫外无机化合物的紫外-可可见见光光谱谱1.电电荷荷转转移光移光谱谱 电电荷荷转转移光移光谱谱：某些无机配合物和有机物可：某些无机配合物和有机物可产产 生此生此类类光光谱谱,实质实质是分子内氧化是分子内氧化还还原原过过程；程；其特点是摩其特点是摩尔尔吸光系数大吸光系数大(104)，用于定量分用于定量分 析可析可获获得得较较高的高的检测检测灵敏度。灵敏度。25.3.1.3 无机化合物的紫外无机化合物的紫外-可可见见光光谱谱 2.配位体配位体场场吸收光吸收光谱谱 102,位于可位于可见见光区，光区，较较少用于定量分析，少用

11、于定量分析，可用于研究配合物的可用于研究配合物的结结构及无机配合物构及无机配合物键键合理合理论论。26.27.3.1.4 紫外紫外-可可见见光光谱谱中的常用中的常用术语术语（P P2525自学）自学）吸收峰吸收峰谷谷肩峰肩峰末端吸收末端吸收吸收峰吸收峰28.是指分子中是指分子中产生吸收生吸收带的主要官能的主要官能团；吸收；吸收带的的max210nm,属于属于*、n*等等跃迁迁类型。型。生色生色团为不不饱和基和基团：C=CC=C、N=N-N=N-、C=OC=O、C=SC=S、-NO-NO2 2等；生色等；生色团吸收吸收带的位置受相的位置受相邻取代基或溶取代基或溶剂效效应的影响，吸收峰向的影响，吸

12、收峰向长波或短波移波或短波移动。生色生色团(chromophore)29.助色助色团(auxochrome)是指分子中一些是指分子中一些带有非成有非成键电子的子的杂原子原子饱和基和基团,本身在紫外本身在紫外-可可见光区不光区不产生吸收，但是生吸收，但是当它与生色当它与生色团连接后，使生色接后，使生色团的吸收的吸收带向向长波波移移动，且吸收，且吸收强度增度增强。-OH-OH、-OR-OR、-NH-NH2 2、-SH-SH、-Cl-Cl、-Br-Br、-I-I 等等30.溶溶剂剂效效应应体系体系pHpH的影响的影响 3.1.5 影响紫外影响紫外-可可见光光谱的因素的因素共共轭效效应立体化学效立体化

13、学效应分子分子结构构分析条件分析条件核心是核心是对分子分子中中电子共子共轭结构的影响构的影响UV-Vis主要反映共主要反映共轭体系和体系和芳香族化合物的芳香族化合物的结构特征构特征31.3.1.5 影响紫外影响紫外-可可见见光光谱谱的因素的因素1.共共轭轭效效应应：共：共轭轭的的电电子在整个共子在整个共轭轭体体系内流系内流动动，属于，属于共共轭轭基基链链上全部原子所上全部原子所有，所以它有，所以它们们受到的束受到的束缚缚力力较较小，只要小，只要受到能量受到能量较较低的低的辐辐射即可被激射即可被激发发。共共轭体系越体系越长，最大吸收波，最大吸收波长越向越向长波方向移波方向移动，吸收，吸收强度也增

14、度也增强。32.3.1.5 影响紫外影响紫外-可可见见光光谱谱的因素的因素2.立体化学效立体化学效应应空空间间位阻位阻跨跨环环效效应应33.3.1.5 影响紫外影响紫外-可可见见光光谱谱的因素的因素物物质以气以气态存在存在时的吸的吸收光收光谱 精精细结构；构；物物质在极性溶在极性溶剂中的吸中的吸收光收光谱 溶溶剂化。化。3.溶溶剂效效应溶溶剂对吸收峰的位置、吸收峰的位置、强度及光度及光谱形状均有影响形状均有影响34.溶溶剂剂效效应应 （1 1）溶）溶剂剂极性极性对对 *跃跃迁的影响迁的影响 *能能 量量E非非 E极极水水 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙丙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙乙酸乙酯 乙乙醚 氯仿仿

15、 二二氯甲甲烷 苯苯 四四氯化碳化碳 己己烷 石油石油醚35.溶溶剂剂效效应应 （2）溶溶剂剂极性极性对对 n *跃跃迁的影响迁的影响能能 量量*n E非非*nE极极36.（a a）苯酚的）苯酚的UVUV光光谱图 （b b）苯胺的）苯胺的UVUV光光谱图 4.体系体系 pH pH 值对吸收吸收带的影响的影响37.小小 结结：UV-Vis涉及分子外涉及分子外层电子的能子的能级跃迁；光迁；光 谱区域在区域在 200800nm；有机、无机化合物紫外有机、无机化合物紫外-可可见光区光区电子子跃迁迁 的的类型；型；影响紫外影响紫外-可可见吸收光吸收光谱的因素。的因素。UV-Vis法是分子光法是分子光谱分

16、析法，利用的是分析法，利用的是 分子分子对外来外来辐射的吸收特性；射的吸收特性；38.课课后后练习练习1.1.何何为为生色生色团团、助色、助色团团？2.2.紫外吸收光紫外吸收光谱谱法中，极性溶法中，极性溶剂为剂为什么会使什么会使 *跃跃迁的吸收峰迁的吸收峰长长移，却使移，却使 *跃跃迁的吸收峰短移？迁的吸收峰短移？3.3.课课后后题题1 1、2 2（P50 P50）39.本本节节参考参考书书 1.分析化学，人民分析化学，人民卫卫生出版社，参考生出版社，参考“紫外紫外-可可见见分光光度法的基本原理和概念分光光度法的基本原理和概念”的相关内容。的相关内容。2.仪仪器分析，复旦大学出版社，参考第二章

17、器分析，复旦大学出版社，参考第二章 “紫外紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱法法”的相关内容的相关内容。3.无机化学，高等教育出版社，参考无机化学，高等教育出版社，参考“化学化学键键与分子与分子结结构构”的内容。的内容。40.复复 习习紫外紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱的形成；的形成；有机物、无机物的紫外有机物、无机物的紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱；影响紫外影响紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱的因素的因素本次本次课内容内容3.2 Lambert-Beers Law3.3 紫外紫外-可可见分光光度分光光度计41.3.2 Lambert-Beers Law （分光光度法定量分析的基（分光光度法定量分析

18、的基础础）选定波定波长的入射光的入射光待待测溶液溶液 A？c被被测组分分的的含含量量透射光透射光T42.3.2.1 3.2.2 T,A,Lambert-Beers Law IrI0ItIa I0=Ia+It+Ir (1)43.3.2.1 3.2.2 T,A,Lambert-Beers Law I0=Ia+It+Ir （1）I0=Ia+It （2）T=It/I0 （3）A=-lgT （4）如果在多如果在多组分溶液中，各分溶液中，各组分分间不存在相互作用，不存在相互作用，测得得的吸光度具有加和性。的吸光度具有加和性。这一性一性质是分光光度法是分光光度法测定混合定混合组分分的依据。的依据。44.3.

19、2.1 3.2.2 T,A,Lambert-Beers LawLambert 定律描述了定律描述了A与与 l 的关系的关系 A=klBeer定律描述了定律描述了A与与 c 的关系的关系 A=kc 实验证明，溶液明，溶液对光的吸收程度光的吸收程度(A A)与与c、l、有关。有关。45.Lambert-Beers Law 当入射光当入射光波波长长一定一定时时，溶液，溶液对对光的光的吸收吸收程度程度只与只与溶液溶液浓浓度度和和液液层层厚度厚度有关。有关。A=k c l=-lgT=lgI0/It (5)(5)上式上式说明明T与与c,l 之之间是指数函数的关系，当是指数函数的关系，当c增加一倍增加一倍时

20、，T降至降至T2；而；而A与与c,l 之之间是是简单的的正比关系。正比关系。46.3.2.3 吸光系数吸光系数-kn摩摩尔尔吸光系数吸光系数n吸光系数吸光系数n百分吸光系数百分吸光系数K值物理意物理意义：数：数值上等于吸光物上等于吸光物质在在单位位浓度和度和单位厚度位厚度时的吸光度的吸光度值。在在给定定波波长、溶、溶剂和温度和温度等条件下，等条件下，K是物是物质特征常数，表明物特征常数，表明物质对某一特定波某一特定波长光的吸光的吸收能力。收能力。1247.摩摩尔尔吸光系数（吸光系数（）当当 l 以以 cm 表示，表示，c 以以 mol/L 表示表示时时，k 值值称称为为摩摩尔尔吸光系数，用吸光

21、系数，用表示。表示。单单位是位是 Lmol-1cm-1。A=l c48.摩摩尔尔吸光系数与灵敏度吸光系数与灵敏度是吸光物是吸光物质分子的一个分子的一个特征常数特征常数，可作可作为估估量定量分析方法灵敏度的指量定量分析方法灵敏度的指标。越大，改越大，改变浓度而引起的吸光度的改度而引起的吸光度的改变就越就越显著，著，测定的定的灵敏度也就越高。灵敏度也就越高。提高摩提高摩尔吸光系数的方法吸光系数的方法分子分子结构构测量条件量条件49.吸光系数（吸光系数（a）当当 c 以以 g/L 表示表示时时，k 值值称吸光系数，称吸光系数，单单位位是：是：Lg-1cm 1 。A=a l c A1cm1%(百分吸光

22、系数百分吸光系数)一种吸光物一种吸光物质质的百分的百分浓浓度度为为1%（g/100ml）的溶液的溶液在在 1cm 吸收池中的吸光度。吸收池中的吸光度。A=a1cm 1%l ca1cm 1%=10 a=10/M （6）50.例例 题题用紫外用紫外-可可见见分光光度法分光光度法测测定定Fe ，有下述两种，有下述两种方法。方法。A法：法：a=1.97 X 10 2 Lg-1c-1;B法法:=4.10 X 103 Lmolc-1.问问：何种方法灵敏度高？：何种方法灵敏度高？51.3.2.4 偏离偏离 Lambert-Beer Law 的因素的因素偏离偏离Lambert-Beer Law 的因素主要与的

23、因素主要与样品品（化学因素）（化学因素）和和仪器（光学因素）器（光学因素）有关。有关。A=k c l52.1.1.与与测测定定样样品溶液有关的因素品溶液有关的因素A=klc当c不不变时 A与与l之之间的的线性关性关系普遍存在系普遍存在A=klc当l不不变时c 0.01M 时,A与与c的的线性关系会性关系会发生偏差。生偏差。吸收定律是一个有限的定律吸收定律是一个有限的定律(1)浓度度53.为为什么在什么在 c 0.01M 时时,A与与c的的线线性关系性关系会会发发生偏差？生偏差？当c 0.01M 时当c 0.01M 时比比尔定律在低定律在低浓度度时正确，高正确，高浓度度时受限。受限。1.1.邻近

24、近质点彼此点彼此电荷分布荷分布2.2.各各组分之分之间的相互作用的相互作用分子分子间的相互作用可的相互作用可忽略不忽略不计54.(2)溶溶 剂剂 由于待由于待测测物与溶物与溶剂发剂发生生缔缔合、离解及溶合、离解及溶剂剂化反化反 应应，产产生的生成物与待生的生成物与待测测物具有不同的吸收光物具有不同的吸收光谱谱，出，出现现化学偏离化学偏离。(3)光散射的影响光散射的影响当当试样是胶体或有是胶体或有悬浮物浮物时，入射光通，入射光通过溶液后，溶液后，有一部分光因散射而有一部分光因散射而损失，使吸光度增大，失，使吸光度增大，对Beer Law 产生生正偏差正偏差。55.2.与与仪仪器有关的因素器有关的

25、因素Lambert-Beer Law只适用于只适用于单单色光色光。单色光：是由色光：是由单色器从色器从连续光光谱中分离出的一小中分离出的一小段波段波长范范围的的复合光复合光，不是不是绝对的的单色光色光，有可，有可能造成能造成对比比尔定律的偏移。定律的偏移。谱带宽谱带宽度（度（band width）：指具有某一波）：指具有某一波长长范范围围 的光的光谱带谱带，常用半峰，常用半峰宽宽来表示。来表示。56.谱带宽谱带宽度度对对吸收定律的影响吸收定律的影响 相同相同谱带宽度的情况下，度的情况下，选择哪一个哪一个谱带宽度度（波（波长）作）作为测定波定波长？实验证明：明：选用一束吸光度随波用一束吸光度随波

26、长变化不大化不大的复合光作的复合光作为入射光入射光进行行测定（定（吸光物吸光物质最大吸最大吸收波收波长）。由于在此范）。由于在此范围内，吸光物内，吸光物质的的吸光系吸光系数数变化不大化不大，对比比尔定律造成的偏离定律造成的偏离较小，并能小，并能保保证测定有定有较高的灵敏度。高的灵敏度。57.谱带宽谱带宽度度对对吸收定律的影响吸收定律的影响 图图示：示：AAc c谱带A谱带B谱带A谱带BA1A258.3.3 紫外紫外-可可见见分光光度分光光度计计UV-Vis spectrophotometer3.3.1 仪仪器主要部件及作用器主要部件及作用3.3.2 常用分光光度常用分光光度计类计类型及功能型及

27、功能简简介介3.3.3 分光光度分光光度计计的校正的校正59.3.3.1 主要部件及作用主要部件及作用0.575光源光源单色色器器吸收吸收池池检测器器显示示60.3.3.2 分光光度分光光度计类计类型型简简介介1.单波波长分光光度分光光度计单光束分光光度光束分光光度计双光束分光光度双光束分光光度计2.双波双波长分光光度分光光度计61.1.单单波波长长分光光度分光光度计计 单光束分光光度光束分光光度计 特点：只有一条光束特点：只有一条光束62.单单光束分光光度光束分光光度计计 不足：不足：要求光源和要求光源和检测系系统必必须要有要有较高的高的稳定性；每定性；每更更换一个一个测定波定波长，都要用空

28、白溶液重新校准。，都要用空白溶液重新校准。实验：芦丁含量：芦丁含量测定；差示法定；差示法测定定样品中高含量品中高含量镍。752752型紫外型紫外-可可见分光光度分光光度计63.单单波波长长双光束双光束分光光度分光光度计计 特点：在同一台特点：在同一台仪仪器中使用两个器中使用两个完全相同完全相同的光束。的光束。64.双光束分光光度双光束分光光度计计优优点：可自点：可自动扫动扫描描样样品溶液吸收光品溶液吸收光谱谱；消除光源消除光源强强度不度不稳稳引入的引入的误误差；差；仪仪器开机后无器开机后无须预热须预热可可直接直接测样测样；能减小放大器增益的漂移。；能减小放大器增益的漂移。岛津津 UV3101

29、UV3101 型型 吸光度吸光度测定定 光光谱扫描描 时间光光谱扫描描功功能能65.双波双波长长分光光度分光光度计计 特点特点：可将两种不同波可将两种不同波长长的的光交替通光交替通过过同一同一样样品品 溶液，得到溶液，得到这这两个波两个波长长下的吸光信号，再下的吸光信号，再通通过过适当的信号适当的信号转换转换系系统转换为统转换为它它们们之之间间的吸光度差的吸光度差 A A。A=AA=A11 A A22 66.双波双波长长分光光度分光光度计计 优优点：点：不需要参比溶液；能不需要参比溶液；能够够减少背景吸收和干减少背景吸收和干扰扰吸吸收以及光源收以及光源电压变电压变化化产产生的影响；可用于相互生

30、的影响；可用于相互有干有干扰扰的多的多组组分混合物分混合物的分析。的分析。岛津津 UV300 UV300 型型67.3.3.3 分光光度分光光度计的校正的校正波波长校正：校正：检查仪器的波器的波长刻度与刻度与实际波波长是否能是否能较好好的保持一致。用的保持一致。用镨钕玻璃或玻璃或钬玻璃玻璃68.3.3.3 分光光度分光光度计的校正的校正吸光度校正：在吸光度校正：在实际工作中，有工作中，有时需需对仪器的器的吸光度吸光度标度度进行行检查和校正。和校正。用用 K2CrO4 标准溶液准溶液吸收池校正：在吸收池吸收池校正：在吸收池A内装入内装入试样溶液，溶液，B内内装入参比溶液，装入参比溶液，测吸光度；

31、洗吸光度；洗净、调换两种溶两种溶液，再液，再测吸光度。前后两次吸光度。前后两次测得吸光度差得吸光度差值应小于小于1%。69.临临床床检验检验常用常用分子光分子光谱仪谱仪 酶酶标仪标仪、全自、全自动动生化分析生化分析仪仪、尿液分析、尿液分析仪仪、血、血红红蛋白蛋白测测定定仪仪：专专用分光光度用分光光度计计，工，工作原理均遵循朗伯作原理均遵循朗伯-比比尔尔定律，采用比色法定律，采用比色法进进行分析，行分析，仪仪器的核心都有一个器的核心都有一个“分光光度分光光度计计”。知知识拓展拓展70.酶酶标仪标仪是一台是一台变相的相的专用分光光度用分光光度计；是；是酶联免疫吸附免疫吸附实验专用用仪器；利用比色法

32、来分析抗原或抗体的器；利用比色法来分析抗原或抗体的含量。含量。如：血清中乙肝病毒表面抗原、抗体的如：血清中乙肝病毒表面抗原、抗体的检测。71.全自全自动动生化分析生化分析仪仪 主要采用比色法主要采用比色法进行分析，工作波行分析，工作波长在在 340800nm之之间；通通过对人体血液中脂人体血液中脂类、酶类、蛋白、蛋白质、胆、胆红素等的分析来素等的分析来测定各种生化指定各种生化指标；是是临床床最常用的最常用的检验仪器之一。器之一。72.尿液分析尿液分析仪仪 是是检测尿液中某些化学成分（尿液中某些化学成分（尿蛋白、葡萄尿蛋白、葡萄糖、胆糖、胆红素等素等）含量的）含量的专用自用自动化化仪器；是反射器

33、；是反射光比色光比色计，采用球面，采用球面积分分仪接受双波接受双波长反射光，反射光，检测试纸带颜色色变化化进行定量分析。行定量分析。73.血血红红蛋白蛋白测测定定仪仪 用光用光电器件器件测透射光透射光强度，并与已定度，并与已定标的血色的血色素素值相比相比较，即可得出血，即可得出血红蛋白含量；本蛋白含量；本质是一台是一台专用比色用比色计。74.小小 结结Lambert-Beers Law 的数学表达式，吸光系数，的数学表达式，吸光系数，偏离定律的因素；偏离定律的因素；紫外紫外-可可见见分光光度分光光度计计各各类类型型仪仪器特点。器特点。习题：课后后3、5、9、15（P50）75.本本节课节课参考

34、参考书书1.仪仪器分析复旦大学出版社器分析复旦大学出版社2.最新最新仪仪器分析技器分析技术术全全书书化学工化学工业业出版社出版社3.分析化学人民分析化学人民卫卫生出版社生出版社4.全国全国临临床床检验检验操作操作规规程程东东南大学出版社南大学出版社76.复复 习习Lambert-Beers Law，吸光系数，偏离定律的因，吸光系数，偏离定律的因素；素；紫外紫外-可可见见分光光度分光光度计计的主要部件，主要的主要部件，主要类类型。型。本次本次课内容内容3.4 分析条件的分析条件的选择 3.5 紫外紫外-可可见吸收光吸收光谱的的应用用77.3.4 分析条件的分析条件的选择选择 3.4.1 仪仪器器

35、测测量条件的量条件的选择选择 3.4.2 反反应应条件的条件的选择选择 3.4.3 参比溶液的参比溶液的选择选择 3.4.4 干干扰扰及消除方法及消除方法78.3.4 分析条件的分析条件的选择选择提高方法的提高方法的灵敏度、准确度灵敏度、准确度仪器器测量条件量条件 试样反反应条件条件参比溶液参比溶液干干扰及消除及消除79.3.4.1 仪仪器器测测量条件量条件 入射光波入射光波长长的的选择选择杂杂散光的影响散光的影响透光率透光率读读数的影响数的影响（选择选择合适的吸光度范合适的吸光度范围围）80.入射光波入射光波长长的的选择选择应应用用“最大吸收原最大吸收原则则”，在此波，在此波长长（max）下

36、）下测测定，吸光系数大，灵敏度高。定，吸光系数大，灵敏度高。当最大吸收峰峰形比当最大吸收峰峰形比较较尖尖锐时锐时，可，可选选吸收稍低、吸收稍低、峰形稍平坦的次峰形稍平坦的次强强峰或肩峰峰或肩峰进进行行测测定。定。当有干当有干扰扰物存在物存在时时，可根据，可根据“吸收尽可能大，干吸收尽可能大，干扰扰尽可能小的原尽可能小的原则则”选择选择入射光波入射光波长长。81.杂杂散光的影响散光的影响 设杂设杂散光散光强强度度为为 Is,测测得吸光度得吸光度为为：A测=lgI0+IsIt+IsIt I0 ，I0+Is It+Is I0/It即即A测 A ，令令 Is/I0=S,有：有：Is=S I0杂散光：指

37、散光：指仪器内部通器内部通过非非预定途径照射定途径照射 到到检测器上的器上的额外的光外的光辐射。射。82.杂杂散光的影响散光的影响A测=lgI0+S I0It I0/I0+S I0=lg1+ST+S例：当 S=1.0%,T=10%，求，求A测？当 S=0,T=10%，求，求A？当当S小于小于0.01%，可忽略，可忽略杂散光的影响。散光的影响。83.n任何分光光度任何分光光度计计都有一定的都有一定的测测量量误误差差。（这这一一误误差来源于光源、差来源于光源、检测检测器、器、显显示系示系统统）n这这一一测测量量误误差的差的总总和和最最终终表表现现在透光率在透光率读读数数T T 上，上，设为设为T

38、T。透光率透光率读数的影响数的影响84.对对同一台同一台仪仪器来器来说说 ，T T 是一常数。但由是一常数。但由于于 A=-lgT ，所以在不同的透光率，所以在不同的透光率读读数范数范围围内，同内，同样样大小的大小的 T T 所引起的吸光度所引起的吸光度误误差差 A A 是不同的。是不同的。透光率透光率读数的影响数的影响85.根据朗伯根据朗伯-比比尔尔定律：定律：A 与与 c c 成正比关系成正比关系 因此，因此，A 与与 c 也成正比关系。也成正比关系。A=K c （T、A 、c 均均为绝对误为绝对误差差 ）测测量量结结果的果的误误差通常用相差通常用相对误对误差来表示：差来表示：c/c 透光

39、率透光率读数的影响数的影响86.c/c 与与 A、T 的关系的关系 A=-lgTA=-lgT=l c c （1 1）(-0.434/T)dT=(-0.434/T)dT=l dc dc （2 2）将（将（2 2）式代入朗伯）式代入朗伯-比比尔尔定律，整理后得：定律，整理后得：0.434 0.434 （3 3）TlgT TlgT c/c c/c=T T 87.c/cc/c与与 T T 的关系的关系 c/cc/c 36.8%T c/c=c/c=0.4340.434 TlgTTlgT T T 0.434 Amin88.结结 论论1.c/c 取决于透光率取决于透光率T和透光率和透光率测量量误差差T的大的

40、大小小;当当 T=36.8%时(或或A=0.434)，c/c最小。最小。2.当当 T 读数在数在 70%10%,即即 A 读数数0.15 1.0 范范围时,c/c 较小小(5%)，并且，并且变化不大。化不大。89.3.4.2 反反应应条件的条件的选择选择 显显色反色反应应：使待：使待测测物与物与显显色色剂剂作用，生成有作用，生成有颜颜色的化合物，色的化合物，颜颜色深浅与待色深浅与待测测物物浓浓度相关度相关，在在一定范一定范围围内呈直内呈直线线关系。关系。目的目的：使被：使被测组分在所分在所选择反反应条件下能有条件下能有效地效地转变为适于吸光度适于吸光度测定的化合物形定的化合物形态。90.显显色

41、反色反应应需需满满足以下要求足以下要求n反反应应有有较较高的高的选择选择性，生成物在紫外性，生成物在紫外-可可见见光区有光区有较较强强吸光能力。吸光能力。n生成物生成物组组成恒定、成恒定、稳稳定性好，定性好，与被与被测测物之物之间间必必须须有确定的定量关系有确定的定量关系，显显色条件易于控制。色条件易于控制。n对对照性要好，照性要好，显显色色剂剂与生成物的最大吸收波与生成物的最大吸收波长长差差别别要在要在 60 nm 60 nm 以上。以上。91.反反应应条件的条件的选择选择（影响影响显显色反色反应应的因素的因素）显显色反色反应应：M +nR MRn 1.显色色剂用量用量：作吸光度随：作吸光度

42、随显色色剂浓度度变化化曲曲线，选恒定吸光度恒定吸光度值时的的显色色剂用量。用量。2.同同时还需考需考虑显色反色反应的灵敏度、的灵敏度、稳定性定性和反和反应的的选择性。性。92.反反应应条件的条件的选择选择（影响（影响显显色反色反应应的因素）的因素）2.溶液酸度的影响溶液酸度的影响：介：介质质酸度直接影响酸度直接影响显显色色剂剂离解程度，从而影响离解程度，从而影响显显色反色反应应的完全程的完全程度。度。固定溶液中待固定溶液中待测组测组分与分与显显色色剂剂的的浓浓度，度，改改变变溶液酸度（溶液酸度（pHpH值值），），测测定溶液定溶液A A与与 pH pH 的关系曲的关系曲线线，找出最适，找出最适

43、 pH pH 范范围围。93.反反应应条件的条件的选择选择（影响（影响显显色反色反应应的因素）的因素）3.3.其他其他问题问题反反应应的的时间时间、温度、放置的、温度、放置的时间时间等。等。此外，加此外，加显色色剂和和试剂的的顺序与序与实验成成败有重要关系！有重要关系！94.反反应应条件的控制条件的控制须须通通过实验过实验确定确定显显色反色反应应最适宜条件。最适宜条件。对对于已建立的比色方法，不于已建立的比色方法，不应应随意更改条件。随意更改条件。需要改需要改变变条件，或新建方法中要考察某一条件条件，或新建方法中要考察某一条件对对显显色的影响色的影响时时，可通，可通过实验过实验描描绘绘吸光度吸

44、光度-条件曲条件曲线线，或不同条件下的吸光度，或不同条件下的吸光度-浓浓度曲度曲线线，从中，从中选选定适宜条件。定适宜条件。95.3.4.3 参比溶液的参比溶液的选择选择溶溶剂剂参比：待参比：待测试样组测试样组成成简单简单，共存，共存组组分少且分少且对测对测 定波定波长长几乎无吸收，可用溶几乎无吸收，可用溶剂剂做参比。做参比。试剂试剂参比参比：在不加：在不加样样品的条件下，加入所需品的条件下，加入所需试剂试剂 和溶和溶剂剂。试样试样参比：除不含参比：除不含显显色色剂剂以外，其余成分都含有。以外，其余成分都含有。平行操作参比：不含待平行操作参比：不含待测组测组分。分。96.3.4.4 干干扰扰及

45、消除方法及消除方法 干干扰扰物的影响：物的影响：n干干扰扰物本身有物本身有颜颜色或与色或与显显色色剂剂形成有色化形成有色化合物；合物；n在在显显色条件下，干色条件下，干扰扰物水解，析出沉淀使物水解，析出沉淀使溶液溶液浑浊浑浊；n与待与待测测离子或离子或显显色色剂剂形成更形成更稳稳定的配合物，定的配合物，使使显显色反色反应应不能不能进进行。行。97.3.4.4 干干扰扰及消除方法及消除方法 消除方法：消除方法：控制酸度，提高反控制酸度，提高反应应的的选择选择性；性；选择选择适当的掩蔽适当的掩蔽剂剂，但不能与待，但不能与待测测离离子作用；子作用；与待与待测测物生成惰性配合物；物生成惰性配合物；选择

46、选择适当的适当的测测量波量波长长；分离。分离。98.3.5 紫外紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱的的应应用用 紫外紫外-可可见吸收光吸收光谱适用于不适用于不饱和有机和有机化合物，尤其是共化合物，尤其是共轭体系的体系的鉴定，以此推定，以此推断未知物的骨架断未知物的骨架结构。构。利用紫外利用紫外-可可见吸收光吸收光谱进行化合物的定性行化合物的定性鉴别，一般采用，一般采用比比较吸收光吸收光谱特征的方法。特征的方法。3.5.1 定性定性分析（分析（鉴别）99.3.5 紫外紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱的的应应用用3.5.1.定性分析定性分析1.对比吸收光比吸收光谱特征数据：特征数据：max,max,或或

47、A1cm1%100.3.5.1.定性分析定性分析2.对对比吸光度的比比吸光度的比值值 有多个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰有多个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处处测测得吸光度的比得吸光度的比值值作作为鉴别为鉴别依据。依据。例：中国例：中国药典典规定，定，VitB12 在在361nm与与278nm吸吸光度的比光度的比值应为1.701.88，361nm与与550 nm吸吸光度的比光度的比值应为3.15 3.45.101.3.5.1.定性分析定性分析3.对对比吸收光比吸收光谱谱的一致性的一致性 将将试样试样与已知与已知标标准品配成相同准品配成相同浓浓度的溶液，度的溶液，在同一条件下分在同一条件下

48、分别别描描绘绘吸收光吸收光谱谱，核，核对对其一其一致性。致性。例：醋酸可的松、醋酸例：醋酸可的松、醋酸氢化可的松与醋酸化可的松与醋酸泼尼尼松三者有几乎完全相同的松三者有几乎完全相同的max,（240nm）、）、（1.57104）和）和A1cm 1%（390），但它），但它们的光的光谱曲曲线有差有差别，据此可得到，据此可得到鉴别。102.3.5 紫外紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱的的应应用用4.4.纯度度检查 杂质检查杂质的限量的限量检测103.3.5 紫外紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱的的应应用用3.5.2 结结构分析构分析用于判用于判别顺别顺反异构反异构体和互体和互变变异构体（可异构体（可以

49、确定一些化合物的以确定一些化合物的构型和构象）。构型和构象）。104.3.5.3 定量分析定量分析1.单组分定量方法分定量方法 单组分：分：样品溶液中含一种品溶液中含一种组分，或者在混合物溶液分，或者在混合物溶液中待中待测组分的吸收峰与其他共存物分的吸收峰与其他共存物质的吸收的吸收峰无重叠。峰无重叠。紫外紫外-可可见吸收光吸收光谱常用于具有共常用于具有共轭体系的化体系的化合物的定量分析，灵敏度高，合物的定量分析，灵敏度高，检出限低。出限低。105.(1)标标准曲准曲线线法法 (calibration curve method)标标准曲准曲线线：配制一系列不同：配制一系列不同浓浓度的度的标标准溶

50、准溶 液，以不含被液，以不含被测组测组分空白溶液分空白溶液 为为参比，分参比，分别测别测定其吸光度。定其吸光度。以吸光度以吸光度为纵为纵坐坐标标，浓浓度度为为横横 坐坐标标作作图图。A AxAx CxCxC吸光度吸光度-浓度曲度曲线106.(2)标标准准对对比法比法 A=klc A/c=kl AS/cS=AX/cX即即:cX=AX.csAS1.单组分定量方法分定量方法同种物同种物质、同台、同台仪器、器、同一波同一波长，所以，所以标准和准和样品的品的k和和l 相等。相等。方法方法简便，但便，但误差差较标准曲准曲线法大。法大。107.2.示差分光光度法示差分光光度法(高吸光度示差法高吸光度示差法)