古DNA提取技术的概述和实践经验,人类学论文.docx

《古DNA提取技术的概述和实践经验,人类学论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《古DNA提取技术的概述和实践经验,人类学论文.docx（30页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、古DNA提取技术的概述和实践经验,人类学论文摘 要： 从古代原始材料中提取古DNA的方式方法多种多样，但是古DNA的研究受限于降解严重，内源性古DNA含量低，微生物和现生人群DNA污染严重等因素的影响。能否从古代人类遗骸中成功获取可靠且足量的内源性古DNA，一直是古DNA研究领域面临的实际困难和挑战。控制污染最直接且简便的策略就是在古DNA提取阶段的有效排除，本文整理了古DNA提取常用的去除污染的方式方法，比照分析了每种方式方法表现出来的优缺点。介绍了通常使用的骨粉裂解时间，并研究了在常温环境下，不同的裂解时间对古DNA回收效率的影响，提出了常温裂解经过中最佳孵育时间。同时对常用的古DNA纯化

2、方式方法及其原理和在实际应用中的表现进行了概述与讨论。本文对古DNA提取技术的概述和实践经历体验，为古DNA相关领域的研究提供借鉴与参考。 本文关键词语： 古DNA; 提取技术; 污染防控; Abstract： There are many methods to extract ancient DNA from ancient raw materials. Generally, the research of ancient DNA is subject to factors such as serious degradation, while the low content of endog

3、enous ancient DNA, the high content of microbial and modern human DNA. Whether we can successfully obtain reliable and sufficient endogenous ancient DNA has always been a practical difficulty and challenge in the field of ancient DNA research. The most direct and convenient strategy to eliminate the

4、 pollution effectively is in the procedure of ancient DNA extraction. This paper summarized the common methods of ancient DNA extraction to remove exogenous pollutants. We compared and analyzed the advantages and disadvantages of each method. This paper also introduced the time commonly used in the

5、bone lysis step and suggested the best incubation time was 4 days at room temperature by exploring the effect of different lysis time on the recovery efficiency of ancient DNA. At the same time, we surveyed the representative methods of ancient DNA purification and the performance in the application

6、. Our summary and experience could provide reference information for researchers in the field of ancient DNA research. Keyword： Ancient DNA; Extraction technology; Pollution prevention and control; 1 、引言 古DNA是指古代生物遗体或遗迹中残存的DNA片段，包括古代人类DNA、古代动植物、微生物DNA1,2,3,4。古DNA研究为构建和复原古代人群遗传构造和种族属性1,2,3,4,5,6,7、群体

7、间的沟通及迁移形式8,9，以及灭绝物种的系统发育学等研究打开了通道10,11,12。古DNA的研究同时暗示我们，从原始时期以来，人类的迁徙和族群间的同化一直伴随着冲突、战争和疾病，近些年来古DNA的研究领域开场浸透于传染病和瘟疫历史等领域的研究13。当下，在抗击新冠肺炎疫情的战斗中，复旦大学的古DNA研究团队成功的将古DNA研究技术和经历体验应用于新冠病毒的诊断，并致力于构建新冠病毒基因序列档案库，有利于加深对新冠病毒的认识，防备潜在的各类风险14。得益于考古基因组学这一新兴学科的出现，我们才能够利用古老的DNA重现人类祖先的历史，通过这种方式，我们获得了全新的视角，对人类认识过去、把握如今和

8、选择将来都会产生重大影响。 古DNA的保存状况不仅仅取决于样本材料的年代，更重要的是受遗址所处环境的影响15,16。当前以为古DNA的保存机制可能与牙齿和骨骼中的主要成分羟基磷灰石和胶原质互相作用有关15,17,18。古DNA与羟基磷灰石互相作用的机制是通过带正电的钙离子与DNA分子中带负电的磷酸基团之间互相吸附产生的。羟基磷灰石结合的DNA与游离的DNA相比，降低了脱嘌呤的作用19和DNA被核酸酶降解20的风险。当前，DNA与胶原质的互相作用及其在古代组织中长期保存的机制还不清楚，但有人揣测，在体内水溶液中自发构成的DNA-胶原质复合物可能对古DNA起到保卫作用17,21。 固然古DNA研究

9、技术逐步走向成熟，但是古DNA的污染问题一直面临着宏大考验。遗骸中的骨和牙基质中不仅有内源性DNA即死亡前或死亡时存在于生物体内的DNA，而且还有外源DNA，例如微生物在分解经过中进入骨或牙基质中的DNA。除了少数的例外22,23,24，微生物DNA通常占古DNA提取液的95%以上，影响了高通量测序技术的经济高效性。固然通过对部分DNA片段25,26,27或者全基因组杂交捕获的方式方法28能够缓解外源DNA污染带来的影响，提高古DNA测序效率，但是这一策略耗时耗力，并容易导致基因组单核苷酸突变SNP比照和辨别的偏向性29,30。然而，更复杂的是古人类遗骸或古DNA通常被当代人类DNA污染，在这

10、种情况下利用古DNA中的尿嘧啶U，从当代DNA污染中把内源性古DNA分离出来。尿嘧啶U是由胞嘧啶C脱氨作用诱导并随时间积累的，优先在DNA分子31末端的单链悬链中积累。DNA聚合酶将尿嘧啶解读为胸腺嘧啶T，进而与参考基因组产生C到T的差异，并使古老的DNA分子得以鉴定。携带尿嘧啶的DNA分子可以以在文库制备经过中被物理分离32。然而，这两种方式方法丢弃了大多数不含去氨胞嘧啶残基的古DNA片段，导致内源性古DNA大量丢失。 控制污染最直接的办法就是在古DNA提取阶段，对古代遗骸中微生物和当代人类DNA进行去除。然而，大多数DNA提取方式方法都是针对含有完好细胞和高分子量DNA的新鲜组织而设计的。

11、古代遗骸中的DNA，通常没有细胞构造，而且由于没有特征性的化学修饰，DNA甚至可能难以溶于水溶液中33。古DNA在长期的环境中已经遭受了严重损伤和降解34,35,36，因而在提取经过中应避免再次受损，十分是过度腐蚀性处理，例如高温或使用强力外表活性剂37。尽管这些处理可能会增加DNA的释放，但它们会对古DNA分子造成进一步的损伤，进而降低DNA的总产量。古代骨骼和牙齿通常含有大量的PCR抑制剂38,39，它们干扰DNA扩增，并与古DNA一起被纯化。如今越来越多的研究除了使用线粒体序列外，还使用核DNA序列，与线粒体DNA相比，核DNA在活细胞中的拷贝数要低得多，因而很难从低质量的样本中获得。因

12、而，获得高质量的内源性的DNA一直是古DNA提取方式方法不断改良的方向。为了提高古DNA的回收率，近年来出现了多种优化的古DNA提取技术。本文综述了一些具有代表性的古DNA提取方式方法，并比拟了各种方式方法的优缺点，对古DNA的提取提供参考和借鉴。 2、 骨粉样品的预处理 尽管近些年在古DNA提取方式方法的改良方面已经获得了很大进展，但由于微生物或当代人类DNA的大量污染，也经常会出现一些样本仍然无法进行分析。通过化学或酶处理是避免不同来源的当代人类或微生物DNA污染的有效方式方法，适当的预处理能够提高内源性古DNA的获得。骨粉样品的预处理已经报道了很多方式方法，包括用磷酸盐缓冲液、次氯酸钠缓

13、冲液18、蛋白酶40、EDTA或酸处理骨骼或骨粉41。下面概述了三种典型的骨粉预处理方式方法和其在古DNA研究中的应用。 2.1、 次氯酸钠预处理 次氯酸钠处理骨头或骨粉41,42是法医学研究中最常用的去除外源DNA污染的方式方法，也被用于古代DNA的研究43。在不同的研究中，关于次氯酸钠去污染效率的报道各不一样，从使用 3%的次氯酸钠溶液41完全去除人体污染物到不考虑次氯酸钠浓度的不完全去除污染物。然而，据报道，次氯酸钠处理骨粉后，大约四分之三的内源性DNA丢失44。Korlevi?18对不同浓度下，次氯酸钠溶液处理后的内源性古DNA的丢失和损伤程度进行了比照研究。他将250mg骨粉分成五等

14、分，除了设置的一个空白对照，其余四份分别参加0.1%、0.5%、2%和6%浓度的次氯酸钠溶液。然后用EDTA/蛋白酶K裂解液进行孵育完成古DNA的释放，最后用二氧化硅方式方法进行纯化45。通过检测古DNA文库分子量和shotgun测序之后的古DNA片段长度的比照分析，发现使用0.5%次氯酸钠溶液处理的骨粉样品，固然古DNA有一定程度的丢失，但是不会对古DNA造成损伤18。 在重建3.9万至4.7万年前尼安德特人的遗传历史研究中，大量尼安德特人内源性古DNA保存不善且遭到大量微生物和当代人类DNA的污染。当骨粉或牙粉进行次氯酸盐处理后再进行古DNA的提取，有效的去除了外源污染物，增加了内源性古D

15、NA的释放率和提取效率，使得五个尼安德特人的基因组覆盖率提高了1到2.7倍，且获得有效的基因组序列的尼安德特人样本数量增加了一倍46。 2.2 、基于EDTA/蛋白酶的预消化 骨粉在裂解经过中，骨构造降解，增加了骨的孔隙和总外表积17。与外源污染物相比，内源性古DNA位于更受保卫的骨晶体内47。在骨材料的消化经过中，外表污染物将首先释放到溶液中48。因而，在短时间内用预消化缓冲液处理磨碎的骨材料会去除一部分外源性非靶向DNA，进而提高内源性DNA的富集效率。 预消化是一种简单有效的方式方法，能够从古代样本中去除一定比例的外源DNA。研究表示清楚，基于EDTA酶EDTA和蛋白酶预消化骨骼粉末可将

16、内源性DNA的比例提高数倍。使用较短的预消化时间15-30分钟，在50 C下孵育，获得的内源性DNA是未使用预消化的14倍。但随着长时间的预消化，会影响内源性古DNA的回收率48。 对西伯利亚东北部晚更新世的人类历史研究中，在发现的距今3.1万至600年前的34个古人类DNA进行提取之前，骨粉中参加0.5M EDTA，蛋白酶K,100 TE和10%N-Laurylsarcosyl，在40 C环境中预消化45 min，尽可能多得排除了外源DNA的污染，并获得了有效和可靠的全基因组序列49。该项研究进一步讲明了EDTA酶的预消化作用同样适用于从3.1万600年前这样大跨度时间范围内的古DNA提取。

17、 2.3 、磷酸盐缓冲液预处理 古DNA与羟基磷灰石是通过带正电的钙离子与DNA分子中带负电的磷酸基团吸附而互相作用的。而游离的磷酸盐离子与DNA主链上的磷酸基团互相竞争结合到羟基磷灰石上50,51，使得DNA游离于溶液中，这一原理通常在液相色谱中用于分离核酸50。同时磷酸盐缓冲液预处理也被用于古DNA的提取中的外源DNA的去除52,53。 Korlevi?18对磷酸钠缓冲液预处理条件进行了研究，使用欧亚大陆晚更新世骨骼和牙齿样本，参加0.5 M磷酸钠缓冲液，p H 7.0，常温振荡孵育，并预处理三次，研究发现大多数污染物DNA在第一次磷酸盐孵育经过中被释放出来，当缩短第一次孵育培养时间时，可

18、能会获得更有利的结果。所以建议每次孵育时间使用15 min，可有效的将外源DNA先释放到溶液中得以去除。 3、 裂解时间的研究 骨粉的裂解时间直接影响古DNA的释放和回收率，裂解时间假如不够，古DNA不能完全从骨骼晶体内释放出来。假如裂解时间过长和孵育温度过高，又会导致古DNA进一步损伤。骨粉裂解常用的孵育温度为37，由于此温度下蛋白酶K的活性最高54,55，裂解时间通常为1624小时56。对于骨粉颗粒比拟大的样品来讲，裂解完成后在56温度下，再次孵育13小时，能够增加更多古DNA的释放57。也有研究在使用预处理经过时，首先参加0.5M EDTA(p H 8.0去除样本外表污染物和保持DNA的

19、稳定性，常温孵育24小时，离心收集沉淀物，参加蛋白酶K和DTT,5055温度下孵育24小时2，使DNA完全释放到溶液中。 为了防止温度的升高对古DNA的进一步损伤，我们研究了在常温下，不同的孵育时间对DNA提取效率的影响。研究样本来自于仰韶文化晚期的五庄果墚遗址，该遗址位于陕西省靖边县黄蒿界乡小界村。选取了华而不实一具遗骸中的六颗牙齿并研磨成粉末，将同一骨粉样品分装为200 mg、500 mg和1 g各五等份，分别参加裂解缓冲液0.45 M EDTA和0.25 mg/ml的蛋白酶K,p H 8.0，恒温裂解摇床转速设为250r/min振荡孵育。同一骨粉量的5个等分样品孵育时间分别设为24、48

20、、72、96和120小时，孵育时间超过48小时添加一次0.25 mg/ml的蛋白酶K。孵育完成后用二氧化硅层析柱进行纯化Qiagen,28004，再参加30 l的TE缓冲液10 m M Tris,1 m M EDTA,p H 8.0进行洗脱，得到古DNA提取液。用微量紫外分光光度计对古DNA提取液进行浓度的初步检测，检测到的为总的DNA浓度，华而不实除了内源性古DNA还包括了微生物DNA。然后用当代人的基因组，扩增预先设计好的一段序列并确定其浓度，用已经知道浓度的当代人DNA样品制备出具有稳定扩增的DNA溶液作为参照标准品，借助实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reacti

21、on,PCR对古DNA提取液进行扩增，参照已经知道浓度的标准品梯度范围，计算排除微生物DNA污染的古DNA起始浓度。制备标准品的经过是：首先，根据需要设计扩增引物F15977-R16509:5 -CCACCATTAGCACCCAAA-3 -5 -AGGAACCAGATGTCGGATA-3 ，以当代人基因组为模版扩增目的片段，用琼脂糖凝胶电泳进行目的片段的分离和纯化，将目的片段克隆进质粒载体，构建含有目的片段的重组质粒，以重组质粒作为模版进行扩增，并选择合适检测古DNA起始浓度的标准品浓度梯度，将制备的标准品与古DNA提取液同时进行实时荧光定量PCR，以标准品作为参照，计算古DNA的起始模板量。

22、实时荧光定量PCR结果如此图1所示，结合PCR实时监测的扩增曲线左侧和标准曲线右侧，比照200mg、500mg和1g骨粉在不同裂解时间下的浓度变化，研究结果发现常温孵育96小时4天获得的DNA浓度最大，而孵育120小时后浓度稍有降低，表示清楚孵育时间超过96小时后，DNA可能开场出现明显的降解。所以我们建议假如是在常温条件下孵育进行骨粉裂解经过，孵育时间使用96小时为宜。 图1 常温条件下不同的孵育时间对DNA提取效率的影响 Fig.1 The effect of different incubation time on DNA extraction efficiency at room te

23、mperature 注：左侧为扩增曲线，X轴对应PCR扩增循环数，Y轴对应荧光强度值；右侧为标准曲线，X轴为模板的起始拷贝数的对数，Y轴为每个反响荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。a 200mg骨粉在5个不同裂解时间下的扩增曲线和标准曲线；b 500mg骨粉在5个不同裂解时间下的扩增曲线和标准曲线；c 1g骨粉在5个不同裂解时间下的扩增曲线和标准曲线。 4 、古DNA纯化方式方法 4.1、 基于二氧化硅硅粒的古DNA纯化 当溶液的p H值低于或等于二氧化硅外表电离常数时，二氧化硅外表携带的负电荷减少，因此与DNA分子带的负电荷之间的排挤力也随之减弱，会构成很多的水合离子，降低了DNA分子的

24、水合程度，进而DNA分子集聚到二氧化硅的外表。收集DNA时，先用洗涤缓冲液洗掉吸附有DNA分子的二氧化硅外表的其他杂质，再用p H值高于电离常数的溶液洗脱吸附在二氧化硅外表上的DNA分子，进而获得DNA提取液。 在二氧化硅颗粒纯化古DNA方式方法中，所有的步骤都是在室温20-23下进行的，进而减少了对脆弱的古DNA造成进一步损伤，并去除了古代骨骼样本中存在的大多数不同类型的PCR抑制剂，为后续古DNA实验操作如PCR扩增提供稳定环境。该方案可方便地适用于不同样品量的骨粉和提取体积。该方式方法操作步骤较少，需要的设备简单，可在2个工作日内完成古DNA的提取。但是在实际操作中，假如操作不慎易造成吸

25、附DNA的二氧化硅颗粒的外溅和损耗，会降低古DNA的回收率。 4.2 、硅离心柱纯化古DNA 古DNA提取中常用的二氧化硅离心柱主要分两种，一种是直接采用商业化的硅胶离心柱Qiagen,28004)58,59对古DNA进行富集；另一种是通过优化商业化的色谱柱，得到更高层次效的富集古DNA的硅离心柱：首先将二氧化硅颗粒固定在1 m孔径的色谱膜中Whatman,1.0 m，然后将固定有二氧化硅颗粒的色谱膜放入商业化的色谱柱中60(Mobicols,M1002S,10 m孔径。这种改进的二氧化硅离心柱在古DNA提取中也被广泛的应用61,62。 直接采用商业化的硅胶离心柱操作简便、大大减少了提取时间和

26、人力的消耗，但是商业化的硅胶离心柱会使古DNA的回收效率遭到产品本身的影响，比方受硅胶的粒径、密度、纯度和固定方式等因素的影响，会使古DNA的吸附和洗脱效率有很大差异不同。在实际应用中，我们发现用Qiagen品牌下的Min Elute硅胶离心柱对古DNA的回收效率明显优于国产的某些硅胶离心柱。另外，商业化的硅胶离心柱回收的DNA产量是有限的37，且通常不合适大样本体积量的使用。用商业化的色谱柱优化的二氧化硅离心柱能够防止在离心经过中，细小的二氧化硅颗粒的丢失。但是用色谱柱制备成二氧化硅离心柱经过较为繁琐，增加操作步骤和工作量，容易将外源DNA污染再次引入古DNA提取。 4.3 、磁珠法纯化古D

27、NA 磁珠法提取DNA常用的是硅质膜二氧化硅磁珠，是由超顺磁性内核和二氧化硅外壳组成，外表修饰大量的硅羟基。磁珠外表的硅羟基能够与溶液中的核酸通过氢键和静电作用发生特异性结合，在高盐条件下与核酸结合，而在低盐环境下被洗脱，在外加磁场作用下，磁性颗粒与溶液分离，回收磁珠颗粒即磁珠-DNA混合物，即能够直接从复杂生物体系中迅速分离核酸63。 该方式方法也被应用于古DNA的提取64，从新石器时期5000年前的遗骸材料中，成功提取了古DNA，并完成了线粒体DNA的扩增和分析。值得注意的是，该方式方法在整个纯化经过不需要离心，简化了古DNA提取步骤，大大缩短了提取时间，易于操作，成本低廉，设备需求简单。

28、 4.4 、乙醇/异丙醇沉淀法纯化古DNA 根据乙醇和异丙醇能够沉淀核酸，实现DNA的分离和纯化的原理，被应用于古DNA的提取。异丙醇比乙醇沉淀DNA的效果要好，由于异丙醇比拟疏水，能够较好的沉淀和分离DNA。但是乙醇比异丙醇愈加亲水，能够有效的去掉盐离子，且易于挥发，对下游的实验影响较小。所以在沉淀核酸时，通常在使用异丙醇之后，再用70%的乙醇屡次洗涤脱盐。这种方式方法快速，既不需要危险化学品，也不需要特殊的设备，能够减少耗时的分离脱钙步骤、透析、离心驱动的微浓缩等经过65。 乙醇/异丙醇沉淀法对于血液样本DNA提取具有很好的效果，操作简便、成本低廉、提取的DNA质量高，但是对于古DNA的提

29、取却存在弊端。古DNA含量极低，在乙醇/异丙醇沉淀的经过中，很难看到白色絮状沉淀物，在DNA抓取中容易漏掉一定量的古DNA。古DNA高度片段化，有相当一部分片段小于100bp；对于分子量极小的古DNA片段，在乙醇/异丙醇沉淀离心后，很难回收到短片段的古DNA，这样就会造成内源性古DNA的丢失。 5、讨论与结束语 从古代原始材料中提取DNA方式方法有很多种，样品预处理和提取经过需要考虑不同来源的当代和微生物DNA的污染。能否从古代人类遗骸中成功获取内源性古DNA并进行深切进入研究分析，一直是古DNA研究领域面临的实际困难和挑战。控制污染最直接的手段就是古DNA提取阶段，骨粉的预处理经过能够大幅度

30、排除古代遗骸中微生物和现生人类DNA的污染。但在去除污染的经过中，有些预处理方式方法又会带来新的问题，比方次氯酸钠缓冲液预处理能够增加古DNA的释放率和序列匹配率，浓度的使用不当很容易造成内源性古DNA损伤；磷酸盐缓冲液也会增加古DNA序列的匹配率使用磷酸盐缓冲液预处理，古DNA序列的匹配率会增加两倍，而用次氯酸钠预处理古DNA的匹配率会增加4.6倍18，但是内源性古DNA释放得较少18。固然次氯酸钠和磷酸盐处理可有效去除微生物DNA的污染，且大大降低了古代材料基因组测序的成本，但去除人类污染方面表现着低效性18。需要注意的是，文库中污染的百分比并不一定反映骨粉中存在的污染水平，由于一些当代人

31、类DNA污染是在实验室操作中引入的。次氯酸钠处理的骨粉尤其如此，内源性DNA分子的大量丢失放大了人类污染的影响，次氯酸钠处理不能保证去除人类污染42,44，导致文库中现生人类DNA污染的百分比增加，因而不适用于不能重复取样的小而贵重的标本。研究发现对同一骨粉样品用EDTA和蛋白酶进行预消化处理，内源性古DNA相对于微生物和当代人类污染的比例明显增加了47,48,66。但是此预消化经过需在50 C下孵育，应尽量减少孵育时间，通常为15-30分钟，以免长时间的预消化，内源性古DNA增加到达饱和，使得古DNA浓度下降。 骨粉的裂解温度和时间会影响古DNA的释放和回收率，为了防止孵育温度的升高对古DN

32、A的进一步损伤。我们研究了常温环境下，200 mg、500 mg和1 g不同骨粉量，在裂解缓冲液0.45 M EDTA和0.25 mg/ml的蛋白酶K的作用下，不同的裂解时间对古DNA的回收率的影响，研究发如今常温环境中裂解骨粉的最佳时间为4天96小时。 也有研究将无损提取方式方法67,68用于古代骨骼和牙齿材料古DNA提取中，为了避免在研磨经过中对古DNA的进一步损伤，将古代样本材料直接浸泡在裂解缓冲液中，待古DNA完全释放进行纯化分析。无损古DNA提取方式方法也会得到较好质量的古DNA。但经过无损方式方法处理后的样本材料颜色变得更浅，而且出现比以前更多的空隙，这些结果似乎表示清楚，无损提取

33、技术固然不会毁坏原始样本材料外在的形貌，但也会损害材料内部的构造69。 古DNA的纯化回收方式方法多种多样，主要是基于二氧化硅硅粒、商业化的凝胶柱或自制的回收柱和醇类沉淀等方式方法。在使用这些方式方法时，古DNA的富集和回收效率会受很多外因的影响，比方DNA结合缓冲液的PH，富集DNA的硅胶或硅粒的构造、比外表积、质地，以及纯度等因素的影响。十分是购买的商业化的硅离心柱，不同厂家的产品，富集和回收效率也会存在差异，并通常不合适大样本量使用，且存在现生人群DNA污染的风险。对于较大样本体积，还需要注意的是使用的结合缓冲液和洗涤缓冲液时，需要尽量避免盐类和杂质融入古DNA提取液，以免影响后续建库、

34、扩增和测序等经过的顺利进行。 一些人以为古材料中存在的DNA都是当代污染物造成的，所以符合古DNA研究标准的超净实验室和实验员操作经过中的严格防护，能够降低现生人群DNA的污染几率。适当的独立对照实验的引入，能够确认研究样本DNA的真实性，还能够确保不会错误地从微生物序列中进行扩增。 古DNA的研究受限于DNA保存环境，微生物DNA含量高，现生人群的DNA污染等因素的影响。固然古DNA提取技术在不断改良，挑选内源性古DNA片段的方式方法不断在优化，获得可靠和足量的古DNA序列信息仍然面临着宏大考验。而降低古DNA污染最有效和方便的阶段就是在古DNA提取阶段的污染防控，本文整理了古DNA提取常用

35、的去除污染的手段，比照分析了每种去污染方式方法表现出来的优缺点。总结了通常使用的骨粉裂解时间，并研究了在常温环境下，不同的裂解时间对古DNA回收效率的影响，提出了常温裂解经过最佳的孵育时间。除此之外，骨粉裂解完成后的纯化方式方法呈现多样性，列举了常用的纯化方式方法的基本原理，以及在古DNA研究应用中的表现进行了整理和总结。本文对古DNA提取技术进行了概述和讨论，希望为从事古DNA领域研究的学者们提供借鉴与参考。 以下为参考文献 1 Campos PF, Willerslev E, Sher A, et al. Ancient DNA analyses exclude humans as the

36、 driving force behind late Pleistocene musk ox(Ovibos moschatus)population dynamicsJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2018, 107(12):5675-5680 2 Leonard JA, Wayne RK, Cooper A. Population genetics of ice age brown bearsJ. Proceedings of the National Aca

37、demy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(4):1651-1654 3 Pinsky ML, Newsome SD, Dickerson BR, et al. Dispersal provided resilience to range collapse in a marine mammal:insights from the past to inform conservation biologyJ. Mol Ecol, 2018, 19(12):2418-2429 4 Shapiro B, Drummond AJ,

38、Rambaut A, et al. Rise and fall of the Beringian steppe bisonJ. Science, 2004, 306(5701):1561-1565 5 Stiller M, Baryshnikov G, Bocherens H, et al. Withering away-25,000 years of genetic decline preceded cave bear extinctionJ.Mol Biol Evol, 2018, 27(5):975-978 6 Ning C, Li TJ, Wang K, et al. Ancient

39、genomes from northern China suggest links between subsistence changes and human migrationJ. Nature communications, 2020, 11(1):2700 7 Wang K, Goldstein S, Bleasdale M, et al. Ancient genomes reveal complex patterns of population movement, interaction, and replacement in sub-Saharan AfricaJ. Science

40、Advance, 2020, 6 eaaz0183 8 Narasimhan VM, Patterson N, Moorjani P, et al. The Genomic Formation of South and Central AsiaJ. bio Rxiv, 2021, 9 Green RE, Krause J, Briggs AW, et al. A draft sequence of the Neandertal genomeJ. Science, 2018, 328(5979):710-722 10 Shapiro B, Sibthorpe D, Rambaut A, et a

41、l. Flight of the DodoJ. Science, 2002, 2951683 11 Krause J, Unger T, Nocon A, et al. Mitochondrial genomes reveal an explosive radiation of extinct and extant bears near the Miocene-Pliocene boundaryJ. BMC Evol Biol, 2008, 8220 12 Orlando L, Metcalf J, Alberdi M, et al. Revising the recent evolution

42、ary history of equids using ancient DNAJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2018, 10621754-21759 13 Barquera R, Krause J. An ancient view on host-pathogen interaction across time and spaceJ. Current opinion in immunology,2020, 6565-69. 14吴苡婷古DNA检测技术在抗击新冠中的特殊作用N上海科技报，2020. 15 Collins MJ, Nielsen-Marsh CM, Hill

43、er J, et al. The survival of organic matter in bone:a reviewJ. Archaeometry, 2002, 44(3):383-394 16 Hofreiter M, Paijmans JL, Goodchild H, et al. The future of ancient DNA:Technical advances and conceptual shiftsJ. Bioessays,2021, 37(3):284-293 17 Campos PF, Craig OE, Turner-Walker G, et al. DNA in

44、ancient bone-where is it located and how should we extract it?J. Ann Anat, 2020, 194(1):7-16 18 Korlevic P, Gerber T, Gansauge MT, et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teethJ. Bio Techniques, 2021, 59(2):87-93 19 Lindahl T. Instability and decay

45、 of the primary structure of DNAJ. Nature, 1993, 362709-715 20 Brundin M, Figdor D, Sundqvist G, et al. DNA binding to hydroxyapatite:a potential mechanism for preservation of microbial DNAJ. J Endod, 2020, 39(2):211-216 21 Svintradze DV, Mrevlishvili GM, Metreveli N, et al. Collagen DNA ComplexJ. B

46、iomacromolecules, 2008, 921-28 22 Reich D, Green RE, Kircher M, et al. Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in SiberiaJ. Nature, 2018,468(7327):1053-1060 23 Prufer K, Racimo F, Patterson N, et al. The complete genome sequence of a Neanderthal from the Altai MountainsJ. Natu

47、re,2020, 505(7481):43-49 24 Gamba C, Jones ER, Teasdale MD, et al. Genome flux and stasis in a five-millennium transect of European prehistoryJ. Nature,communications, 2020, 55257 25 Burbano HA, Hodges E, Green RE, et al. Targeted Investigation of the Neandertal Genome by Array-Based SequenceJ. Scie

48、nce,2018, 328723-725 26 Avila-Arcos MC, Cappellini E, Romero-Navarro JA, et al. Application and comparison of large-scale solution-based DNA captureenrichment methods on ancient DNAJ. Sci Rep, 2018, 174 27 Fu QM, Meyer M, Gao X, et al. DNA analysis of an early modern human from Tianyuan Cave, ChinaJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2020, 110(6):2223-22