小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展--.docx

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1、小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展【摘要】;小鼠胚胎干细胞（embryonicstemcell,EScell）体外培养可以分化成为外胚层组织，并进一步分化为神经元和神经胶质细胞。这些细胞已用于中枢神经系统疾病的细胞替代治疗和治疗药物的研发。小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的方法主要有拟胚体介导的神经细胞分化、基质细胞诱导的神经细胞分化、默认模式介导的神经细胞分化、单层粘附培养诱导的神经细胞分化和遗传工程介导的神经细胞分化等。本文综述了这些分化方法。【关键词】;胚胎干细胞;神经细胞;分化;Progressindirecteddifferentiationofmouseembryonics

2、temcellsintoneuralcells【Abstract】;Mouseembryonicstemcellscangiverisetoectodermalderivativesincultureandcanbefurtherinducedintoneuronsandgliaforcell-replacementtherapiesinthecentralnervoussystemandforuseindrugdiscovery.Themethodsofdirecteddifferentiationofmouseembryonicstemcellsintoneuralcellsinclude

3、neuraldifferentiationfromembryonicstemcellsviaembryoidbodies,stromalcellinducedneuraldifferentiation,defaultmodelmediatedneuraldifferentiation,adherentmonocultureinducedneuraldifferentiation,geneticengineeringmediatedneuraldifferentiationandsoon.Herewereviewthesemethodologies.【Keywords】;embryonicste

4、mcell;neuralcell;differentiation;小鼠胚胎干细胞于1981年首次由Evans和Kaufman1成功分离建系，它们;于胚泡的内细胞团（innercellmass,ICM），这些细胞具有稳定的二倍体核型，在体外可以分化为三个胚层的多种细胞。将小鼠胚胎干细胞重新植入胚泡可以参与形成胚胎。体外ES细胞维持未分化状态依赖于一些细胞因子的存在，如白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor,LIF）2。撤去这种自我更新的刺激信号后，ES细胞很快分化为多种细胞。这些属性使ES细胞成为非常有用的发育生物学和功能基因组学研究的生物系统3。1;拟胚体（embry

5、oidbodies,EBs）内神经细胞的分化;小鼠ES细胞通过拟胚体分化为神经细胞主要有以下两种方案。1.1;“4-/4+方案4;将小鼠ES细胞无LIF培养4天，形成EB；再用维甲酸（retinoicacid,RA）处理4天，然后在明胶（gelatin）5或层粘连蛋白（laminin）4包被的组织培养皿上培养6。培养6天后，细胞出现明显的神经细胞形态，开始表达神经细胞特异的基因，如神经微丝轻链（neurofilamentlightchain）、微管相关蛋白2和5（MAP2、MAP5）等。这些细胞对一系列神经递质和去极化电流起反应，证实了它们是可以传递兴奋的神经元。这一方案还会分化出神经胶质细胞

6、，多数为星形胶质细胞，但也有少突胶质细胞的存在7。RA是一类促神经生长因子，不仅对多潜能干细胞有诱导作用，对神经前体细胞也有促进增殖、成熟的作用。RA与受体RAR、RXR结合，后者活化后与RA反应元件（RARE）结合，激活神经细胞相关基因并抑制中胚层相关基因的转录8。Wiles等人的实验表明RA通过激活抑胰蛋白（follistatin）抑制骨形态形成蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP）而使小鼠ES细胞向神经细胞方向分化9。;该方案时间短、成本低，是目前使用较为广泛的神经细胞诱导方法。其不足之处是EB的外层细胞先分化而内层细胞仍保持未分化状态,分化不均一，得到的细胞种

7、类复杂，不利于纯化。1.2;“五步法方案10;(1)扩增未分化的胚胎干细胞；(2)去除分化抑制剂或促有丝分裂素，ES细胞开始分化，不贴壁悬浮生长，形成EB；(3)去除生长因子，选择巢蛋白（nestin）阳性细胞（即神经前体细胞）；(4)使用神经细胞培养液，添加生长激素、神经营养因子，扩增神经前体细胞；(5)利用促神经元存活因子诱导并维持神经元成熟。该方案不用RA处理EB，而是将EB在一种选择性的无血清培养基上培养。因为EB中的非神经细胞不能在这种培养条件下生存，所以大部分存活下来的细胞是nestin阳性的神经前体细胞11。这些神经前体细胞可被高效地诱导分化为神经元12。;该方案的主要优点是在进

8、一步分化为神经元或神经胶质细胞之前，神经前体细胞已经得到较高的纯化，这有利于特定类型神经细胞的获得。但是，其操作较“4-/4+方案复杂，而且多种生长激素、神经营养因子的增加了成本且不利于分化机制的阐明。通过EB途径由ES细胞分化而来的神经元多数为-氨基丁酸（GABA）能神经元，少数是谷氨酰胺能神经元。通过改变诱导分化的条件，可以得到不同类型的神经元或神经胶质细胞，并提高分化效率。腹侧中脑和后脑是多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元产生的部位，SHH(sonichedgehog)和FGF-8（fibroblastgrowthfactor-8）对这两部分的形态发生起重要作用13，Lee等人10用这两

9、种分子处理EB;的神经前体细胞得到了多巴胺能神经元和5-羟色胺（5-HT）能神经元。2002年Wichterle等人14用背侧分子（RA）和腹侧分子（Hh-Ag1.3,一种SHH的拮抗剂）处理EB，得到了腹侧脊髓运动神经元。2005年Tsuchiya等人15在经典的“五步法方案基础上，在第五步除去bFGF（basicfibroblastgrowthfactor），用含有层粘连蛋白的N2培养液中成功诱导分化出微小胶质细胞，并进一步用含有胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）和粒单细胞集落刺激因子（GM-CSF）的RPMI-1640培养液扩增细胞，得到89.0%的微小胶质细胞。2;基

10、质细胞诱导的神经细胞的分化;第二类诱导神经细胞分化的方法是基质细胞诱导方法，该方法的诱导机制尚不清楚，目前称为“基质细胞;的诱导活性作用（stromalcell-derivedinducingactivity,SDIA）16。2000年Kawasaki等人描述了一种经基质细胞诱导ES细胞分化为多巴胺能神经元的方法16。这一方法中，神经细胞的分化通过ES细胞与小鼠骨髓;的基质细胞PA-6细胞单层共培养而实现。实验结果表明，92%的细胞表现为神经细胞黏附分子（nervecelladhesionmolecule,NCAM）阳性，其中多数为酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase,TH）阳

11、性细胞。酪氨酸羟化酶是多巴胺生物合成的限速酶，因此是多巴胺能神经元的一个很好的分子标志。2005年Yamozoe等人17用含有肝素的磷酸盐缓冲液冲洗培养的PA-6细胞得到含有所谓神经诱导因子（neuralinducingfactors,NIF）的溶液，用此溶液培养小鼠ES细胞，发现小鼠ES细胞可以在含有33%NIF溶液的培养液中生存，并且随着培养液中肝素浓度的增加，ES细胞分化为神经细胞的比例也增高。值得注意的是，PA-6细胞介导的神经细胞分化受到血清或BMP-4的抑制，血清和BMP-4的加入可引起ES细胞分化为多种非神经细胞。PA-6细胞的SDIA作用并不能使所有类型的干细胞诱导分化为多巴胺

12、能神经元，例如，2005年Roybon等人18报道，对于神经前体细胞，PA-6细胞不能促进其向多巴胺能神经元分化，而是促进其向星形胶质细胞的分化。2003年Barberi等人19描述的一种经基质细胞诱导分化的方法可以将ES细胞分别诱导分化为多种神经细胞。这一方法将小鼠骨髓;的基质细胞MS5或S17或主动脉-性腺-中肾区;的原始基质细胞作为饲养层细胞与ES细胞在血清替代培养液中共同培养，得到神经前体细胞，再用不同的细胞因子序贯处理这些神经前体细胞，分别可以得到较高百分比的胆碱能神经元、5-羟色胺能神经元、多巴胺能神经元、-氨基丁酸能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。将得到的多巴胺能神经元注射到

13、6-OHDA诱导的帕金森模型动物的患侧纹状体内，8周后由中枢神经系统兴奋剂amphetamine或者纹状体D1、D2受体激动剂apomorphine所诱导的旋转不稳定症状得到了显著改善，并且可以在注射细胞的纹状体内发现大量的酪氨酸羟化酶阳性细胞。基质细胞诱导神经细胞分化的方法可以高效获得某种特定的神经细胞，例如，多巴胺能神经元和胆碱能神经元。然而，作用机制还有待进一步阐明。3;默认模式（defaultmodel）介导的神经细胞分化2001年Tropepe等人20发现小鼠ES细胞在低密度、无血清、无饲养层细胞的条件下培养7天后，约0.2%的细胞可形成神经球（neurosphere），并进一步自发

14、分化为神经细胞，这种分化方法称为默认模式。这是抑制神经分化的信号分子表达降低的结果。Wiles等人9发现在神经分化过程中，可以检测到BMP、TGF等基因的表达下调。BMPs在神经发育早期与细胞表面丝/苏氨酸受体结合激活Smad蛋白，后者进入核内抑制Mash1、Math1、Ngn1/2、NeuroD等转录因子的活性，调节下游基因的表达，从而抑制神经分化21。BMP4处理的小鼠ES细胞在分化过程中神经元数量大为减少22；而用noggin、follistatin、chordin、Cerberus等BMPs的拮抗剂处理小鼠ES细胞则可促进ES细胞向神经细胞方向的分化。该方法促进神经分化的效率较低，单独

15、此法诱导神经细胞分化并不多见。4;单层粘附培养诱导的神经细胞分化2002年Pachernk等人23在不形成EB和不用RA处理的情况下，将小鼠ES细胞生长在含有胰岛素（insulin）、转铁蛋白（transferrin）、硒元素（selenium）和纤连蛋白的无血清DMEM/F12培养液中，发现分化的细胞多数表达MAP-2等神经细胞的标志性蛋白。2003年Ying等人24将细胞密度为0.51.5104/cm2的小鼠ES细胞培养于0.1%明胶包被的组织培养皿上，以N2B27作为培养液，培养4天后，60%以上的细胞分化为神经前体细胞。该方法形成的神经前体细胞具有良好的可塑性：神经前体细胞在N2B27培养液中培养，得到的细胞多数为GABA能神经元；FGF8和SHH处理神经前体细胞可以得到较多的多巴胺能神经元。此类方法将形成EB的三维培养模式简化为单层粘附培养的模式，降低了复杂程度，有利于神经细胞分化早期事件的分子机制研究，而培养液中各成分发挥的作用需要进一步阐明。;1;