生产菌种的选育.pptx

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1、一、微生物代谢产物一、微生物代谢产物（一）初级代谢产物（一）初级代谢产物(Primarymetabolite)：微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物。微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物。（二）次级代谢产物（二）次级代谢产物(Secondarymetabolite)：与菌体的生长繁殖无明确关系的代谢产物，既不参与与菌体的生长繁殖无明确关系的代谢产物，既不参与细胞结构，也不是储存养料。细胞结构，也不是储存养料。抗生素抗生素(antibiotic)、生物碱、生物碱(alkaloid)、色素、色素(pigment)等等氨基酸，核苷酸，脂肪酸，维生素，蛋白质，多糖，低级有机酸，醇等突变菌株：营养缺陷型、抗

2、性变株，基因工程菌等。第一节微生物的代谢及调控第1页/共160页1、微生物合成次级代谢产物的基本特征(1)次级代谢产物具有种特异性次级代谢产物具有种特异性(2)分批发酵时，产生菌生长周期三个时期分批发酵时，产生菌生长周期三个时期(3)次级代谢产物不少是结构相似的混合物次级代谢产物不少是结构相似的混合物(4)次级代谢产物的合成受多基因控制次级代谢产物的合成受多基因控制第2页/共160页(1)次级代谢产物具有种特异性分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素如：灰色链霉菌：链霉素-氨基环醇类杀假丝菌素-六烯大环内酯类不同的微生物也能产生相同的抗生素如：头孢菌素C：顶头孢霉和克拉维链霉菌第3页/共16

3、0页(2)分批发酵时，产生菌生长周期三个时期三个时期:菌体生长期产物合成期菌体自溶期第4页/共160页(3)次级代谢产物不少是结构相似的混合物次级代谢产物不少是结构相似的混合物产黄青霉菌合成具有不同生物活性的青霉素(青霉素G、V、O、F、X)，青霉素母核-6-氨基青霉烷酸（6-APA）R=G-C6H5CH2-,X-HOC6H4CH2-,F-CH3(CH2)4-,V-C6H50CH2-第5页/共160页原因参与次级代谢产物合成酶系的底物特异性不强。产生菌利用一种或两种以上初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，产生菌继续对该产物进行多种化学修饰而同时合成多种衍生物。此种生物合成现象，有时称为“代

4、谢树”。一种次级代谢产物可由两种或两种以上的代谢途径合成的，这种方式有时称为“代谢网”。第6页/共160页原利福霉素原利福霉素I利福霉素利福霉素Y利福霉素利福霉素B利福霉素利福霉素O利福霉素利福霉素L利福霉素利福霉素W利福霉素利福霉素R利福霉素利福霉素A,C,D,E利福霉素利福霉素G利福霉素利福霉素S2丙二酸单元丙二酸单元8甲基丙二酸单元甲基丙二酸单元3-氨基氨基-5-羟基苯甲酸羟基苯甲酸利福平的生物合成（代谢树）利福平的生物合成（代谢树）第7页/共160页红霉素的生物合成(代谢网)1-红霉素A;2-红霉素B;3-红霉素C;4-红霉素D;5-红霉素E;6-红霉素F;EB-红霉内酯B;EA-红霉

5、内酯A;M-碳霉糖;C-红霉糖;D-脱氧氨基己糖OCODHOOCH3CH3CH3OCH3OOEB EAEBEBOM EAEBOCODOM EAEBODOMODOC EAOCODCH2OH EAODHO123456第8页/共160页(4)次级代谢产物的合成受多基因控制染色体基因簇结构基因；质粒调控基因，抗性基因质粒：（1）天蓝色链霉菌生物合成次甲霉素A的4个或5个结构基因在SCPl质粒上（2）螺旋霉素生物合成中，结构基因编码于复制子上，而调节基因位于质粒上。第9页/共160页初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，而在许多抗生素产生茵如天蓝色链霉菌

6、、金霉素链而在许多抗生素产生茵如天蓝色链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、龟裂链霉菌、卡那霉素链霉菌霉菌、灰色链霉菌、龟裂链霉菌、卡那霉素链霉菌等中发现，抗生素的合成同时受到核外遗传物质等中发现，抗生素的合成同时受到核外遗传物质-质质粒的控制，因此，有人将受到质粒控制的代谢产物粒的控制，因此，有人将受到质粒控制的代谢产物称为称为“质粒产物质粒产物”。第10页/共160页1、次级代谢产物构建单位的生源说和生物合成生源说指的是次级代谢产物分子中构建单位的各种原子的起源有机化学。生物合成指的是各构建单位在多种酶的作用下合成次级代谢产物的过程生物化学。中间产物：五碳、四碳、三碳、二碳化合物“分叉中间体分

7、叉中间体”：某些中间产物，即可用于合成初级代：某些中间产物，即可用于合成初级代谢产物，又可用于合成次级代谢产物。谢产物，又可用于合成次级代谢产物。（三）初级代谢与次级代谢之间的关系（三）初级代谢与次级代谢之间的关系第11页/共160页特殊前体特殊前体(一)聚酮体：聚酮体是通过连续的低级羧酸如乙酸、丙酸等在聚酮体合成酶(PKS)作用下脱羧缩合合成起始单位有乙酰辅酶A(CoA)、丙酰CoA和丁酰CoA等。（1）葡萄糖(或脂肪酸)降解-乙酰CoA（2）丙酸单位可由琥珀酰CoA转化、奇数碳脂肪酸降解、支链氨基酸降解等形成。（3）丁酸单位通常由一个乙酰CoA与一个丙酰CoA缩合形成，还可由亮氨酸经过2-

8、C-异己酸降解生成。亮氨酸亮氨酸2-C-异已酸异已酸乙酰乙酸乙酰乙酸丁酸丁酸转氨酶转氨酶第12页/共160页作为链的延长单位有丙二酰CoA、甲基丙二酰CoA、乙基丙二酰CoA等。是C2、C3和C4的供体（4）乙酰）乙酰CoA丙酰丙酰CoA缩合缩合丁酸丁酸乙基丙二酰乙基丙二酰CoA（3）丙酰）丙酰CoA+草酰乙酸草酰乙酸甲基丙二酰甲基丙二酰CoA十丙酮酸十丙酮酸羧基转移酶羧基转移酶（2）丙酰）丙酰CoA+ATP+CO2+H2O甲基丙二酰甲基丙二酰CoA+ADP+Pi丙酰丙酰CoA羧化酶羧化酶（1）乙酰）乙酰CoA+ATP+C02+H2O丙二酰丙二酰CoA+ADP+Pi乙酰乙酰CoA羧化酶羧化酶第

9、13页/共160页-聚酮体链连续而完全的还原反应获得脂肪酸；不完全的还原或还原位点的不同可获得变化范围广泛的聚酮体。经过重复脱水常得到芳香化合物(如四环类、蒽环类抗生素)经过环化作用形成大内酯环(大环内酯类抗生素)，如果形成多个双键的环状化合物，就可能导致多烯大环内酯类抗生素的合成。第14页/共160页甲羟戊酸和异戊烯焦磷酸的生物合成HHHOOOHCOSCoAMeMeCOCH2COSCoAHCH2COSCoAOHOOHHOHSCOAMeOPPHMeHHHOHOOHOHMeOOOHMeOPOOHOPOOHOMeOPPMeHHRS*-CH2COSCoAHMeCOSCoA+-+乙酰乙酰乙酰乙酰-CO

10、A硫解酶硫解酶HMGCoA合成酶合成酶HMGCoA还原酶还原酶-HRNADPHNADPH2ATPATP-CO2异构酶异构酶(二二)甲羟戊酸甲羟戊酸(3-甲基甲基-3，5-二羟基戊酸，二羟基戊酸，MVA)乙酰乙酰CoA3-羟羟-3-甲甲-戊二酰戊二酰CoA甲羟戊酸甲羟戊酸甲羟戊酸甲羟戊酸-5-焦磷酸焦磷酸异戊二烯焦磷酸异戊二烯焦磷酸异戊二烯类或异戊二烯类或萜类次级代谢产物萜类次级代谢产物赤霉素赤霉素生物碱生物碱甾醇甾醇胡萝卜素胡萝卜素第15页/共160页(三)糖类和氨基糖O-糖苷，N-糖苷、S-糖苷、C-糖苷等与次级代谢产物分子中的糖苷配体连接。葡萄糖和戊糖是这些糖类和氨基糖的前体。葡萄糖的碳架

11、经过异构化、氨基化、脱氧、碳原子重排、氧化还原或脱羧等修饰后并人次级代谢产物的分子中。葡萄糖是合成稀有戊糖的直接前体。部分稀有戊糖是在核苷合成之后直接对核糖部分进行修饰而形成的。第16页/共160页链霉糖的生物合成灰色链霉菌提取物灰色链霉菌提取物NADPH灰色链霉菌提取物灰色链霉菌提取物二氢链霉糖二氢链霉糖L-鼠李糖鼠李糖NADPH脱氧酰苷脱氧酰苷-5-二磷酸葡萄糖二磷酸葡萄糖第17页/共160页(四)不常见的氨基酸200余种非蛋白质氨基酸(称不常见氨基酸)，如D-氨基酸、N-甲基氨基酸；脱氢的和-氨基酸、稀有的二氨基酸(如二氨基丁酸)。D-氨基酸可能由L-氨基酸通过氨基酸消旋酶催化形成的。有

12、的是由正常氨基酸生物合成途径合成的，如-氨基己二酸是合成头孢菌素的一个构建单位。第18页/共160页(五)环多醇和氨基环多醇环多醇是带有一些羟基的环碳化合物。氨基环多醇是环多醇分子中的一个或多个羟基被氨基取代的衍生物。氨基环醇类抗生素(如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等)的分子中最常见的环多醇部分是由葡萄糖衍生来的，如-脱氧链霉胺、链霉胍都是葡萄糖经过磷酸化、环化等反应形成环多醇，继续经过氨基化等反应衍生来的。第19页/共160页比较源自D-葡萄糖的链霉胍，2-脱氧链霉胺和Actinamine的标记模式共同的中间体共同的中间体（X,Y=HorOH）第20页/共160页(六)非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱的

13、生物合成在次级代谢产物中出现的非核酸嘌呤碱基和嘧啶碱基是由合成核酸用的嘌岭和嘧啶经过化学修饰而形成的。(七七)芳香中间体芳香中间体（八）甲基（八）甲基S-腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)第21页/共160页次级代谢产物生物合成的基本过程次级代谢产物生物合成的基本过程（一）构建单位的聚合（一）构建单位的聚合如柱晶白霉素由如柱晶白霉素由5个乙酰单位，个乙酰单位，1个丙酸单位，个丙酸单位，1个丁酸单位，个丁酸单位，1个羟基乙酰单位经聚酮体途径缩个羟基乙酰单位经聚酮体途径缩合而成。合而成。第22页/共160页新生霉素生源说（）来自甲硫氨酸；*来自葡萄糖来自

14、酪氨酸来自甲羟戊酸来自莽草酸OHCOOOOHNH(CH3)来自谷氨酰胺OOOHOCNH2OO(H3C)CH3(H3C)*第23页/共160页（二）次级代谢产物的最终修饰（二）次级代谢产物的最终修饰四环素四环素土霉素土霉素脱氢四环素脱氢四环素C4氧化反应及氨化反应氧化反应及氨化反应C6羟化反应羟化反应C4-NH2甲基化反应甲基化反应四环素环四环素环四环素环四环素环C7氯化反应金霉素氯化反应金霉素O HO HN(CH3)2O HCONH2OOR1R3R2R4OHHH12345678910111211a12a第24页/共160页二、微生物代谢的调节及控制2、酶合成的调节（即酶量的调节）、酶合成的调节

15、（即酶量的调节）3、能荷调节、能荷调节1、酶活性的调节、酶活性的调节酶活性的激活酶活性的激活酶活性的抑制酶活性的抑制协同反馈抑制协同反馈抑制累积反馈抑制累积反馈抑制增效反馈抑制增效反馈抑制顺序反馈抑制顺序反馈抑制（一）微生物代谢的自我调节机制（一）微生物代谢的自我调节机制第25页/共160页反馈抑制模式-协同反馈抑制分支途径的几种末端产物同时过量时才抑制共同途径中的第一个酶活性ABCDEFG第26页/共160页反馈抑制模式-累积反馈抑制每一种末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中第一个酶活性ABCDEFG58%40%30%第27页/共160页反馈抑制模式-增效反馈抑制代谢途径中任何一种末端产物

16、过量时，仅部分抑制共同反应途径中的第一个酶活性，但是两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和ABCDEFG20%15%90%第28页/共160页反馈抑制模式-顺序反馈抑制每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制作用BACDEFGHIJK第29页/共160页2、酶合成的调节-诱导与阻遏（2）酶合成的阻遏）酶合成的阻遏降解酶类降解酶类由诱导作用和分解代谢产物来调节活性由诱导作用和分解代谢产物来调节活性合成酶合成酶主要由反馈抑制和反馈阻遏（指代谢的终产物达主要由反馈抑制和反馈阻遏（指代谢的终产物达到一到一定浓度时，阻遏该代谢途径中的一种酶或几种酶的生定浓度时，阻遏

17、该代谢途径中的一种酶或几种酶的生物合成）调节。物合成）调节。（1）酶合成的诱导）酶合成的诱导组成酶：组成酶：有些酶的合成不依赖于环境中物质的存在。有些酶的合成不依赖于环境中物质的存在。诱导酶：诱导酶：只有在它们催化的底物只有在它们催化的底物(或底物的结构类似物或底物的结构类似物)存在时才能合成的酶。存在时才能合成的酶。第30页/共160页3、能荷调节1.能荷指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可供利用的高能磷酸键的量度。2.能荷调节(或称腺苷酸调节)指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动。RUU-ATP利用体系的酶利用体系的酶R-ATP合成体系的酶合成体系的酶第31页/共

18、160页放线菌（链霉素放线菌（链霉素四环素；红霉素四环素；红霉素等）等）真菌（青霉素、头孢等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌一些产芽孢的细菌植物或动物来源植物或动物来源（一）抗生素生产有关的微生物（一）抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：目前发现的生物来源如下：一、常见的工业微生物第二节第二节生产菌种的选育方法生产菌种的选育方法第32页/共160页（二）氨基酸生产有关的微生物（二）氨基酸生产有关的微生物氨基酸生产菌的要求：氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较清楚，代谢

19、途径比较简单代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌草芽孢杆菌第33页/共160页（三）食品酶制剂生产有关的微生物（三）食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列毒理试验。美国开发一个新酶，都要经过一系列毒理试验。美国需要得到需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能

20、用于生产食品用酶。生物能用于生产食品用酶。a-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌FDA-FoodandDrugAdministration(美国美国)食品及药物管理局食品及药物管理局：generallyrecognizedassafe/一般认为安一般认为安全全GRAS第34页/共160页工业化菌种的要求1.生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；2.能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；3.有关合成产物的途径尽能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；4.遗传性能要相对稳定；5.

21、不易感染它种微生物或噬菌体；6.生产特性要符合工艺要求。第35页/共160页二、新菌种的分离(separation)与筛选(sereeing)1.样品采集；2.预处理；3.富集培养；4.初筛；5.复筛；6.性能鉴定；7.保藏第36页/共160页实例：实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）采样（造纸厂）8030分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性芽孢杆菌，产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱性芽孢杆菌嗜碱性芽孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹

22、陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型constitutiveexpressioninducibleexpression第37页/共160页一）采样时要注意的问题一）采样时要注意的问题气候、水分、空气气候、水分、空气来源要广来源要广结合产品的特点结合产品的特点标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等第38页/共160页富集的三种方案：富集的三种方案：定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养；行培养；二）富集培养二）富集培养富集的目的：富集的目的：让目的微生物在种

23、群中占优势，使筛选变得让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。可能。当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考类学中考虑；虑；不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能时只能通过随机分离的办法。通过随机分离的办法。第39页/共160页定向培养的富集方法定向培养的富集方法1、底物、底物(Substrate)2、pH条件条件3、培养时间、培养时间4、培养温度、培养温度一切能提高目的微生物相对生一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养长速度的手段，培养(固体、固体、液体；分批连续液体；分批连续)后使目的微后

24、使目的微生物在种群中占优势。生物在种群中占优势。第40页/共160页案例分析工业乳酸发酵的菌种选育符合工业生产的菌种的标准：经济性能好，能高效生产乳酸；同型发酵，即只生产单一的一种乳酸分子而无其他有机酸副产物；具有在较高浓度的乳酸环境中生存的能力；具有较高的耐热性；菌种的营养要求相对简单；选择抗噬菌体菌株。Lacticacidbacteria,LAB第41页/共160页乳酸菌菌株乳酸菌菌株能否在葡萄糖上生长能否在葡萄糖上生长是否同型发酵是否同型发酵耐乳酸钠试验耐乳酸钠试验产物的立体结构专一性产物的立体结构专一性第二阶段筛选第二阶段筛选NN弃去弃去弃去弃去第一阶段流程第一阶段流程第42页/共16

25、0页有希望的菌株有希望的菌株生长温度筛选，驯化生长温度筛选，驯化生物反应器分批发酵生物反应器分批发酵细胞细胞-发酵液分离特性发酵液分离特性耐产物驯化耐产物驯化第二阶段流程第二阶段流程有希望的菌株有希望的菌株第43页/共160页菌种分离的一般过程菌种分离的一般过程样品的采取样品的采取预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择产品的鉴定产品的鉴定使隔离使隔离,使孤立使孤立,使绝缘使绝缘,离析离析ScreenIsolate屏屏,银幕银幕,筛子筛子,掩蔽物掩蔽物,屏风，掩蔽屏风，掩蔽,包庇包庇,放映放映,拍摄拍摄ing高通量筛选高通量筛选第44页/共160页三、菌种改良及工程菌构建第45页/共160

26、页第三节微生物代谢控制育种的措施一、营养缺陷型初级代谢产物高产菌株的筛选（1）降低终产物浓度筛选终产物营养缺陷型(auxotrophicmutant)筛选细胞膜透性改变的菌株（2）筛选抗反馈突变菌株筛选结构类似物抗性突变株利用回复突变筛选抗反馈突变株第46页/共160页第47页/共160页2、次级代谢产物高产菌株的筛选（1）利用营养缺陷型筛选）利用营养缺陷型筛选磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸4磷酸赤藓糖磷酸赤藓糖7磷酸阿拉伯庚酮糖磷酸阿拉伯庚酮糖莽草酸莽草酸分枝酸分枝酸对氨基苯酸对氨基苯酸氯霉素氯霉素苯丙氨酸（营养物）苯丙氨酸（营养物）酪氨酸（营养物）酪氨酸（营养物）色氨酸（营养物）色氨酸（

27、营养物）反馈调节反馈调节第48页/共160页产黄青霉生物合成赖氨酸和青霉素的分枝途径a a-酮戊二酸酮戊二酸+乙酰辅酶乙酰辅酶A高柠檬酸高柠檬酸赖氨酸赖氨酸异青霉素异青霉素N青霉素青霉素G反馈抑制反馈抑制a a-氨基己二酸氨基己二酸同型柠檬酸合成酶同型柠檬酸合成酶第49页/共160页渗漏缺陷型(leakymutant)所谓渗漏缺陷型是遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量地生长。由于渗漏缺陷型不会合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节而影响中间代谢物的积累。第50页/共160页二、抗反馈抑制突变株筛选

28、氨基酸结构类似物抗性突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株a a-酮戊二酸乙酰辅酶酮戊二酸乙酰辅酶A高柠檬酸合成酶高柠檬酸合成酶反馈调节反馈调节a a-氨基已二酸氨基已二酸高柠檬酸高柠檬酸结构类似物结构类似物赖氨酸赖氨酸异青霉素异青霉素N青霉素青霉素表表2-1一些用来筛选抗性突变株的结果类似物一些用来筛选抗性突变株的结果类似物第51页/共160页三、其他类型的突变株第52页/共160页工业菌种改良方法工业菌种改良方法(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)增加前体物的

29、浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。第53页/共160页OverviewoftetrapyrrolebiosynthesisGlutamate-1-semiadenhydeGlutamyl-tRNAHemAHemL5-aminolevulinicacidglycineSuccinyl-CoA+HemC,DUroporphyrinogenIIICoproporphyrinigenIIIPrecorrin-2P

30、rotoporphyrinIXProtoheamIXHemYHemHCobAVitaminB12siroheamheamd1PorphobilinogenHemBHemE0.00.51.01.52.02.5024487296120Time(h)ConcentrationofCPIII(mg/L)pPK705pKHEM04(hemA)pKHEM05(hemA,B)pKHEM06(hemB)Piao Y,KiatpapanP,YamashitaM.et al.,EffectsofexpressionofhemAandhemBgenesonproductionofporphyrinin Propio

31、nibacterium freudenreichii.ApplEnvironMicrobiol2004,70:7561-7566第54页/共160页第四节第四节菌种的扩大培养及保藏菌种的扩大培养及保藏菌菌种种扩扩大大培培养养是是指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培养养,最最终终获获得得一一定定数数量量和和质质量量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。一、菌种的扩大培养一、菌种的扩大培养:第55页

32、/共160页种子扩培的目的种子扩培的目的接种量的需要接种量的需要菌种的驯化菌种的驯化l缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长无杂菌污染无杂菌污染第56页/共160页菌种扩大培养的基本过程菌种扩大培养的基本过程实验室阶段：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，

33、因此将这些培养过程称为实验室阶段的种种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。子培养。生产车间阶段：生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归为发酵车间管理，因此称这些培养过程为生产车厂归为发酵车间管理，因此称这些培养过程为生产车间阶段。间阶段。第57页/共160页1）实验室阶段）实验室阶段培养物选择的原则培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽胞的微生物对于不产孢子和芽胞的微生物获得一定数量和质量的菌体获得一定

34、数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。的种子培养。（一）实验室种子的制备（一）实验室种子的制备第58页/共160页获得一定数量和质量的孢子获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。种子，但操作繁琐。对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的菌丝体获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。便于操作，但需要更仔细的控制。

35、第59页/共160页2）培养基选择的原则）培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。精细。第60页/共160页3）起始接种物的传代问题）起始接种物的传代问题细菌细菌保藏保藏活化斜面活化斜面产孢子产孢子保藏保藏母斜面母斜面子斜面子斜面要求：使菌种的传代次数尽可能的少。要求：使菌种的传代

36、次数尽可能的少。第61页/共160页（二）生产车间种子制备（二）生产车间种子制备（1）培养物的选择原则）培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。数量的菌丝体。缩短发酵时间缩短发酵时间有利于获得良好的发酵结果有利于获得良好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：菌丝体比孢子要有利：第62页/共160页（2）培养基选择的原则）培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。菌体的生

37、长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本一是成本二是驯化二是驯化第63页/共160页（3）种龄）种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。大，但是最终由实

38、验结果定。第64页/共160页（4）发酵级数的确定）发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子一级种子(摇瓶摇瓶)二级种子二级种子(小罐小罐)发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子(小罐小罐)二级种子二级种子(中罐中罐)发酵发酵一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数厂从第一级种子罐开始计算发酵级数第65页/共160页发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般

39、级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级；级；在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。的一个方面。第66页/共160页（5）接种量的确定）接种量的确定移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量接种后培养液的体积接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。但是一般认为大一点好。单种法单种法1个种子罐的种子接入个种子罐的种子接入1个发酵罐；个发酵罐；双种法双种法2个种子罐的种子接入个种子罐的种子接入1个发酵罐；个发酵罐；倒种法倒

40、种法以一个发酵罐部分发酵液给另一发酵罐作为种子；以一个发酵罐部分发酵液给另一发酵罐作为种子；混种法混种法以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子。以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子。接种方法：接种方法：第67页/共160页1细胞或菌体菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量的重要指标。2生化指标种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化是菌生长繁殖、物质代谢的反映。3产物生成量种子液中产物的生成量是多种抗生素发酵考察种子质量的重要指标。4酶活力土霉素生产的种子液中测定淀粉酶活力。种子质量标准第68页/共160页二、菌种的衰退与复壮菌种衰退菌种衰退(degeneration)：菌种经过长期人工

41、培养或：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。弱或消失的现象。防止菌种退化的措施防止菌种退化的措施控制传代次数控制传代次数选择合适的培养条件选择合适的培养条件选择合适的保藏方法选择合适的保藏方法菌种稳定性检查菌种稳定性检查分离复壮分离复壮u在生产发酵中，具有高产有重要经济价在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。发酵过程极为重要。第69页/共160页理想

42、的菌种保藏方法应具备的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。三、菌种的保藏三、菌种的保藏第70页/共160页1、斜面保藏法和穿刺保藏法2、石蜡油封存法3、沙土管4、麸皮保藏法5、冷冻干燥6、液氮低温保藏7、其他方法菌种的保藏方法低温保藏低温保藏第71页/共160页低温保藏种类一、普通冷冻保藏技术(-20)二、超低温冷冻保藏技术(-60-80)三、液氮冷冻保藏技术第72页/共160页冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质（常为溶液）。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保

43、护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冻存保护剂冻存保护剂第73页/共160页冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。冰晶损伤：因细胞内部结冰而导致的细胞损伤；溶液损伤：因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤；渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等；非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，一般是写大分子物

44、质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。冻存保护剂冻存保护剂第74页/共160页1、普通冷冻保藏技术(-20)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1-2年。第75页/共160页1.应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。2.保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。3.这一方法虽简便易行，但不适宜多数

45、微生物的长期保藏。第76页/共160页2、超低温冷冻保藏技术(-60-80)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2用无菌生理盐水重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的20甘油或10二甲基亚砜(DMSO)；4混匀后分装入冷冻管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。第77页/共160页3、液氮冷冻保藏技术第78页/共160页3.冻干保藏冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，常用脱

46、脂乳，蔗糖等。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。第79页/共160页1）培养物的冻干过程）培养物的冻干过程第80页/共160页2）冻干菌种的保藏与再生1保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5下保藏。较低的保藏温度(-20-70)对于培养物的长期稳定更好。2复苏：(1)在超净工作台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。(3)在安瓿中加入0.51ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板

47、。第81页/共160页不同菌种保藏方法比较不同菌种保藏方法比较保藏方法保藏方法适用范围适用范围保存有效时间保存有效时间斜面冰箱（斜面冰箱（4）各类微生物各类微生物(病毒除外病毒除外)细菌、酵母细菌、酵母3个月，霉个月，霉菌、放线菌菌、放线菌6个月个月矿油矿油酵母、霉菌、放线菌酵母、霉菌、放线菌低温低温1年以上年以上沙土管沙土管芽孢杆菌、产孢子的霉菌、芽孢杆菌、产孢子的霉菌、放线菌放线菌低温低温1-数年数年冷冻干燥冷冻干燥各类微生物各类微生物低温低温5-20年年固体菌固体菌产大量孢子的霉菌产大量孢子的霉菌低温低温1-3年年超低温超低温冷冻保藏冷冻保藏各类微生物各类微生物(动植物细胞动植物细胞)3

48、-20年年液氮超低温液氮超低温各类微生物各类微生物(动植物细胞动植物细胞)永久性永久性第82页/共160页微生物活力和稳定性测定所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。第83页/共160页加速试验：加速试验是指在保证不改变产品失效机理的前提下,通过强化试验条件,使受试产品加速失效,以便在较短时间内获得必要信息,来评估产品

49、在正常条件下的可靠性或寿命指标.通过加速试验,可迅速查明产品的失效原因,快速评定产品的可靠性指标。加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测保藏菌的稳定性。第84页/共160页四、国内外主要菌种保藏机构ATCC(AmericanTypeCultureCollection）美国典型菌种保藏中心ATCC主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞43

50、00株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。第85页/共160页广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。供除营养外的其它所必须的条件。培养基的作用：培养基的作用：满足菌体的生长满足菌体的生长促进产物的形成促进产物的形成一、培养基：一、培养基：medi