仪器分析荧光分析法课件.pptx

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1、1第十二章 荧光分析法fluorometry2概概 述述某些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出比原来所吸收的光的波长更长的光，这种现象称为光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。3荧光的分类荧光的分类根据物质是分子还是原子：分子荧光分子荧光 原子荧光原子荧光 根据照射光的种类：紫外荧光紫外荧光 X X射线荧光射线荧光 红外荧光红外荧光方法测定灵敏度方法测定灵敏度 10-10 10-12g/ml 4第一节第一节 基本原理基本原理一、分子荧光一、分子荧光（一）分子荧光的产生（一）分子荧光的产生1分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程=hcES0S1*T15S0V=01

2、23S1*S2*VnT1*荧光与磷光产生示意图荧光与磷光产生示意图62.荧光和磷光产生荧光和磷光产生振动弛豫振动弛豫 vibrational relexation 内部能量转换内部能量转换 internal conversion 荧光发射荧光发射 fluorometry 外部能量转换外部能量转换 external conversion体系间跨越体系间跨越 intersystem crossing磷光的产生磷光的产生7（二）激发光谱与发射光谱（二）激发光谱与发射光谱光光源源单单色色器器1单色器单色器2检测器检测器excitation spectrum 横横坐坐标标 ex，纵纵坐坐标标 发发射光强

3、度射光强度fluorescence spectrum 横横坐坐标标 em，纵纵坐坐标标 发发射光强度射光强度8溶液荧光光谱通常具有如下特征溶液荧光光谱通常具有如下特征Stokes shift荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光光谱与激发光谱的镜像关系 9斯托克斯位移斯托克斯位移 =-10荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关不管分子激发到s1还是s2，荧光的发生总是从s1开始，荧光光谱的形状是一样的。荧荧光光强强度度 (nm)40030050011荧荧光光强强度度nm250350V=01234S0S1*12340蒽的激发光谱

4、蒽的激发光谱和和发射光谱发射光谱荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关12除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e的时间二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构（一）荧光寿命和荧光效率（一）荧光寿命和荧光效率 fluorescence lift time，f Ft=F0e-Kt 当当t=f 时，时，Ft=（1/e）F0 （1/e）F0=F0e-K f 即（即（1/e）=e-K f K f=1 K=1/fFt=F0 e-t/f13求荧光寿命Ft=F0 e-t/fln F0Ftt f=ln F0Ftt直线斜率为直线斜率为1 f14fluorescence efficienc

5、y(fluorescence quantum yield)f=发射荧光的光子数发射荧光的光子数吸收激发光的光子数吸收激发光的光子数 15（二）有机化合物分子结构与荧光的关系（二）有机化合物分子结构与荧光的关系长共轭结构长共轭结构分子的刚性分子的刚性取代基取代基161.长共轭结构长共轭结构对于芳香族化合物，共轭越长，ex和和 em都长移，荧光效率也提高。ex=205nm em=278nm ex=286nm em=321nm ex=356nm em=404nm f=0.11 f=0.36 f=0.29长共轭的脂肪烃也有荧光172.分子的刚性分子的刚性同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性和共平面性越大

6、，越大，长移。CH2 f=0.2 f=1.018刚性和共平面性增加刚性和共平面性增加 电子的共轭程度增加电子的共轭程度增加-COO-COO-COO-O荧光素钠酚酞19原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉N-OHN-OMg1/2Mg原来共平面性较好的-NCH3CH3SO3NaNCH3CH3SO3Na1-二甲氨基萘二甲氨基萘-7-磺酸盐磺酸盐1-二甲氨基萘二甲氨基萘-8-磺酸盐磺酸盐 20取代基的影响取代基的影响供电子基团-NH2、-OH、-OCH3吸电子基团-COOH、-NO2、-NHCOCH3-R、-SO3H、-NH3+使 使 影响较小21（三）荧光试剂（三）荧光试剂荧光胺荧光胺Dansyl-C

7、l邻苯二甲醛邻苯二甲醛(OPA)测定无机离子的荧光试剂测定无机离子的荧光试剂22荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺反应荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺反应COOHONROH-NH2R-NH2 ex 275,490nm em 480nm OOOO23Dansyl-Cl 与伯仲胺及酚羟基反应与伯仲胺及酚羟基反应NCH3CH3SO2ClNCH3CH3SO2NHR+RNH2无水丙酮+HCl ex 365nm em 500nm 24邻苯二甲醛邻苯二甲醛(OPA)与伯胺反应与伯胺反应-CHO-CHO+RNH2+HSCH2CH2OHN-RSCH2CH2OH+2H2OpH 910OH-ex 340nm em 455nm 2

8、5无机离子一般本身没有荧光，但与一些有无机离子一般本身没有荧光，但与一些有机试剂生成配合物后，可产生强烈荧光机试剂生成配合物后，可产生强烈荧光N-OHN-OLi+Li+ex 370nm em 580nm P235 表12-126有些无机阴离子可使荧光熄灭有些无机阴离子可使荧光熄灭N-OHN-OAl1/3+Al+CN-使荧光熄灭或减弱F-27三、影响荧光强度的外部因素三、影响荧光强度的外部因素 极性溶剂使K带吸收长移，跃迁几率增大，荧光波长长移，强度增加。溶剂粘度降低，荧光强度减弱。溶剂溶剂 温度温度 温度升高 荧光效率下降28 pH值的影响值的影响NH2NH3+NH-pH13无荧光无荧光pH7

9、12 兰色荧光兰色荧光OHHO3S-O-O3S-pH6.4 兰色荧光兰色荧光29 荧光熄灭剂的影响荧光熄灭剂的影响荧光熄灭剂荧光熄灭剂quenching medium发生碰撞而使之失去能量生成不发光的配位化合物溴、碘以及溶解氧的存在，实现体系间跨越，转变成三线态。荧光熄灭法荧光熄灭法fluordscence quenching method荧光自熄灭荧光自熄灭C 1 g/l30散射光的干扰散射光的干扰scattering light光子与物质分子碰撞弹性碰撞非弹性碰撞碰撞双方能量不变碰撞双方能量不变光子运动方向改变光子运动方向改变碰撞过程中发生能碰撞过程中发生能量传递，同时光子量传递，同时光子

10、运动方向发生改变运动方向发生改变Reyleigh scattering lightRaman scattering light31硫酸奎宁在不同硫酸奎宁在不同ex的荧光与散射光谱的荧光与散射光谱Fnm320448350448360400ex 320nmReyleigh 320nmRaman 360nmem 448nmex 350nmReyleigh 350nmRaman 400nmem 448nm对测定无影响对测定无影响对测定有影响对测定有影响32在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长33I0IF第三节 定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系F=K(I0

11、-I)I=I010-ECLF=KI0(1-10-ECL)=KI0(1-e-2.3ECL)34e-2.3ECL=1+F=KI0(1-10-ECL)=KI0(1-e-2.3ECL)(-2.3ECL)11!+(-2.3ECL)22!F=KI01-(1+(-2.3ECL)11!(-2.3ECL)22!+)(-2.3ECL)33!+=KI02.303ECl-(-2.3ECL)22!(-2.3ECL)33!-若若C很小，很小，ECl 0.05 则则F=2.3KI0ECl=KC+35F=2.3KI0ECl=KCECl0.05 F C ECl 0.05 F 与与C不成正比不成正比荧光法荧光法 紫外法紫外法FA

12、=-lgT=-lgI/I0 荧光分析法的灵敏度高于紫外荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法可见分光光度法36二、定量分析方法二、定量分析方法标准曲线法标准曲线法比例法比例法多组分分析多组分分析C1 C2 C3 C4 C5100%20608040 80%16486432用空白溶液调零用空白溶液调零用标准溶液调满刻度用标准溶液调满刻度37比例法（对比法）比例法（对比法）若在某浓度范围中成线性，可用比例法测定CsCxFsFx=CxFsFx=CsCsCxFs-F0Fx-F0=CxFs-F0Fx-F0=Cs38多组分分析多组分分析各组分荧光峰不重叠，可分别测定相互重叠，可利用荧光强度的加和性，如：

13、ba 1 2Fa=KaCa+KbCb 1:Fa=Ka Ca+KbCb 2:39第四节第四节 仪器与荧光分析新技术仪器与荧光分析新技术光光源源单色器单色器 样品池样品池检测器检测器单色器单色器 放大器放大器显示器显示器滤光片荧光计滤光片单色器荧光分光光度计40仪器的校正仪器的校正灵敏度灵敏度波长波长激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱41荧光分析新技术简介荧光分析新技术简介1.激光荧光分析 以激光作光源，谱线更纯、强度更大。可提高灵敏度和专一性。一次测量所需样品液 1g，可测至10-14 10-16g。新技术新技术仪器方面更新化学方法改善422.时间分辨荧光时间分辨荧光 time-resolve

14、d fluorometry样品样品杂质杂质脉冲激光脉冲激光10-10 s10-12 s433.同步荧光分析同步荧光分析 synchronous fluorometry若：若：=em-exF=K （ex）（em）CFexFemF=K （ex）（ex+）Cf=f CF=K （em-）（em）CK=K C44荧光黄、罗丹明荧光黄、罗丹明6G、罗丹明、罗丹明B混合物的同混合物的同步荧光光谱（步荧光光谱（=3nm）F 荧光黄荧光黄罗丹明罗丹明6G罗丹明罗丹明B454.胶束增敏荧光胶束增敏荧光CH3(CH2)11OSO3-Na+非极性疏水基团非极性疏水基团极性亲水基团极性亲水基团增加溶解度增加荧光效率增加荧光的稳定性