磷酸化组氨酸相关生物化学性质研究综述,生物化学论文.docx

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1、磷酸化组氨酸相关生物化学性质研究综述,生物化学论文蛋白质磷酸化的相关研究起步于 20 世纪初尽管 Levene 等1早在 1906 年就发现卵黄素蛋白中存在磷酸基团，但直到 1932 年他们2才鉴定出该磷酸基团是磷酸化的丝氨酸此后，一系列磷酸化氨基酸得到验证，包括 9 种天然氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和组氨酸)与羟脯氨酸磷酸化主要包含 4 种形式，即 O- 磷酸化、N- 磷酸化、S- 磷酸化和酰基磷酸化华而不实磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸与磷酸化酪氨酸已被广泛研究(图 1)它们在细胞代谢与调控中起到了重要的作用3但是，其他一些磷酸化氨基酸无论从含量

2、或者功能上都不可忽视，磷酸化组氨酸就是一个重要代表. 磷酸化组氨酸是一种广泛存在的磷酸化氨基酸，据估计其在真核细胞内含量固然不及磷酸化丝氨酸，却是磷酸化酪氨酸的数十倍4而且 N P共价键的特异性导致磷酸化组氨酸有多种不同于O P共价键连接的磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸或磷酸化酪氨酸的化学性质同时，蛋白质中组氨酸残基的磷酸化也是一种调节细胞内蛋白质功能的重要方式5本文将从磷酸化组氨酸的发现与发展历史出发，总结其相关生物化学性质的研究，并进一步综述该修饰后氨基酸生理功能的相关研究 1发现历史 磷酸化组氨酸最早由Severin 等6于1947 年实现化学合成1963 年，Boyer 小组7才在线粒体蛋

3、白质的研究中完成其生化检验人们最初认识到磷酸化组氨酸可能是一个磷酸化酶的中间体状态，而该步骤是某些酶催化经过所必需的随着研究的深切进入，人们逐步发现磷酸化组氨酸是一种广泛存在于生物界的信号调节方式81994年，Simon 等9报道了原核生物细菌中基于组氨酸磷酸化酶的 双组分 信号传递系统；1993 年，报道了酵母10中的同源序列蛋白质SLN1 与 SSK1112000 年，Muimo研究组12发现，绵羊气管上皮细胞体系中钙离子依靠性磷酸结合蛋白 annexin存在组氨酸磷酸化现象 -32P 标记的 ATP 和 GTP 及相关磷酸化氨基酸生化分析证明了这一结论这一磷酸化经过进一步导致 annex

4、in下游的信号传递因此，这个工作证明了组氨酸磷酸化在哺乳动物细胞信号传递经过中的重要作用另一方面，人们也在探寻求索磷酸化经过的逆经过，即去磷酸化经过在细菌中，很多磷酸化酶本身也具有去磷酸化作用Mizuno 小组13报道了第一个大肠杆菌中的磷酸化组氨酸去磷酸化酶SixA该酶是 ArcB 信号通路的一个重要调节因子此后，人们在哺乳动物细胞中也发现了很多磷酸化组氨酸去磷酸化酶14，而且它们具有各自不同的功能15另外，其他一些氨基酸残基的激酶也被报道利用磷酸化组氨酸作为中间体16这些信号通路与某些人体生理及病理状态直接相关，例如组蛋白上组氨酸的磷酸化与基因转录与表示出直接相关17,这些去磷酸化酶也因此

5、成为潜在的药物靶点18 2化学构造与命名法 人们对磷酸化组氨酸构造的研究持续了很长时间磷酸化组氨酸在生物体内存在两种异构体，二者的差异不同在于咪唑环上磷酸化的位点不同(图 2)这一特性与其他所有的磷酸化氨基酸都有区别另外，人们还化学合成了 1, 3- 二磷酸化组氨酸，但是其并没有在生物体系中被发现19。 值得注意的是，对于磷酸化组氨酸两种异构体的命名一直都存在分歧长久以来，大部分对于磷酸化组氨酸报道的文献中都将异构体3称为 3- 磷酸组氨酸20然而，基于对于咪唑环的传统编号命名法，也有文献21将异构体3称为 1- 磷酸组氨酸除此之外，Delbaere 等22在蛋白质晶体学的研究报道中还将2和3

6、两个异构体分别称作 N 1 位磷酸化和 Nε2 位磷酸化的组氨酸为了避免类似的命名差异，国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)以及国际生化联合会(IUB)联合发表了关于含有磷酸基团的诸多生物分子的推荐命名法，华而不实便包含了这一对异构体23在该命名法中，异构体2被称为3(1)- 磷酸组氨酸，而异构体3被 称 为 1 (3)- 磷 酸 组 氨 酸 ， 同 时 ， 词 头 由 phosphor 改为 phosphono 以表示离子状态除此之外，该命名法还推荐将异构体2称为 -磷酸组氨酸或pros-磷酸组氨酸，而异构体3称为 -磷酸组氨酸或tele-磷酸组氨酸 3主要生物化学性质 3

7、.1化学不稳定性 由于磷酸化组氨酸本身的化学不稳定性，其在生物体内研究的报道相对于其他磷酸化氨基酸的报道一直较少从热力学角度看，磷酸化组氨酸中磷酸基团与咪唑环上的 N 原子连接构成磷酰胺构造磷酰胺键本身是不够稳定的，这是由于磷酰胺构造中的P N 化学键水解经过的自由能变化(水解经过的标准吉布斯自由能变约为-12-14 kcal/mol)较磷酸酯构造(磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸、磷酸化酪氨酸)中的 P O 化学键水解经过(水解经过的标准吉布斯自由能变约为-6.5-9.5 kcal/mol)的自由能变化大了不少24从动力学的角度看，磷酸化组氨酸对酸较为敏感，而其他通过磷酸酯连接的磷酸化氨基酸对酸较

8、为稳定25实验表示清楚，1 mol/L盐酸溶液在 100条件下，游离的磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸的半衰期约为 18 h，而磷酸化酪氨酸约为 5 h1 mol/L 盐酸溶液在 49条件下，游离的磷酸化组氨酸半衰期也只要数十秒尽管两种磷酸化组氨酸的异构体都很容易在酸性溶液中发生去磷酸化，二者的热力学稳定性是有所区别的 -磷酸组氨酸相比于 -磷酸组氨酸不稳定，因而水解也就更快而 - 磷酸组氨酸和 - 磷酸组氨酸的稳定性差异被以为是N 原子上磷酸基团与质子化的 -氨基的空间距离不同所致26 3.2含有磷酸化组氨酸蛋白的制备及异构体的构成与转化 为了研究磷酸化组氨酸在蛋白质调控中的作用，我们需要首先制备

9、含有磷酸化组氨酸的蛋白，同时可以以将此作为正对照组方式方法一，最直接的方式方法是磷酸激酶磷酸化法通过酶法进行磷酸化能够实如今组氨酸特定位点的选择性磷酸化，但是只对特定酶辨别的底物有效例如酶法制备的组蛋白H4已经被广泛地应用在生化实验中27方式方法二，选择性的化学磷酸化也是一种常用的方式方法28，即利用磷酰胺钾盐在 pH 78 的条件下处理蛋白质，便能够高产率地实现组氨酸磷酸化，其他各类氨基酸残基并不会被磷酸化需要注意的是，在这里反响中， -磷酸组氨酸是动力学优势的产物而随着反响的进行，热力学较为稳定的 -磷酸组氨酸会逐步成为优势产物固然通过色谱能够将两种异构体分离，但是通过化学方式方法得到纯净

10、的 -磷酸组氨酸还是一个挑战近期，K觟nig 小组29报道了利用磷酰胺基钾(PPA)作为磷酸化试剂直接修饰天然蛋白质的工作对于含有多个组氨酸残基的模型蛋白，该处理法将得到一系列不同数目的组氨酸磷酸化产物他们利用生化手段进行了表征PPA 对所有测试的蛋白质都适用，而且还能保证其三级构造的完好性另外， -磷酸组氨酸即使在温和的碱性溶液中也缓慢地转化为 -磷酸组氨酸26，这一情况同样可能发生在分离与鉴定经过中，因此我们能够猜测从生物体内提取分离的 -磷酸组氨酸可能有一部分由 -磷酸组氨酸转化而来 4磷酸化组氨酸及其相关蛋白质的研究方式方法 由于磷酸化组氨酸具有酸不稳定性，因而传统的鉴定分离方式方法不

11、太实用相反，磷酸化组氨酸具有碱稳定性，即使在强碱的热溶液中也不降解而这样的条件能够将磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸等分解这归因于磷酰胺与磷酸酯化学性质的差异不同 4.1生化技术与分析化学技术 用非特异性蛋白酶处理磷酸化蛋白能够将其降解为相应多肽片段能够用反相薄层层析法(RP-TLC)进行鉴定，用反相电泳、反相高效液相色谱(RP-HPLC)等进行分离质谱或者串联质谱(MS/MS)也已广泛用于磷酸化蛋白的分析28需要十分注意的是，液相色谱的流动相假如含有酸性成分可能使其分解，而且质谱分析中的正离子检测形式可以能使得磷酸化组氨酸脱去磷酸基团为了克制这一技术挑战，人们做了很多相关探寻求索Ross小组30以

12、已经知道的磷酸化蛋白 HPr 为例，对样品制备、亲和分离及质谱技术进行了系统性研究最近又有一些新的技术进展31另外，由于自然条件下丰度最高的同位素31P 具有很强的核磁共振信号，因此核磁共振磷谱(31P NMR)长期被用作一种磷酸化蛋白质的分析手段32自从 Gassner 等33于 1977年报道了首个 -磷酸组氨酸与 -磷酸组氨酸1H与31P NMR的精细数据以来，人们已经将这一研究手段拓展到鉴定蛋白质中的磷酸化组氨酸异构体的研究中34同时，人们也发展了相应的生化技术来研究直接提取含有磷酸化组氨酸的蛋白质由于磷酸化蛋白质在体内的含量很低，首先需要对其进行富集磷酸化蛋白质组学为此提供了详细的研

13、究方式方法并获得了重要的突破35，人们考虑借鉴其他磷酸化氨基酸的类似研究思路用免疫亲和色谱或者固定金属亲和色谱(IMAC)进行研究例如 Napper 与其合作者36通过固定的铜离子()亲和色谱富集分离了含磷酸化组氨酸的多肽，并用 MALDI-TOF 质谱进行了研究除此之外，人们还发展了带有荧光基团或者生物素标记的分子工具用于相关研究近期，Carlson 等37设计并合成了荧光基团 -ATP 类似物相连的分子(BODIPY-FL-ATP S)由于其能够与组氨酸激酶(HK)的 ATP 结合位点相结合，因此能够被作为一种新型策略用于二组分系统的功能研究或者抑制剂挑选Boon 小组38还设计并合成了

14、ATP- -Biotin-LC-PEO- 胺分子，他们发现该分子能够作为一种生物素标记的激酶底物该分子工具能够用于对包括组氨酸磷酸化激酶或含磷酸化组氨酸蛋白的蛋白质磷酸化研究4.2磷酸化组氨酸类似物。 基于磷酸化组氨酸本身的不稳定性，人们考虑设计合成一些类似物进行模拟方式方法一， Lasker等39的研究表示清楚，含有硫代磷酸化组氨酸(tpHis)的多肽甚至在 pH 为 0 的溶液里 3 h 都保持稳定这正是由于硫原子的电负性与吸电子能力相对于氧原子都要低一些，该类似物的酸性水解稳定性得到提高tpHis(图 3, 4)能够很容易地从组氨酸化学合成得到；利用组氨酸激酶能够直接将ATP S选择性连

15、接到组氨酸残基上40，这一酶法的制备策略早已在其他磷酸化氨基酸的类似物合成中使用过41方式方法二，将易水解的磷酰胺键直接转化为难以分解的C P 共价键也是一种很自然的类似物设计法，而且也被屡次用于其他磷酸化氨基酸类似物的设计中42首先，人们发展了将二唑环改造为其他杂环类似物的策略，例如呋喃环(图 3, 5)21、吡咯环(图 3, 6)43和三唑环44(图 3, 7, 8)；其次，人们还设计磷酸基团本身的类似物以实现将易水解的 P N键替代为 C N 键的目的，例如丙二酸酯衍生物45(图 3, 912)除此之外，Hedberg 等46报道了以 C S共价键进一步替换 C P 共价键得到的类似物(

16、图 3, 13)他们将其用于 Fmoc- 固相合成中，并用合成的多肽作抑制剂对组氨酸去磷酸化酶进行结合蛋白捕获(pull-down)实验十分是，这种磺酰胺类似物的氨基被以为能够模拟磷酸基团水解的过渡态同样利用铜离子催化的 Click 反响，Brimble 等47还发展了一种新型的三唑丙氨酸模拟物(图 3, 14)，并将其用于多肽合成 在各种磷酸化组氨酸类似物不断设计合成的同时，对于含有翻译后修饰蛋白质的化学全合成48-53与半合成54-58技术也在不断发展人们也开场研究怎样制备含有这些类似物的多肽或者蛋白质Webb 小组59首先将化合物8应用在 Fmoc- 固相合成中，通过脱保卫得到自由的磷酸

17、基团除此之外，他们还通过理论计算证明该类似物与磷酸化组氨酸的类似性后来，该小组60又进一步对磷酸基团的保卫基进行了探寻求索与挑选，并优化了此磷酸化组氨酸类似物在Fmoc- 固相合成中的应用条件Piggott小组61也对氨基、羧基和磷酸基团的保卫基进行了系统性的合成与比拟，并将这些类似物的实用性进行了探寻求索发展磷酸化蛋白质的化学全合成是本领域重要研究方向之一 4.3抗体研究 抗体在磷酸化蛋白质的生化研究中是一个必要的研究工具，而且已经发挥了重要的作用62因而，人们也考虑到寻找磷酸化组氨酸的抗体，但均未成功究其原因可能是由于磷酸化组氨酸的不稳定性导致其在血浆里迅速发生水解而无法引发足够强度的免疫

18、应答此后，人们尝试利用无法水解的类似物来诱导抗体的探寻求索，例如含吡咯的类似物，但得到的抗体并不能正确辨别原始的磷酸化组氨酸构造43Marletta 及其合作者63用ATP S作为组氨酸磷酸化激酶的底物，并进一步用 PNBM 处理磷酸化产物构成了半合成的磷酸化组氨酸表位，获得了阶段性的成功但是得到的抗体也存在一定缺陷，即不能区别不同的磷酸化氨基酸(图 4) 值得注意的是，有些针对其他磷酸化氨基酸的抗体由于特异性不强可以以辨别磷酸化组氨酸Frackelton 研究组64发现，抗磷酸化酪氨酸的抗体MA-2G8 具有穿插作用，该抗体不能区分磷酸化组氨酸与磷酸化酪氨酸直到 2018 年，Muir 小组

19、44在研究磷酸化组氨酸类似物的同时研制出了磷酸化组氨酸的抗体蛋白他们用组蛋白 H4 的 18 位组氨酸磷酸化诱导产生了特异性抗体，这一策略对其他磷酸化蛋白质抗体的研制可能同样适用此后，Muir 等65又得到了第一个不具有序列依靠性的磷酸化组氨酸特异性抗体(pan-pHis 抗体)他们利用 -磷酸组氨酸的水解稳定类似物(pTze)作为半抗原诱导产生抗体该抗体已经被成功应用于 ELISA、Western免疫印迹、斑点杂交(Dot blot)测试和免疫沉淀等各类生化实验他们进一步在细胞裂解液中借助MS 检测鉴定出了一系列含有磷酸化组氨酸的蛋白质，并得到一系列相关生物学发现 5主要生理功能 由于含磷酸

20、化组氨酸的蛋白质在生物体中起到了重要的调节作用，人们对其生物学功能做了系统性的研究当前发现的与组氨酸磷酸化相关的蛋白主要包括 4 类66a磷酸化组氨酸作为酶的中间产物介入到磷酸基团向小分子的转运经过，包括核苷二磷酸激酶(NDPK)、ATP- 柠檬酸裂解酶等b能够被组氨酸磷酸激酶磷酸化的蛋白质，例如膜联蛋白、ATP- 柠檬酸水解酶、异质化的三聚化G 蛋白等c具有组氨酸激酶活性的蛋白质，包括二组分信号通路中的组氨酸激酶、NDPK 与组蛋白H4 组氨酸激酶等d磷酸酶，包括磷酸化组氨酸磷酸酶以及各种蛋白磷酸酶组氨酸磷酸化介入到细菌、真菌、植物中的两组分和多组分磷酸转移信号通路原核生物中比拟典型的磷酸化

21、组氨酸系统包括糖磷酸转移酶系统、细菌二组分系统以及一些其他受酶催化的经过，例如二磷酸核苷激酶和辅酶 A 合成酶等22而在高等真核动物信号传导经过中，磷酸化组氨酸对胰岛素分泌经过起到的重要调控作用，下面将重点介绍. 5.1磷酸化组氨酸在原核生物中的生理作用 5.1.1磷酸化丙酮酸 - 糖磷酸转移酶系统(PTS)原核生物中很多体系都牵涉到磷酸化组氨酸，包括新陈代谢、物质转运等67华而不实磷酸化丙酮酸 - 糖磷酸转移酶系统(PTS)介导了糖类以磷酸化的形式穿过细胞膜的经过，而且已经有较为具体的研究22糖的磷酸化包含四个连续的磷酸基团转移步骤，而糖穿过细菌细胞膜的转运经过也与该经过同步发生此经过主要牵

22、涉酶和酶两类磷酸化酶在这一经过中，酶(EI)以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)为底物首先主动磷酸化，然后将磷酸基团转移到含组氨酸的蛋白(HPr)上酶是一类含有多个构造域的酶类或者独立的蛋白质，分为 EA和 EB 等多类华而不实，EA 催化该含组氨酸蛋白上的磷酰基转移到 EB糖类分子被糖特异性 -EB 催化磷酸化，并由膜结合的 EC 介导穿过细胞膜(图 5)值得注意的是，除了 EB 类酶是半胱氨酸侧链巯基磷酸化外，PTS 中其他酶类都是组氨酸残基磷酸化NMR 研究进一步表示清楚， -磷酸组氨酸与 -磷酸组氨酸都存在于本经过中： E1 与 EA 酶所含的组氨酸为 - 磷酸化，而 HPr所含的组氨酸为 -

23、磷酸化这也意味着磷酸基团在两种组分间的互相转化然而，PTS 相关蛋白质磷酸化形式的蛋白质晶体构造还没有报道过68除此之外，Suh 小组69用电脉冲法研究了 E与 HPr 两个磷酸酶之间的磷酸基团转移经过，并在毫秒尺度上揭示了磷酸化反响的动力学特性不仅原核细胞内有磷酸化调控体系，人溶质转运蛋白 SLC37 家族在糖转运经过中也有类似的磷酸化调控机制70该糖 - 磷酸基团交换体系含有A1A4四种固定于内质网膜的蛋白质这些蛋白质通太多步磷酸化经过，最终实现将葡萄糖以葡萄糖 -6- 磷酸的形式转运出膜 5.1.2二组分系统 磷酸化组氨酸在二组分系统中也发挥重要调节作用，而这样的二组分系统本身广泛存在于

24、真细菌、古细菌和真核生物中这些二组分信号传递系统与细胞外 pH、温度、趋化因子、浸透压的变化等刺激因素相耦合，触发细胞功能、生长、分化和运动状态的改变，进而起到感受器的作用68二组分系统中较为保守的组成成分包括组氨酸激酶和一个起到响应作用的调控蛋白以细菌趋化性感受系统为例，组氨酸激酶 CheA 折叠构成三个构造域，即刺激感受域、二聚化功能域与激酶功能域刺激感受域含有两个跨膜组分，用以感受外界刺激；二聚化功能域的功能是构成同源二聚体；激酶功能域能够以 ATP 为底物催化该同源二聚体中两个单体间发生互相磷酸化因而，二聚化功能域是激酶实现功能所必需的值得注意的是，该经过牵涉到的是组氨酸的 -磷酸化7

25、1起响应作用的调控蛋白作为二元体系的另一组分，含有调节域(regulator)与效应域(effector)两部分磷酸基团将从二聚功能域的组氨酸残基上转移到调控蛋白的调节域天冬氨酸残基上，通过蛋白质 - 蛋白质互相作用使效应域发生构象变化，并激活效应域传递信号到下游(图 6)72这类系统的存在使得生物体能够敏锐地感悟外界环境变化 5.2磷酸化组氨酸在哺乳动物中的生理作用 磷酸化组氨酸在哺乳动物细胞中也发挥了多种作用人们在哺乳动物细胞中发现了若干组氨酸激酶，华而不实典型的包括二磷酸腺苷酸激酶(NDPK)、琥珀酰辅酶 A 合成酶(SCS)、组蛋白 H4 组氨酸激酶和人类线粒体二组分组氨酸激酶类等同时

26、，仍有报道新的磷酸化组氨酸相关蛋白，例如 Zhu 等73于 2020 年报道了首个脊椎动物的组氨酸去磷酸化酶 PHP14该 14 ku 的蛋白在肝癌、肺癌细胞的增殖中有重要作用组蛋白上组氨酸去磷酸化酶也对于肝脏的再生与癌变密切相关74磷酸化组氨酸在胰岛细胞中的信号传递相关的作用已经研究得较为清楚已有报道的相关调控作用包括介入 GTP 代谢、介入胰岛细胞内生性的 G 蛋白调控(且该 G 蛋白介入葡萄糖诱导胰岛素分泌经过(GSIS)、调节线粒体代谢酶系、调节如类异戊二烯在内的其他细胞内代谢经过68等 5.2.1独立于线粒体氧化呼吸的 GTP 合成很多工作表示清楚GTP 在小鼠及人胰岛素的生理性分泌

27、经过中起到重要作用75Pintar小组76在小鼠胰岛细胞中进行相关研究，初次证明了GTP 对于胰岛素的分泌是必要的，而且还可能是该经过的限速步骤但是胰岛细胞中二磷酸核糖核苷酸(NDP)向三磷酸核糖核苷酸(NTP)的转化机制尚不清楚，而后者才是该经过中起直接作用的嘌呤核苷酸的存在形式尽管电子转移链理论上能够以 作为受体来实现底物水平磷酸化，但 并不是线粒体核酸转移酶的受体因此 GTP 的构成经过无法与线粒体中的氧化磷酸化经过相耦联另一方面，Srere 等77报道，NDPK 可能具有将线粒体中的反响与胞内反响相耦联的作用，而这些细胞内反响大多是胰岛素分泌所必需的后续研究表示清楚，NDPK 可能对维

28、持 GTP/ 的比例起到关键调节作用，进而进一步调节 G 蛋白功能78这一经过的详细步骤可能是 NDPK 将线粒体产生的 ATP的末端磷酸基团直接转移到胞内的 上，因此对 GTP/ 比例变化起到了 缓冲 作用这种高比例的 GTP/ 对于维持胰岛素分泌可能比GTP 的绝对量更为重要79 5.2.2调节胰岛细胞内部 G 蛋白 在调控 GTP 水平的基础上，磷酸化组氨酸进而能够起到对胰岛细胞中 G 蛋白的调节作用80此作用范围较为广泛，包括三聚化的大 G 蛋白和单体小 G 蛋白通过对 G 蛋白的调节，磷酸化组氨酸相关蛋白能够进而实现对胰岛素分泌的调节81 a对小 G 蛋白功能的调节诸多研究表示清楚，

29、nm23-H 家族基因所表示出的NDPK/NM23 家族蛋白对小 G 蛋白及其相关信号通路有重要调控作用，而 NDPK 本身即遭到组氨酸磷酸化的调控Gallagher 及其合作者82以 NIH-3T3细胞株为研究对象，发现华而不实 NDPK 对 Rac 蛋白相关的皮层活动经过以及GTP依靠的胞内囊泡运输经过都起到调节作用该研究还表示清楚，这些效应并不是由囊泡定位的 NDP 激酶的作用所导致的研究显示，在 GTP 酶突变的条件下，高浓度的GTP会使这些小 G 蛋白保持与 GTP 的结合作用而持续激活Fischbach 等83则报道了 NDPK 使得原癌基因 Ras 蛋白失活的作用这意味着 NDP

30、K 具有类似 GTP 酶的性质另一方面，NM23 家族蛋白激酶对细胞的调控作用早在 1999 年就为 Kahn小组84所报道该小组85首先报道了一个 35 ku 的蛋白质并命名为 Rad(Ras 相关糖尿病蛋白)接下来，他们系统性地研究了 NM23 蛋白与 Rad 的作用研究发现，NM23 既能促进 Rad 与 GTP 结合，也能促进Rad-GTP 向 Rad- 的转化他们揭示了这种双向双分子调节机制由于 Rad 对葡萄糖摄取具有调控作用86，NM23 也因而与某些种类的糖尿病相关综合以上结果，nm23/NDPK 的信号传递作用对调节小 G 蛋白起着重要的作用 b对三聚化 G 蛋白功能的调控

31、除了对单聚的小G 蛋白的作用外，磷酸化组氨酸对三聚体的 G 蛋白也有间接的调节作用Piacentini等87早在 1996 年就报道了磷酸基团的转移在大 G 蛋白激活经过中起到的作用；后来，Hippe等88提出了假想的 NDPK B 与 G 亚基的复合体 3D 构造同时，他们提出了 NDPK/NM23 类酶对三聚化G 蛋白的激活存在的两种可能机制第一种，NDPK 利用 ATP 将 G 蛋白附近的 三磷酸化得到 GTP，GTP 转移到 G 亚基上完成GTP/ 转换第二种机制则明显不同，在胞内ATP 存在下， NDPK/NM23 将 G 蛋白亚基上的 转磷酸化构成 GTP相比而言，第一种理论得到的

32、认可度较高除此之外，Wieland 等89的早期研究表示清楚，HL-60 细胞中 G 蛋白的 亚基存在一个依靠GTP 的磷酸化经过，后续研究证明对 G 蛋白功能起关键作用的正是这一 G 蛋白 亚基的组氨酸磷酸化在这里基础上，Klinker 等90对 NDPK 在对视网膜 G 蛋白这一转导蛋白的激活经过所发挥的作用进行了进一步研究，而这一经过也就是通过组氨酸磷酸化实现的他们在可溶的转导蛋白提取液中检测到明显的 NDPK 活性，这一活性物质被以为是转导蛋白 -NDPK 复合体这一转导蛋白 -NDPK 复合体表现出对 作为磷酸基团受体的偏好性基于以上现象，他们以为水溶液制备的转导蛋白中含有对于 敏感

33、的 NDPK同时，转导蛋白的 亚基在促进三聚化 G 蛋白的激活经过中起到了作为磷酸化的 NDPK 中间体的作用Cuello 等91报道了一个最为直接的证据：三聚化 G蛋白的激活是通过一个高能磷酸基团从 NDPK 的磷酸化组氨酸转移到三聚化 G 蛋白 亚基而实现的Hippe 等92在 H10 细胞中也有类似发现，他们的研究证明了 NDPK 与 G 蛋白 复合物之间的互相联络综合这些研究结果可知，NDPK 对三聚化G 蛋白确实存在激活作用基于这些发现，研究者们88还最终提出了依靠受体的三聚化 G 蛋白激活机制 5.2.3其他调节机制 除了以上几种重要的调节机制外，磷酸化组氨酸对真核生物其他的一些代

34、谢经过也有重要调节作用 a磷酸化组氨酸对线粒体一些中间代谢经过酶系的激活起到调控作用，包括ATP- 柠檬酸水解酶(ACL)、琥珀酰辅酶 A 合成酶(SCS)等ACL 承当着为神经组织合成乙酰胆碱提供乙酰CoA 的任务Fan 小组93利用多种生化手段具体地研究了人ACL的活性位点(例如 760 位组蛋白)、催化机制及动力学特点ACL 是人蛋白质组氨酸去磷酸化酶(PHP)的一个已经知道底物，故而 PHP 对神经系统的调节一直被广泛关注94同时，PHP 能够被血管壁等组织细胞所表示出产生，Krieglstein 及其合作者95研究了PHP 的过表示出或下调对血管内皮细胞的存活情况的影响除此之外，SC

35、S 也是该领域的研究重点之一包括 Steeg 等96与 Shulman 等97的一系列重要研究证明，SCS 和线粒体 NDPK(mNDPK)98与胰岛素分泌细胞存在潜在联络这些研究都显示了线粒体中磷酸化组氨酸对胰岛素分泌经过可能起到的重要调控作用近期研究表示清楚，心脏细胞线粒体中也同样存在基质和氧化呼吸蛋白复合体的磷酸化调控99 b磷酸化组氨酸对离子通道也有相应的调控作用Srivastava 等100于 2006 年首先报道 NDPK对钙离子激活的钾离子通道 KCa3.1 的调控作用他们发现 KCa3.1 与 NDPK-B 结合后能使其本身的组氨酸残基磷酸化，进而激活该钾离子通道这一作用在多种

36、细胞中都能调控钙离子内流该研究同时发现了 T 细胞活化所必需的一个新的通路，对本领域发展有奠基性作用 c磷酸化组氨酸对类异戊二烯代谢的调控作用研究表示清楚大部分小 G 蛋白和三聚化 G 蛋白的亚基都会在其 C 端半胱氨酸侧链上进行翻译后修饰，这一修饰基团对于其与对应的效应蛋白或者磷脂膜对应位点的互相作用是必需的101研究人员利用基因手段或者位点特异性的蛋白法尼基化(Farnesylation)和香叶基化(Geranylation)抑制剂，证明类异戊二烯衍生的蛋白质修饰形式对 GSIS 是至关重要的这些发现也在 INS 832/13 细胞中通过分子生物学及生物化学手段得以证实102。 6结论与瞻

37、望 在经历了一系列的探寻求索后，人们对磷酸化这一蛋白质调控机制有了愈加深切进入的认识磷酸化组氨酸是三种含有 N P 共价键的磷酸化氨基酸之一作为一种较为特殊的磷酸化形式，它对于人们认识蛋白质的磷酸化调节机制有促进作用由于该磷酸化形式不同于其他磷酸化氨基酸的化学性质，人们需要针对含有磷酸化组氨酸的蛋白质发展全新的制备、分离与表征策略103本文综述了相关化学技术的发展和当前对于磷酸化组氨酸生物功能的研究情况当前，由于磷酸化组氨酸具有化学不稳定性，因此制备含有天然构造磷酸化组氨酸的蛋白质是当下一个重要的科学问题为了解决这一问题，人们发展了各种类似物作为磷酸化组氨酸的替代品因而，怎样将磷酸化组氨酸及其

38、类似物引入待研究的蛋白质中就成为了当下工作的挑战当前，可用来解决该难题的策略主要包括蛋白质化学合成及非天然氨基酸定点嵌入两种途径迄今为止，人们利用Fmoc- 固相合成法已得到了若干含有磷酸化组氨酸类似物的多肽，而相应全长蛋白或完好构造域的全合成工作还未有报道，这可能是今后研究的重点之一另外，非天然氨基酸定点嵌入的策略也是获得含有非天然氨基酸蛋白质的重要技术104-105该技术最近已有较为迅速的发展，成功地将一系列非天然氨基酸定点引入了目的蛋白，并进一步完成了对其功能的研究55, 106-111因而，能否利用此技术将磷酸化组氨酸类似物定点引入目的蛋白也将成为下一步研究的重点其次，调控磷酸化组氨酸

39、相关代谢通路的发现与机理研究也是磷酸化组氨酸生物学功能研究的重点之一将新发展的抗体作为分子生物学工具70可能发现更多的新组分与新机制 参 考 文 献 1 Levene P A, Alsberg C L. The cleavage products of vitellin. J BiolChem, 1906, 2(1): 127-133 2 Lipmann F A, Levene P A. Serinephosphoric acid obtained onhydrolysis of vitellinic acid. J Biol Chem, 1932, 98(1): 109-114 3 Paws

40、on T. Specificity in signal transduction: from phosphotyrosine-SH2 domain interactions to complex cellular systems. Cell, 2004,116(2): 191-203 4 Matthews H R. Protein kinases and phosphatases that act onhistidine, lysine, or arginine residues in eukaryotic proteins-apossible regulator of the mitogen-activated protein kinase cascade.Pharmacology Therapeutics, 1995, 67(3): 323-350