RNA干扰转基因植物的研发现状,生物技术论文.docx

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1、RNA干扰转基因植物的研发现在状况,生物技术论文PTGS途径经常由转基因或病毒入侵引起，称为外源RNA沉默途径，分为倒置重复途径(IR-PTGS)和正义途径(S-PTGS)。IR-PTGS途径首先构成IR转录产物dsRNA,DCL4将dsRNA加工成21 nt的siRNA，经3 端甲基化转移酶HEN1甲基化修饰15，装载到AGO蛋白构成RISC，在引导链RNA的引导下对同源mRNA进行切割降解。而S-PTGS途径主要负责异常RNA的降解。异常RNA分子通常缺少3 端polyA尾巴或5 端帽子，它们被以为是来源于高丰度的转基因正义/反义RNA、病毒RNA、截短型转录本以及复杂的基因插入、基因重复

2、区域等。 TGS途径与PTGS途径具有共同的作用底物，并且都是通过靶向同源mRNA导致DNA甲基化，最终阻碍DNA转录。RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation,RdDM)实际上是第一个发现的由sRNA控制的表观遗传机制。RdDM最初是在烟草植物中发现的，在存在病毒自主以RNA为模板进行RNA复制的情况下，其RNA被反转录成cDNA，并整合到基因组中的类病毒cDNA被特异性甲基化16。研究表示清楚，与启动子区域互补的dsRNA能够诱导启动子甲基化和转录沉默17。RdDM由不同类型的序列诱导，有不同的靶标，常利用2种类型的dsRNA作为甲基化诱导物:具有

3、反向重复序列的转基因发夹构造和dsRNA病毒18。RdDM不仅仅是控制重复序列和病毒入侵的响应机制，也是调控基因表示出的调节网络的一部分。 除了siRNA所引起的RNA沉默现象，miRNA介导AGO1进行的靶基因切割也是一种重要的功能基因沉默形式，这在AGO1突变体互补实验中得到了证明。类似于其他真核生物，在miRNA的引导下，AGO1从mRNA碱基配对序列的中间进行切割19，使被切割的mRNA暴露1个游离的5 端片段和1个3 羟基，再从3 端片段引发裂解，切割片段由末端尿苷酸转移酶HESO1在3 端对其进行尿酰化，最终降解。 植物的miRNA-靶基因互相作用并不总是导致AGO切割，也有可能导

4、致翻译抑制。当前对植物miRNA介导的翻译抑制的分子机制的研究程度不如动物，但是二者存在类似之处。除2种常见的转录后调控形式外，植物miRNA可以以进入到RdDM机制中。在这种情况下，miRNA前体将由DCL 3处理产生较长的片段(24 nt)，并被装载到AGO4/6/9系统以引导DNA序列发生甲基化修饰，进而在转录水平调控基因表示出20。当前已在水稻中发现了这类miRNA的详细实例，华而不实有一类miRNAs由DCL3处理，装载到AGO4上引导DNA甲基化21。 2 RNAi转基因植物的研发现在状况 RNAi技术应用于植物育种多采用外源导入T-DNA的方式，将正义RNA、反义RNA或者倒置重

5、复的靶基因序列放置于选定的启动子下构成dsRNA，并进一步加工成siRNA进入RNAi途径以调控植物发育，进而到达育种目的。除此之外，也有人工miRNA的途径和利用Rd DM的途径，后者能够对靶基因的启动子进行表观遗传修饰进而调控靶基因表示出以改变植物农艺性状。本文从转基因设计、sRNA递送方式、RNAi转基因植物的研究实例3个角度来阐述RNAi转基因植物的研发现在状况。 2.1 RNAi转基因设计 2.1.1 正义或反义RNA 通过共表示出mRNA靶标的正义和反义转录本，引入用于植物沉默的转基因dsRNA。该方式方法依靠于由2个独立转录的互补RNA杂交获得的用于RNA沉默的dsRNA。尽管与

6、单独使用反义转录物相比，该方式方法的效率并未显著提高，且远小于使用IR的方式方法22。但是，正义和反义转录本能够在相反的启动子之间进行聚合转录，这种设计缩短了所需的T-DNA的长度，并避免重复使用序列。通过锥虫和果蝇的转基因实验证实了存在通过聚合转录的RNAi介导的基因抑制23。 2.1.2 内含子嵌入的倒置重复序列 有时为了获得理想的表型，将内含子整合进反向重复区域作为一个保守的调控元件来保证基因时空特异性的表示出和抑制。最常用的RNA沉默转基因构造是包含1个由间隔序列分隔的倒置重复IR序列。经过转录IR序列构成dsRNA并被加工成为成熟siRNA以有效地沉默靶基因。间隔序列能够是与靶标无关

7、的任何序列，使用内含子衍生的可插入间隔能够增加沉默效率24。除了植物，基因内含子衍生的人工短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)也能在哺乳动物细胞中诱导基因沉默25。有时在育种中追求愈加理想的表型性状，会在表示出一个基因的同时抑制另一个基因的表示出。在高赖氨酸表型的基因工程玉米中，表示出赖氨酸反应不敏感的生物合成酶CordapA而抑制内源赖氨酸酮戊二酸复原酶/酵母氨酸脱氢酶(lysine ketoglutarate reductase/yeastine dehydrogenase,LKR/SDH)累积能够最大程度地提高成熟籽粒中游离赖氨酸的积累，进而获得高赖氨酸含量的玉

8、米品种26，在这个高赖氨酸含量的玉米中，抑制内源基因的设计则是采用插入内含子的倒置重复序列。 2.1.3 人工miRNA 内源性miRNA序列能够被设计成人工miRNA(artificial miRNA,AmiRNA)。AmiRNA初次被报道是在人的细胞系中，内源性miRNA前体经修饰产生AmiRNA，进而选择性抑制互补靶序列27。在哺乳动物细胞中，尽管RNAi已经被证明是有效的，但dsRNA用于RNA沉默的途径是有限的。除少数胚胎细胞培养系统外，dsRNA还可诱导翻译抑制28。因而，由动物miRNA前体产生的shRNAs常被用于沉默动物系统中的内源性基因29。现有的研究已经给出使sRNA有效

9、的发挥RNA沉默作用的途径和原则:在动物miRNAs中，来自5 端的第28位(种子区)的核苷酸位置可能是靶特异性的最重要的决定因素30;sRNA双链中更倾向于将5 端处于不稳定状态的链装载到RISC31;GC含量在30%50%为佳32;具有5-尿苷的sRNA可优先装载到AGO133。同样地，miRNAs也能抑制报告基因和内源性基因在植物中的表示出34。有学者基于以上原则，开发了一个用于设计miRNAs的平台，称为Web microRNA设计器(WMD)35。这个工具考虑到植物基因组序列信息，允许自动优化sRNA特性，以便有效地沉默靶基因，同时保持miRNAs在30多种植物中的靶向特异性。不像动

10、物AmiRNA那样需要与靶基因完美配对，在设计植物AmiRNA时，需要考虑参加错配以避免产生siRNA沉默的移动性。已有研究表示清楚可利用单个反向重复转基因敲除多个基因36，同样地，将多个AmiRNA前体组合成转基因能够沉默多个靶基因。 2.1.4 Rd DM途径 农杆菌对瞬时表示出基因的浸透、转基因砧木嫁接、反向育种和RdDM被归类为新植物育种技术(new plant breeding techniques,NPBTs)37。华而不实，RdDM方式方法能够在不改变基因组序列的情况下，通过转录基因沉默或启动子甲基化来修饰基因表示出。甲基化能够由dsRNA诱导，该dsRNA需经Rd DM介导的各

11、种宿主酶处理，包括聚合酶和、AGO蛋白和胞嘧啶甲基转移酶38;同时，siRNAs可以在靶DNA区诱导特定胞嘧啶残基(CG、CHG和CHH，华而不实H为A、C或T)的甲基化，导致TGS39，这种改变能够稳定遗传数代。目的基因的TGS可以以通过人工导入与其启动子区域相对应的dsRNA来获得，这些表观遗传变化均可遗传。还有少数研究报道了由RdDM介导的内源基因的转录沉默，如在CaMV35S启动子控制下的绿色荧光蛋白(gteen fluorescent protein,GFP)基因40或水稻中的葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase,GUS)基因。除此之外，为了诱导水稻(Oryza sativa

12、L)内源基因的TGS,Wakasa等41表示出了不同启动子区域的dsRNA，进而诱导了RdDM，将来自谷蛋白多基因家族的GluB4基因作为靶标，与PTGS相比，TGS对靶标基因表现出特异性抑制。 2.2 sRNA递送方式 siRNA或dsRNA怎样有效进入植物受体并针对靶基因发挥作用对于育种和基因功能研究特别关键。已经报道的技术手段是将合成的dsRNAs或siRNAs直接外源应用于植物外表，如直接喷雾、机械接种、高压喷涂以及采用促进RNA粘附的材料;可以采用间接方式，如纳米载入、蛋白质载体、病毒载入、T-DNA插入基因组等42,43,44。 当前采用最多的方式是构建转基因载体，如采用T-DNA

13、插入、基因枪轰击将外源片段整合到植物基因组。已有研究报道了在拟南芥、矮牵牛花、番茄、马铃薯和烟草中均可利用T-DNA表示出相应启动子区域的dsRNA进而诱导内源性基因的TGS45,46,47。 对于植物辨别和吸收细胞外核酸的机制的研究是近年来才开场的。孟山都公司(现已并购入拜耳)的研究人员通过喷洒多核苷酸分子来改造转基因植物48，研究表示清楚，dsRNAs、siRNAs甚至单链DNA都能有效地促进植物的局部和系统沉默。与之类似的方式方法包括通过转入细菌表示出dsRNAs的提取物49或含有载体肽的合成dsRNAs提取物50来沉默靶基因。除了dsRNAs,siRNAs也被采用纳秒脉冲激光诱导递送到

14、细胞中51或与聚合物纳米粒子结合产生原生质体52以进行诱导培养。除孟山都公司在植物上直接应用siRNAs实现局部和全身性沉默外，Numata等53的研究表示清楚，在含有蛋白质载体的复合物中喷洒合成的siRNAs可能会导致局部花青素的丧失，这可能是查尔酮合成酶基因沉默所致。将合成的GFP-siRNA溶液，在高压下通过常规压缩机和气刷手枪喷涂在GFP转基因烟草外表，能够沉默GFP基因的表示出，使转基因烟草无荧光;在不施加高压的情况下，未观察到这种效果54。Numata等53将在体外合成的黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)-siRNA与载体肽复合物浸透到杨树

15、的叶片中，利用共聚焦激光扫描显微镜观察，结果发现YFP蛋白水平和荧光程度均降低。更简单的操作是利用软毛刷导入外源dsRNA，能够抑制转基因拟南芥中的新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,NPT)和GFP的转录水平44。上述研究表示清楚，直接外源应用dsRNA、siRNA能够便捷高效地引起局部或系统沉默，并且可检测沉默效果。但是外源应用dsRNA、siRNA存在吸收率低的现象，揣测生物损伤是植物RNA摄取的关键54。相比之下，利用T-DNA插入、基因枪轰击或病毒载入的方式更能引发稳定高效的RNA沉默效应，并且能够稳定遗传。 2.3 RNAi转基因植物的研究实例

16、 当前，RNAi已广泛应用于植物育种领域，并已经研发出多种具有优良性状的作物，主要分为2大类:赋予植物抗性和调控植物代谢。华而不实，赋予植物抗性分为:抗虫、抗病毒、抗真菌、抗线虫、抗寄生性杂草等;调控植物代谢分为:产量性状改进、营养改进、消除过敏原等。在已有的RNAi技术中，抗虫作物的靶标包括西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera)、南部玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardii)、科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)等55;抗真菌的

17、靶标有致病疫霉(Phytophthora infestans)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense)和镰刀菌属(Fusarium sp.)56,57;抗线虫的靶标为孢囊线虫、根结线虫、根腐线虫58,59,60。除此之外，抗病毒的作物有甜菜坏死黄脉病毒抗性烟草、马铃薯Y病毒抗性马铃薯、番茄黄化曲叶病毒抗性番茄、水稻东格鲁病毒抗性水稻、柑桔衰退病毒抗性墨西哥酸橙、马铃薯纺锤块茎类病毒抗性番茄61;寄生杂草抗性的作物有抗独脚金杂草的转基因玉米62。产量性状改进的成功案例包括纤维品质优良的早熟丰产旱地品种棉花、种子含油量增加的拟南芥和麻风树、木质素含量降低的玉米

18、63,64。营养改进的研究牵涉同时增加类胡萝卜素和类黄酮含量的番茄、 -亚麻酸含量降低的大豆、 -胡萝卜素含量增加的柑桔、赖氨酸含量提高的玉米、油酸含量增加的花生、颜色改变的文心兰65,66,67;消除过敏原的实例主要是沉默苹果中的Mald1、花生中的ARAH2、木质素中的P450、洋葱中的LFS、咖啡中的CaMXMT、烟草中的CYP82E4、番茄中的LeETR4和ACC、花生中的Arah2以及 无泪 洋葱中的黑麦因子合成酶基因68。除此之外，还有应用于医药的实例 利用RNAi技术生产抗乙肝病毒的生菜69。 国内外RNAi植物的研究已经获得长足发展，当前已经获得商业化批准、可用作食用或者加工原

19、料的RNAi转基因植物的信息如表1所示。 表1 商业化应用的RNAi转基因植物 数据来源:欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA);美国农业部(United States Department of Agriculture,USDA);国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA)。 3 瞻望 RNAi技术作为2001年的十大科学成就之一，Science杂志在2002年又将其列为十大科学成就之首。同年，Natu

20、re杂志也将sRNA评选为重大科技成果之一。将RNAi技术应用于植物改进通常旨在减少害虫数量、提高产量、改进品质、降低种植成本、减少化学农药造成的环境污染，以期助力于实现农业的可持续发展。与基因编辑技术相比，RNAi技术也具有本身的不可替代性，RNA技术能够克制物种的基因冗余和多倍性，允许一个基因家族的单个或多个成员或同源基因拷贝的沉默，如小麦和香蕉70,71;RNAi抗虫作物的优点之一是几乎能够靶向任何基因，但是常规的转基因作物可能并没有商业化的杀虫蛋白可用;RNA技术还能够提供广谱抗性。随着测序和生物信息学的发展，RNAi技术不仅能够利用转录后水平调控基因表示出，可以以利用RdDM对基因组

21、进行表观遗传修饰，给植物功能和育种研究带来了更多项选择择。而RNAi技术与合成生物学相结合能够更好地控制植物特定生长途径的代谢经过，能够到达精准改进育种的目的。值得注意的是，固然RNAi技术在生物安全性方面的研究已经获得了一定的进展72，但相关机制尚未明确，RNAi技术在作物改进中的应用潜力有待于进一步挖掘。 以下为参考文献 1 LIU W,YUAN J S,STEWART J C N. Advanced genetic tools for plant biotechnologyJ. Nat. Rev. Genet.,2020,14(11):781-793. 2 KETTING R F. Th

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