临床免疫学检验-ppt课件-第16章-细胞因子与细胞粘附因子的测定.ppt

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1、第第十六章十六章 细胞因子与黏附分子的检测细胞因子与黏附分子的检测目 录一、概述一、概述二、临床常用测定方法二、临床常用测定方法三、三、细胞因子与细胞黏附分子测定的临床应用细胞因子与细胞黏附分子测定的临床应用第一节 概 述一、细胞因子（cytokine）细胞因子的定义：细胞因子的定义：活化的免疫细胞及某些基质细胞所分泌的;小分子糖蛋白（830 kD）;大多单体、少数双聚体或三聚体结合细胞表面相应受体发挥生物学效应；介导和调节免疫应答及炎症反应。介导和调节免疫应答及炎症反应。细胞因子的分类：细胞因子的分类：淋巴因子（lymphokine）：淋巴细胞产生的因子；单核因子（monokine）：单核细

2、胞产生的因子；集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)：刺激骨髓干细胞成熟的因子，如GM-CSF、M-CSF、EPO等；白介素（interleukin，IL）：白细胞间相互作用的因子，如IL-1IL-38；肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)，如TNF-、TNF-；干扰素(interferon,IFN)，如IFN-、IFN-和IFN-。一、细胞因子（cytokine）（一）细胞因子的共同特性与作用方式自分泌（自分泌（autocrine)：旁分泌（旁分泌（paracrine)：内分泌（内分泌（endocrine)：作用于分泌自身的细

3、胞，是肿瘤细胞自律作用于分泌自身的细胞，是肿瘤细胞自律生长的重要机制。如白血病细胞产生的生长的重要机制。如白血病细胞产生的IL-6IL-6。作用于临近的细胞，细胞因子血清浓度低，作用于临近的细胞，细胞因子血清浓度低，常规方法难检测。如常规方法难检测。如DCDC细胞产生细胞产生IL-12IL-12，作用于作用于T T细胞。细胞。即激素作用方式，通过血液循环系统，作即激素作用方式，通过血液循环系统，作用远处的靶器官，引起全身效应。有较高用远处的靶器官，引起全身效应。有较高的血清浓度，如的血清浓度，如TNFTNF自分泌自分泌 autocrine内分泌内分泌 endocrine血液循环血液循环远距离作

4、用远距离作用旁分泌旁分泌 paracrine作用于比邻作用于比邻细胞细胞作用于分泌细胞作用于分泌细胞自身自身细细胞胞因因子子分分泌泌的的方方式式（二）细胞因子的作用特点多效性（多效性（pleiotropism）一种细胞因子可由不同的细胞在不同的条件下产生；一种细胞因子可作用多种靶细胞；肥大细胞肥大细胞胸腺细胞胸腺细胞BIL-4活化、活化、增殖、增殖、分化分化增殖增殖增殖增殖重叠性（重叠性（redundancy）几种不同的细胞因子作用于同一靶细胞，产生相同或相似的生物学效应；IL-2、IL-4、IL-5均有刺激均有刺激B细胞细胞增殖的功能增殖的功能B协同性（协同性（synergy）一种细胞因子可

5、增强另一种细胞因子的功能；一种细胞因子可增强另一种细胞因子的功能；IL-4+IL-5提高诱导提高诱导IgE类别转换类别转换B拮抗性（拮抗性（antagonism）一种细胞因子可抑制另一种细胞因子的功能；IL-4IFN-阻断阻断IL-4诱诱导导IgE类别转换类别转换BIFN-g g网络性网络性细胞因子以网络的形式发挥作用细胞因子以网络的形式发挥作用Th2Th1IL-4Th0IL-4IFN-IL-4IL-4、IL-5IL-5、IL-6、IL-10BIFN-杀伤细胞内感染杀伤细胞内感染的病原菌的病原菌抗体抗体IL-2、IFN-、TNF-.巨噬细胞巨噬细胞CTL杀伤感染或突变杀伤感染或突变细胞细胞IL

6、-3、GM-CSF造血细胞造血细胞白细胞白细胞IL-12DC（三）细胞因子受体的共同特征与作用方式细胞因子受体细胞因子受体：通常存在细胞表面，跨膜蛋白，细胞因子名称后面加R表示，如IL-1R（IL-1受体）。细胞因子受体结构细胞因子受体结构胞外区：含重复结构，识别结合细胞因子的部位；跨膜区胞内区：启动胞内信号转导；细胞因子受体的类型细胞因子受体的类型免疫球蛋白受体家族（IgR-F)；细胞因子受体家族（CkR-F)，造血因子受体家族干扰素受体家族（IFNR-F)肿瘤坏死因子家族（TNFR-F)七次跨膜受体家族（STSR-F)蛋白酪氨酸激酶受体家族（PTKR-F)（三）细胞因子受体的共同特征与作用

7、方式七次跨膜受体家族七次跨膜受体家族干扰素受体家族干扰素受体家族免疫球蛋白受体家族免疫球蛋白受体家族IL-1IL-18TNF-、TNF-、CD40等等细胞因子对细胞因子对Th细胞亚群的调节作用细胞亚群的调节作用（四）（四）T细细胞相关胞相关细细胞因子功能胞因子功能胞内病原体胞内病原体普通细菌等普通细菌等（四）（四）T细细胞相关胞相关细细胞因子功能胞因子功能1.介导细胞免疫细胞免疫的Th1细胞因子2.介导体液免疫体液免疫的Th2型细胞因子3.介导免疫调节免疫调节和免疫抑制效应免疫抑制效应的Th3型细胞因子4.介导炎症反应炎症反应的Th17型细胞因子1.介导细胞免疫的介导细胞免疫的Th1细胞因子细

8、胞因子主要分泌主要分泌IFN-、TNF-和和IL-2IFN-：由激活的CD4+T、CD8+T及NK细胞产生。且受IL-12和18的调控，抗感染作用。IL-12：诱导Th0分化为Th1，是连接早期天然免疫和获得性免疫的桥梁。IL-18：多向调节性，抗肿瘤强、促进炎症因子IL-2：是引起T细胞增殖的主要因子。IL-4和IL-5；参与B细胞活化、增殖和成熟，参与体液免疫应答。其他细胞因子或受体：IL-4R、IL-10、IL-13、IL-13RA1、IL-13RA3、IL-1R1、IL-1R2等。2.介导体液免疫的介导体液免疫的Th2型细胞因子型细胞因子TGF-多功能细胞因子；在免疫调节、造血、肿瘤免

9、疫、炎症反应起作用。IL-10家族由IL-10、19、20、22、24及26组成，功能各异。IL-10是公认的免疫抑制的细胞因子，抑制Th1细胞的应答、巨噬细胞的抗原提呈功能及NK细胞的活性。抗炎症作用，可应用临床（治疗T细胞功能紊乱的免疫疾病）3.介导免疫调节和抑制效应的介导免疫调节和抑制效应的Th3细胞因子细胞因子IL-17由Th17细胞、单核细胞分泌的促炎性因子；在抗肿瘤、炎性疾病如肺部疾病、哮喘、类风湿关节炎、器官移植等发挥作用。TNF固有免疫主要细胞因子；特异性免疫应答和炎症反应间的重要连接纽带；刺激白细胞黏附，刺激趋化因子的产生，杀死病原体，参与组织修复、血管形成等4.介导炎症反应

10、的介导炎症反应的Th17细胞因子细胞因子二、细胞黏附分子（cell-adhesion molecules）由细胞产生，介导细胞间及细胞与细胞外基质间相互接触和结合的分子；位于细胞表面或可溶形式；以配体-受体相结合的形式发挥作用；介导黏附；参与细胞识别、信号转导与活化、细胞伸展和移动、增殖与分化。（一）细胞表面黏附分子特性本质：跨膜糖蛋白，组成：胞外区：识别配体跨膜区胞内区：细胞骨架成分直接或间接的相连，以激活信号转导途径。种类：整合素、选择素超家族、Ig超家族、可溶性黏附分子和钙黏素家族等（二）黏附分子的主要生物学功能参与细胞的信号转导与活化、细胞的伸展和移动、细胞的生长及分化；促进淋巴细胞的

11、活化、增殖、分化或免疫杀伤作用；参与炎症过程中白细胞与血管内皮细胞黏附和渗出。（三）黏附分子与炎性疾病1.黏附分子与动脉粥样硬化ICAM与P-选择素显著增高，可募集单核细胞、巨噬细胞的聚集和侵入，在已有损伤条件下，加重损伤，VCAM在动脉损伤的后期阶段起重要作用。2.黏附分子与肾脏疾病ICAM是肾脏炎症的主要标志之一；在急性肾衰中，肾小球内皮细胞，ICAM-1表达明显增加；慢性梗阻性肾病患者，ICAM-1持续表达可促进炎症细胞的激活或持续浸润，导致肾小管细胞的损伤。单核巨噬细胞在动脉粥样硬化中的作用Peter Libby ,Nature,20023.黏附分子与肝脏疾病在肝纤维化，整联素表达上调

12、，促进细胞外基质在肝脏组织的沉积，启动肝纤维化。慢性病毒肝炎血清中E-选择素、ICAM-1、VCAM-1、IL-1等水平增高。酒精肝硬化ICAM-1明显增加，肝移植，P-选择素浓度明显增高,是血栓标志物。4.黏附分子与自身免疫性疾病SLE:皮肤损伤部位、及其他部位的E-选择素、VCAM-1和ICAM-1表达明显高于正常人。类风湿关节炎滑膜组织中发现E-选择素的高表达。（三）黏附分子与炎性疾病第二节 临床常用的测定方法常用测定方法基因水平基因水平蛋白水平蛋白水平mRNAmRNA表达水平表达水平RT-PCRRT-PCR技术定技术定性或定量测定性或定量测定研究领域研究领域生物学检测法生物学检测法靶细

13、胞杀伤、细胞增殖、细胞病变抑制法等 免疫学测定免疫学测定免疫学测定免疫学测定蛋白含量测定蛋白含量测定一、生物学检测方法原理原理：根据细胞因子特定的生物学效应设计的，应用相应的指示系统与已知活性细胞因子标准品或待测细胞因子相互作用，观察指示系统的变化来测定细胞因子的活性，结果以活性单位表示。常用指示系统常用指示系统细胞增殖或增殖抑制法靶细胞杀伤法细胞病变抑制法IL-2、IL-6刺激或抑制某些细胞的增殖刺激或抑制某些细胞的增殖TNF、IFN对某些肿瘤细胞有溶细胞或抑制细胞生长的活性对某些肿瘤细胞有溶细胞或抑制细胞生长的活性IFN抗病毒活性抗病毒活性二、免疫学测定法ELISA化学化学发发光光酶酶免疫

14、免疫实验实验流式流式细细胞胞术术ELISPOT(一)ELISA方法用于细胞因子、可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的定性或定量测定。基本方法有：双抗体夹心法、间接法和抗原竞争法。双抗体夹心法是细胞因子测定的最常用方法。特点：优点：批量检测，成本低廉，易推广，操作简单；缺点：灵敏度低，不能区分生物学活性。1.1.检测标本：检测标本：（1）血清、关）血清、关节节液、胸腔液、液、胸腔液、脑脑脊液或腹腔液等体液：脊液或腹腔液等体液：用于细胞因子、可溶性黏附分子、可溶性细胞因子受体等的检测正常情况下，血清中多数细胞因子含量均低，可选用敏感性高的流式细胞术；在病理状态下，细胞因子或可溶性黏附分子表达增加，

15、首选ELISA法。(一)ELISA方法只用于细胞因子和可溶性细胞因子受体的检测。检测时注意检测条件：选择适当刺激剂：不同刺激剂对细胞因子促分泌效应不同；适时检测：细胞生长状态和细胞因子分泌动态变化；选择适当的检测时点：最大分泌峰时间各异；（2）细胞体外培养后上清液）细胞体外培养后上清液(一)ELISA方法标本严重溶血：血红蛋白的血红素基团的过氧化物酶活性干扰微生物污染：可刺激IL-1、IL-6等细胞因子的分泌，影响结果准确性离体后标本中细胞继续分泌细胞因子，或与细胞上的受体结合或降解2.干扰因素干扰因素(一)ELISA方法用于体液中细胞因子或可溶型细胞因子受体的定量测定；方法：双抗体夹心法，A

16、LP或HRP特点：灵敏度高，线性范围宽、试剂稳定，可自动化检测。(二二)化学发光酶免疫试验化学发光酶免疫试验流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪高分辨力所建立的方法；主要用于细胞内细胞因子细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子细胞表面粘附分子的检测；可进行单个细胞水平单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测；精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况；可实现半定量分析。(三三)流式细胞术流式细胞术1分离和培养待检细胞分离和培养待检细胞 2细胞破膜与固定细胞破膜与固定 3封闭非特异性结合位点封闭非特异性结合位点 4染色与分析染色与分析 基本步骤基本步骤(三三)流式细

17、胞术流式细胞术1.分离和培养细胞（分离和培养细胞（PMBC或体外培养的细胞）或体外培养的细胞）需进行细胞刺激，刺激物（活化剂）的选择视待测细胞及细胞因子而定，如：T细胞活化剂（PHA，PMA和CD3单抗等)；B细胞活化剂(LPS，葡萄球菌肠毒素等）；单核细胞活化剂（LPS等）；需蛋白转运抑制剂如莫能菌素，阻止细胞因子分泌，利于胞内细胞因子检测目的：目的：便于荧光抗体进入胞内与细胞因子结合；常用破膜剂：常用破膜剂：Triton 100，皂素；细胞固定：细胞固定：甲醛或乙醇使蛋白变性，防止其流失，且使其固定。常用的细胞固定剂4%多聚甲醛。2.细胞破膜与固定细胞破膜与固定目的：目的：阻断特异性抗体与

18、非特异性位点的结合，提高方法特异性；方法：方法：采用封闭剂如含5%脱脂奶粉、正常血清或不含细胞因子特异抗体的同种免疫球蛋白处理。3.封闭非特异性结合位点封闭非特异性结合位点荧光抗体染色，流式细胞仪分析荧光阳性细胞百分率荧光阳性细胞百分率和荧光强度荧光强度。同时检测同一细胞内2种及以上细胞因子的表达。如同时检测如同时检测ThTh细胞细胞IFN-和和IL-4的表达的表达区分区分 Th1细胞细胞 Th2细胞细胞 细胞表面的黏附分子或细胞因子受体：无需作细胞破膜和固定。无需作细胞破膜和固定。待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态。待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态。4.染色与分析染

19、色与分析标本处理：标本处理：新鲜分离或培养的细胞，状态良好。避免使用EDTA抗凝，络合钙，限制钙依赖性激活途径，推荐用肝素钠标本8h内分析5.注意事项注意事项对照选择对照选择未刺激对照：包含蛋白转运剂的未刺激对照激活对照：测细胞表面的CD69的表达同型对照：消除抗体非特异性结合。采用荧光标记抗体同来源、同标记、同剂量和亚型的免疫球蛋白。荧光素选择荧光素选择低表达、同时检测单一或多种细胞因子：PE（澡红蛋白）高表达：FITC（异硫氰酸荧光素）5.注意事项注意事项(四四)ELISPOT抗细胞因子抗体包被固相载体抗细胞因子抗体包被固相载体加入待检细胞加入待检细胞刺激或不刺激刺激或不刺激培养一定时间培

20、养一定时间分泌的细胞因子分泌的细胞因子+Ab+Ab结合结合加入酶标抗体、底物显色加入酶标抗体、底物显色洗涤去除细胞洗涤去除细胞形成斑点形成斑点每个斑点代表单个分每个斑点代表单个分泌细胞因子的细胞泌细胞因子的细胞斑点深浅与含量相关斑点深浅与含量相关基基本本方方法法方法评价：方法评价：优于传统的检测方法，灵敏度高；ELISA是整体水平上的检测；ELISPOT是单细胞水平的检测；(四四)ELISPOTl测定是含量，与活性不一定成正比；测定是含量，与活性不一定成正比；l结果与抗体来源及亲和力有关；结果与抗体来源及亲和力有关；l敏感性相对较低；敏感性相对较低；l可溶性受体干扰结果可溶性受体干扰结果。l特

21、异性高；特异性高；l操作简便；操作简便；l重复性好，易标准化。重复性好，易标准化。(五五)免疫学测定方法评价免疫学测定方法评价第三节 细胞因子与细胞黏附分子测定的临床应用一、临床应用的方面特定疾病的辅助诊断；机体免疫状态的评估；临床疾病治疗效果的检测和指导用药；疾病预防的应用。（一）细胞因子在检测特定疾病诊断中的意义p感染性疾病、免疫炎症、移植排斥反应等发生时，常出感染性疾病、免疫炎症、移植排斥反应等发生时，常出现现TNFTNF、IL-1IL-1、IL-6IL-6、IFN-IFN-等表达增加；等表达增加；pTNFTNF和和IL-6IL-6：是肝脏损伤的重要炎症介质；：是肝脏损伤的重要炎症介质；

22、pTNFTNF、IL-1IL-1、IL-6IL-6、IL-8IL-8、MCP-1MCP-1等水平鉴别诊断类风湿等水平鉴别诊断类风湿关节炎和骨性关节炎。关节炎和骨性关节炎。疾病过程中，细胞因子和黏附分子表达异常，还可反映疾病进程。疾病过程中，细胞因子和黏附分子表达异常，还可反映疾病进程。（二）黏附分子检测在特定疾病诊断中的意义（二）黏附分子检测在特定疾病诊断中的意义E-钙粘素：钙粘素：肠道特异的细胞黏附分子，肠型胃腺癌异位表肠道特异的细胞黏附分子，肠型胃腺癌异位表达，腺癌分化差的区域表达减少，达，腺癌分化差的区域表达减少，免疫组化分析可作为胃免疫组化分析可作为胃腺癌及其分化程度的早期辅助诊断指标

23、腺癌及其分化程度的早期辅助诊断指标。CD44：介导细胞间、细胞与外基质间的黏附，过量表达介导细胞间、细胞与外基质间的黏附，过量表达CD44变异体与肿瘤的发生和扩散有关，可预示患者体内变异体与肿瘤的发生和扩散有关，可预示患者体内有肿瘤转移的危险性。有肿瘤转移的危险性。sICAM-1和和 sVCAM-1：判断移植排斥反应的指标，升高：判断移植排斥反应的指标，升高提示有发生排斥反应的可能。提示有发生排斥反应的可能。评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后 有助于判断机体免疫状态；有助于判断机体免疫状态；其其过过高高或或过过低低表表达达均均系系免免疫疫调调节节异异常

24、常的的结结果果，导导致致疾疾病病的发生；的发生；作为观察治疗效果和判断预后的重要指标；作为观察治疗效果和判断预后的重要指标；在疾病治疗中，发挥重要作用；在疾病治疗中，发挥重要作用；接接受受治治疗疗的的患患者者进进行行细细胞胞因因子子水水平平的的监监测测，对对保保证证治治疗疗效果具有指导意义。效果具有指导意义。二、临床应用原则（一）方法的联合应用（一）方法的联合应用 方法多样，各有利弊方法多样，各有利弊高敏感性方法：特异性的降低、废弃物难处理；活性测定方法：定性试验，不能准确定量。基因分析法：利于细胞内分析，操作繁琐。联合应用，综合分析联合应用，综合分析二、临床应用原则（二）标本的适当选取（二）

25、标本的适当选取全身炎症状态：血清或血浆细胞因子分泌功能：单个核细胞炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液细胞因子或黏附分子的细胞内定位检测：组织样本作免疫组化细胞因子的基因和mRNA表达：相应细胞，分子生物学技术疗效观察和预后判断：疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观测免疫荧光染色和流式细胞分析：注意待检细胞的活性和状态二、临床应用原则（三）细胞因子联合检测（三）细胞因子联合检测细胞因子是复杂的效应网络系统，呈级联效应或抑制作用；检测单一因子检测不能提供有效的疾病诊断和机体免疫状态信息；提倡多因子联合检测。举例：举例：T细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的功能：同时检测IL-1、IL-2、

26、IFN-和GM-CSFTh1/Th2细胞平衡状态：至少IL-2、IL-4、IL-10和IFN-1.1.细胞因子和黏附附分子是构成免疫应答的重要物质细胞因子和黏附附分子是构成免疫应答的重要物质基础，检测这些分子可反映机体的免疫状态。基础，检测这些分子可反映机体的免疫状态。2.2.细胞因子或黏附分子的检测方法包括生物学测定法细胞因子或黏附分子的检测方法包括生物学测定法和免疫测定法两大类。和免疫测定法两大类。3.3.细胞因子和黏附附分子检测对某些特定疾病具有诊细胞因子和黏附附分子检测对某些特定疾病具有诊断价值；对细胞因子治疗具有监测和指导用药的意断价值；对细胞因子治疗具有监测和指导用药的意义；对机体

27、的免疫状态具有评价作用。义；对机体的免疫状态具有评价作用。小小 结结1.1.细胞因子和细胞黏附分子的特性是什么？可分为几类？细胞因子和细胞黏附分子的特性是什么？可分为几类？2.2.细胞因子的作用方式和作用特点？细胞因子的作用方式和作用特点？3.3.常用的免疫测定方法有哪些？与细胞因子的生物活性测定法相比，常用的免疫测定方法有哪些？与细胞因子的生物活性测定法相比，免疫测定法的优势是什么？如何看待其现有的劣势？试推测解决免疫测定法的优势是什么？如何看待其现有的劣势？试推测解决现存的不足和改进方法的可能途径。现存的不足和改进方法的可能途径。4.ELISPOT4.ELISPOT的原理、用途、与的原理、用途、与ELISAELISA的异同是什么？的异同是什么？5.5.在临床疾病诊断中，检测细胞因子和黏附分子的意义是什么？临在临床疾病诊断中，检测细胞因子和黏附分子的意义是什么？临床应用的原则有哪些？床应用的原则有哪些？思考题