理化生动物细胞工程.pptx

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1、知识目标：8、促进动物细胞融合的方法？9、单克隆抗体的制备过程10、传统抗体与单克隆抗体的特点11、杂交瘤细胞的特点12、10代以内的传代细胞具有什么特点？第1页/共53页动物细胞工程的基本技术动物细胞工程的基本技术 动物细胞培养动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞核移植动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备单克隆抗体制备动物细胞动物细胞工工 程程第2页/共53页一、动物细胞培养一、动物细胞培养 1 1、概念：、概念：就是从动物机体中取出就是从动物机体中取出相应的组织，将它分散成单个细胞，相应的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细然后放在适宜的培养基中，让这些细胞胞生长和增

2、殖生长和增殖。第3页/共53页第4页/共53页 2 2、过程、过程 取材：取材：选取选取动物胚胎动物胚胎或或幼龄动物幼龄动物的组的组织、器官（分裂能力强）织、器官（分裂能力强）分散成单个细胞：分散成单个细胞：用胰蛋白酶用胰蛋白酶(PH:8-9)或胶原蛋白酶或胶原蛋白酶一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第5页/共53页2 2、过程、过程制成细胞悬液：制成细胞悬液：用培养液将分散的细胞制成细胞悬液；用培养液将分散的细胞制成细胞悬液；原代细胞培养：原代细胞培养：动物组织消化后的初次培养；动物组织消化后的初次培养；一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第6页/共53页2 2、过程、过程传代细胞培养：传代细

3、胞培养：贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶处理贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶处理后分瓶继续培养，让细胞继续增殖；后分瓶继续培养，让细胞继续增殖；1010代以内的细胞能保持正常的二倍体代以内的细胞能保持正常的二倍体核型；核型；一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第7页/共53页动物胚胎或幼龄动物的组织、器官动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶1010代细胞代细胞原代培养40-5040-50代细胞代细胞传代培养细胞株无限传代无限传代细胞系单个细胞单个细胞加培养液加培养液遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质已改变已改变第8页/共53页3 3、动物细胞培养过程的基本概念、动

4、物细胞培养过程的基本概念细胞贴壁：细胞贴壁：细胞在培养过程中，分散的细胞在培养过程中，分散的细胞贴附在瓶壁上。细胞贴附在瓶壁上。接触抑制：接触抑制：贴壁细胞分裂生长到表面相贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖；互接触时，细胞会停止分裂增殖；一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第9页/共53页 细胞在贴壁细胞在贴壁生长过程中，随生长过程中，随着细胞分裂，数着细胞分裂，数量不断增加，最量不断增加，最后形成一个单层，后形成一个单层，此时细胞间相互此时细胞间相互接触，细胞分裂接触，细胞分裂和生长停止，数和生长停止，数量不再增加。量不再增加。贴壁生长、接触抵制贴壁生长、接触抵制第10页/共

5、53页细胞贴壁过程第11页/共53页3 3、动物细胞培养过程的基本概念、动物细胞培养过程的基本概念细胞株：细胞株：细胞在传代培养中，传到细胞在传代培养中，传到1010代左右就不代左右就不容易传下去，少数细胞度过危机可继续传下容易传下去，少数细胞度过危机可继续传下去，这些存活细胞能传去，这些存活细胞能传40405050代，这种传代代，这种传代细胞叫细胞株，其遗传物质细胞叫细胞株，其遗传物质没有改变。没有改变。一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第12页/共53页3 3、动物细胞培养过程的基本概念、动物细胞培养过程的基本概念细胞系：细胞系：极少数细胞株细胞度过危机，极少数细胞株细胞度过危机，遗传物遗

6、传物质改变质改变，带有，带有癌癌细胞特点，可无限制的传细胞特点，可无限制的传下去，这部分细胞叫细胞系。下去，这部分细胞叫细胞系。一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第13页/共53页 (1)(1)为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？或组织做动物细胞培养材料？答：答：因为这些组织或器官，分裂能因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。力旺盛，易于培养。第14页/共53页 (2)(2)为什么培养前要将组织细胞分散成单为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？个细胞？答：答：成块组织中细胞与细胞靠在一起，成块组织中细胞与细胞靠在一起，限制了细胞

7、的生长和增殖，且细胞不能与培限制了细胞的生长和增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。养液充分接触，不利于培养。第15页/共53页 (3)(3)胰蛋白酶的作用是什么？由此可说明胰蛋白酶的作用是什么？由此可说明细胞间的物质是什么成份？细胞间的物质是什么成份？能够用胃蛋白酶能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？代替胰蛋白酶吗？为什么？答：答：催化蛋白质水解。细胞间的物质主催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质要是蛋白质(胶原蛋白等胶原蛋白等)。不能。因为两者的最适不能。因为两者的最适pH不同，而正不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适pH较接近。

8、较接近。第16页/共53页 4 4、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件 无菌、无毒环境无菌、无毒环境 可以培养基中加一些抗生素，以防培养可以培养基中加一些抗生素，以防培养过程的污染；过程的污染；定期更换培养液，以便清除代谢产物，定期更换培养液，以便清除代谢产物，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害；防止代谢产物积累对细胞自身造成危害；一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第17页/共53页 4 4、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件 营养条件营养条件 水、无机盐、碳源（糖）、氮源（氨水、无机盐、碳源（糖）、氮源（氨基酸）、生长因子等；基酸）、生长因子等；可加血清、血浆等天然成分。可加血清、血浆等天然

9、成分。一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第18页/共53页 4 4、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件 温度和温度和PHPH值值 36.50.536.50.5O OC 7.2C 7.27.4PH7.4PH一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第19页/共53页 4 4、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件 气体环境气体环境 95%95%氧气氧气:细胞代谢所需细胞代谢所需;5%5%二氧化碳二氧化碳:维持培养液的维持培养液的PHPH值值;一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第20页/共53页 5 5、实际应用、实际应用 大规模生产生物制品大规模生产生物制品;基因工程的受体细胞基因工程的受体细胞;培养的动物

10、细胞用于检测有毒物质培养的动物细胞用于检测有毒物质;培养正常或病变细胞，用于生理、培养正常或病变细胞，用于生理、药理、病理研究药理、病理研究;一、动物细胞培养一、动物细胞培养 第21页/共53页第22页/共53页获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养

11、植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较第23页/共53页 1 1、动物细胞核移植技术的概念、动物细胞核移植技术的概念 动物核移植是将动物的一个细胞的动物核移植是将动物的一个细胞的细细胞核胞核,移入一个已经失去细胞核的移入一个已经失去细胞核的卵母细卵母细胞胞中中,使其重组并发育成一个新的胚胎使其重组并发育成一个新的胚胎,这这个新的胚胎最终发育成为动物个体个新的胚胎最终发育成为动物个体;二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 第24页/共53页 2 2、克隆动物的概念、克隆动物的概念 用核移植方法得到的

12、动物称为克隆动用核移植方法得到的动物称为克隆动物物;二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 第25页/共53页 3 3、核移植的种类、核移植的种类 胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植:细胞分化程度低，细胞分化程度低，恢复全能性容易恢复全能性容易;体细胞核移植体细胞核移植;细胞分化程度高，细胞分化程度高，恢复全能性困难恢复全能性困难;二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 第26页/共53页4 4、体细胞核移植的过程、体细胞核移植的过程二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 第27页/共53页去核卵母细胞去核卵母

13、细胞供体体细胞供体体细胞重组细胞重组细胞重组胚胎重组胚胎克隆动物克隆动物代孕母牛代孕母牛C C卵母细胞培卵母细胞培养至减养至减中中供体细胞培养供体细胞培养高产奶牛高产奶牛A供卵奶牛供卵奶牛B物理或化学方法激合受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。注入，刺激使细胞融合胚胎移植技术第28页/共53页 (4)(4)为什么体细胞核移植技术要选为什么体细胞核移植技术要选MM期的卵母细胞作为受体细胞？期的卵母细胞作为受体细胞？答：答：因为因为M期的卵母细胞体积期的卵母细胞体积大，易操作，含有促使细胞核全能性大，易操作，含有促使细胞核全能性表达的物质和营养条件。表达的物质和营养条件。第29页/共53页5 5

14、、体细胞核移植技术的应用前景、体细胞核移植技术的应用前景在畜牧业中可以加速家畜遗传改在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程；良的进程；保护濒危物种；保护濒危物种；生产医用蛋白质及组织器官移植生产医用蛋白质及组织器官移植的供体；的供体；二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 第30页/共53页第31页/共53页6 6、体细胞核移植技术存在的问题、体细胞核移植技术存在的问题 成功率低；成功率低；克隆动物畸形率、死亡率高，易克隆动物畸形率、死亡率高，易出现早衰等问题；出现早衰等问题；食品安全性问题；食品安全性问题；二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术

15、和克隆动物 第32页/共53页三、动物细胞融合三、动物细胞融合 1 1、概念：、概念：也叫细胞杂交，指也叫细胞杂交，指两个两个或多个动物细胞结合成一个细胞的过或多个动物细胞结合成一个细胞的过程程。整合后的细胞叫杂交细胞。整合后的细胞叫杂交细胞。第33页/共53页三、动物细胞融合三、动物细胞融合 2 2、细胞融合方法：、细胞融合方法：物理方法：物理方法：离心、电刺激、振动离心、电刺激、振动化学方法：化学方法：PEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）生物方法：生物方法：灭活的病毒灭活的病毒灭活的含义灭活的含义P52资料卡资料卡第34页/共53页四、动物细胞融合第35页/共53页细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细

16、胞核细胞核 灭活的病毒与细胞膜灭活的病毒与细胞膜上的糖蛋白作用，使细胞上的糖蛋白作用，使细胞相互融合。相互融合。细胞膜上的糖蛋白细胞膜上的糖蛋白分子和脂质重新排布分子和脂质重新排布细胞膜打开细胞膜打开细胞融合，形成杂种细胞细胞融合，形成杂种细胞第36页/共53页三、动物细胞融合三、动物细胞融合 3 3、细胞融合意义：、细胞融合意义：突破了有性杂交的局限，使远缘突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；杂交成为可能；第37页/共53页植物、动物细胞融合的比较植物、动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合原原 理理细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞全能性

17、细胞全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性目目 的的获得杂种植株获得杂种植株获得细胞产品获得细胞产品诱导细胞诱导细胞融合方法融合方法物理物理化学化学物理、化学物理、化学灭活的病毒灭活的病毒杂交前处理杂交前处理 用纤维素酶或果用纤维素酶或果胶酶去壁得原生胶酶去壁得原生质体质体用胰蛋白酶使之用胰蛋白酶使之分散成单个细胞分散成单个细胞第38页/共53页四、单克隆抗体的制备四、单克隆抗体的制备生产：生产：注射抗原注射抗原从动物血清中分离从动物血清中分离 问题：问题：抗体产量低、纯度低、特异性差；抗体产量低、纯度低、特异性差；、传统抗体生产及特点、传统抗体生产及特点第39页/共53页四、单克隆抗体的制备四、

18、单克隆抗体的制备B B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体动物体内的动物体内的B B淋巴细胞可以产生百万种以淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用；免疫作用；每一个淋巴细胞只能产生一种抗体；每一个淋巴细胞只能产生一种抗体；、B B淋巴细胞与抗体的关系淋巴细胞与抗体的关系第40页/共53页第41页/共53页四、单克隆抗体的制备四、单克隆抗体的制备3 3、单克隆抗体的制备、单克隆抗体的制备思路：思路：克隆单一的浆细胞成为细胞群，克隆单一的浆细胞成为细胞群，同时解浆细胞不能无限增殖的问题同时解浆

19、细胞不能无限增殖的问题将浆细胞与骨髓瘤细胞融合；将浆细胞与骨髓瘤细胞融合；第42页/共53页第43页/共53页四、单克隆抗体的制备四、单克隆抗体的制备3 3、单克隆抗体的制备、单克隆抗体的制备过程过程第44页/共53页 小鼠注射抗原小鼠注射抗原体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导融合诱导融合3 3种两两融合细胞种两两融合细胞HAT选择培养基筛选选择培养基筛选多种杂交瘤细胞多种杂交瘤细胞专一性抗体检验专一性抗体检验能产生某一种特定抗体的杂交瘤细胞能产生某一种特定抗体的杂交瘤细胞单克隆抗体单克隆抗体单克隆杂交瘤细胞单克隆杂交瘤细胞第45页/共5

20、3页四、单克隆抗体的制备四、单克隆抗体的制备3 3、单克隆抗体的制备、单克隆抗体的制备单克隆抗体的特点：单克隆抗体的特点：特异性强、灵敏度高、可大量生产特异性强、灵敏度高、可大量生产单克隆抗体的原理：单克隆抗体的原理：免疫原理免疫原理细胞融合原理细胞融合原理动物细胞培养原理动物细胞培养原理第46页/共53页四、单克隆抗体的制备四、单克隆抗体的制备3 3、单克隆抗体的制备、单克隆抗体的制备应用应用作为诊断试剂作为诊断试剂用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物第47页/共53页四、单克隆抗体的制备四、单克隆抗体的制备3 3、单克隆抗体的制备、单克隆抗体的制备杂交瘤细胞的特点：杂交瘤细胞的特点

21、：既能无限增殖，又能产生特异性抗既能无限增殖，又能产生特异性抗体；体；第48页/共53页第49页/共53页HATHAT选择性培养基选择性培养基 在普通的动物细胞培养液中加入次在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（黄嘌呤（H H）、氨基喋呤（）、氨基喋呤（A A）和胸腺嘧）和胸腺嘧啶核苷酸（啶核苷酸（T T）。）。第50页/共53页DNA分子复制的两条途径1 1、D D途径途径：即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为为DNADNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而酸作为重要的辅酶

22、参与这一过程，而hathat培养液中培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断dnadna合成合成的的“d d途径途径”；2 2、S S途径：途径：是应急途径或补救途径（是应急途径或补救途径（“s s途径途径”），它是），它是利用次黄嘌呤利用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（hgprthgprt）和胸腺嘧啶核苷激酶（和胸腺嘧啶核苷激酶（tktk）催化次黄嘌呤和胸腺）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。第51页/共53页不同细胞的不同细胞的DNADNA合成途径合成途径1 1、

23、效应、效应b b细胞和两个效应细胞和两个效应b b细胞融合细胞细胞融合细胞：具有：具有D D和和S S途径，途径，“D D途径途径”被氨基喋呤阻断，虽被氨基喋呤阻断，虽“s s途径途径”正正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d10d左右会死亡。左右会死亡。2 2、对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞、对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞：只有：只有D D途径，途径，无无S S途径。途径。“D D途径途径”又被氨基喋呤阻断，所以在又被氨基喋呤阻断，所以在hathat培养液中也不能增殖而很快死亡。培养液中也不能增殖而很快死亡。3 3、杂交瘤细胞、杂交瘤细胞：既具有效应：既具有效应B B细胞的细胞的“s s途径途径”，又，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在因此能在hathat培养液中选择性存活下来，并不断增殖。培养液中选择性存活下来，并不断增殖。第52页/共53页感谢您的观看！第53页/共53页