生物正交氧化还原体系的构建及意义,生物化学论文.docx

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1、生物正交氧化还原体系的构建及意义,生物化学论文细胞内代谢经过除以碳骨架构造改变为主的物质转化外， 通常还伴随辅因子介导的能量转移。 物质转化和能量转移高度耦合， 显着增加了代谢系统的复杂度。 氧化复原辅因子通过在氧化态和复原态之间循环再生传递电子， 将物质转化途径关联成复杂的代谢网络1. 据不完全统计， 在微生物中仅吡啶核苷 酸 辅 酶 nicotinamide adenine dinucleotidephosphate， NADP及其复原态介入的生化反响就超过 1000 种2, 这还不包括它们介入的其他生物学经过。 传统生物化学研究提供了大量生物学元件3,4,系统生物学研究建立了各种代谢模型

2、5,6, 分子生物学发展提供了有效的遗传操作方式方法， 使设计和构建新的高效、受控的物质转化途径成为可能。 然而， 辅因子在代谢网络中的节点作用使各种生化反响建立起复杂的互相作用网络， 极大地影响了外源途径在底盘细胞代谢环境中的功能。 以氧化复原代谢为例，新途径可能毁坏宿主内源氧化复原平衡， 进而抑制生长， 使新途径难以产生预期效果7. 人工构建的外源途径对底盘细胞中天然代谢网络的互相干扰， 十分是氧化复原环境的干扰， 是影响外源合成途径与底盘细胞适配性的重要因素。 通过调节胞内辅因子水平， 如控制酶的表示出水平、优化代谢途径、改造酶的辅因子偏好性以及敲除竞争代谢途径等， 能够优化外源途径与底

3、盘细胞的适配性， 在一定程度上提高代谢调控效率810. 但辅因子扰动的生物学效应的可控性和可预见性低。 例如， 琥珀酸生产需要维持胞内较高 NADH 水平， 但高 NADH 水平影响菌株对培养条件的适应性11. 设计脂肪酸生产菌株时需要使脂肪酸合成途径与宿主 NADPH 供应能力相匹配， 但由于无法确定扰动 NADPH 水平对代谢造成的全局性影响， 无法预测适宜的外源基因表示出强度， 需要挑选不同表示出强度的启动子表示出外源基因12. 辅因子关联作用导致的复杂性也是限制代谢途径可移植性的重要因素。 例如， 在大肠杆菌Escherichia coli中构 建 的 高 效 丁 醇 合 成 途 径

4、, 移 植 到 蓝 细 菌Cyanobacteria中就难以到达积累丁醇的效果， 由于蓝细菌倾向于积累 NADPH 而非 NADH13,14. 因而， 提高人工代谢途径在底盘细胞中的适配性、可预见性和可移植性需要降低代谢系统， 十分是辅因子依靠型氧化复原系统的复杂度。 1 正交氧化复原体系 为降低代谢系统复杂度， 可设计独立于生长代谢的合成途径及独立的辅因子循环再生体系。 这种在复杂代谢体系中执行系统子功能， 并且其执行经过独立于系统其他组件的子系统称为正交体系。 正交体系的设计构建经过即 正交化 15. 正交氧化复原体系是指电子传递独立于系统其他氧化复原辅因子系统的一种氧化复原体系。 当前主

5、要有两种策略可用于构建正交氧化复原体系： 在空间上分隔辅因子依靠型体系， 即 空间正交氧化复原体系 构建利用人工辅因子代替天然辅因子的体系， 即 生物正交氧化复原体系 8,15. 设计构建正交氧化复原体系， 是减少外源途径对底盘细胞中天然代谢网络的干扰， 提高外源合成途径与底盘细胞适配性的重要策略。 下面综述正交氧化复原体系的设计和应用特点。 2 空间正交氧化复原体系 空间正交氧化复原体系通过将相关的酶及辅因子限定在特定区域， 提高局部底物和辅因子浓度、减少或避免与其他子系统的互相作用16,17, 当前主要通过构建融合蛋白和设计蛋白锚定支架实现， 并已有多个成功应用的报道。 另外， 近期发现，

6、 细胞内可构成一些特殊的微区室microcompartment， 能够有效限制辅因子或代谢中间体扩散， 进而避免胞内辅因子水平干扰微区室内氧化复原代谢18,19. 利用微区室可以构建空间正交氧化复原体系15. 蛋白融合技术通过基因工程手段将多个酶用短肽序列连接构成融合蛋白， 通过调整连接肽特性和酶的连接方向控制酶的空间定位图 1A， 优化级联催化经过中底物和能量传递20. 蛋白锚定支架技术通过调整支架上的锚定位点距离、各种锚定位点的数量和连接肽特性 3 种方式调整酶的空间定位和比例图 1B， 可降低代谢网络对目的途径的影响， 提高目的途径底物和辅因子的局部浓度， 减少与环境的互相影响21. 两

7、种空间正交氧化复原体系构建策略都遭到连接肽特性的影响， 由于连接肽及蛋白构造和功能的多样性， 需要通过挑选确定适宜的连接肽柔性和长度， 优化酶的空间定位2,22. 连接肽通常使用柔性序列 GGGGSG4S2326, 通过调整其拷贝数改变连接肽长度， 但有时利用刚性氨基酸延长连接肽效果更好， 如将恶臭假单胞菌Pseudomonas putida细胞色素 P450P450cam、假单胞氧还蛋白putidaredoxin,P d X 和假单胞氧还蛋白复原酶 p u t i d a r e d o x i nreductase, PdR分别与硫磺矿硫化叶菌Sulfolobussolfataricus的

8、增殖细胞核抗原proliferating cellnuclear antigen, PCNA融合时， 比拟两组连接肽G4S-P5n-G4Sn=15和G4Snn=16效果， 以 G4S-P54-G4S 连接时活性最高6.5 0.3 mol/L min， 而G4Snn=16最高活性G4S5约为 5 mol/L min22.相比于柔性， 调节连接肽长度效果通常更显着， 上述实例中最适连接肽长度对应活性比 n=1 时提高两倍。 长度选择也是最常见的连接肽优化方式。 在 P450 单加氧酶CinA的C-末端融合黄素氧还蛋白CinC, 催化桉树醇转化为 2-羟基-桉树醇， 发现当连接肽长度为10 个氨基酸

9、时产量最高， 少于 4 个氨基酸时检测不到催化活性2. 除了连接肽特性， 空间正交氧化复原体系构建还需要综合优化多种因素以在提高体系独立性的同时获得更好的催化活性。 构建融合蛋白要考虑融合方 向 对 催 化 效 率 的 影 响 . 将 丙 酮 丁 醇 梭 菌Clostridium acetobutylicum来源的氢酶hydrogenase,H2ase融合铁氧还蛋白ferredoxin, FD促进产氢时，用 2 个氨基酸残基连接时， FD 连在 H2ase 的 C-末端对产氢经过无促进作用， 而连在 N-末端氢气产量提高约 3 倍26. 这是由于 H2ase 与 FD 作用位点在氢酶N-末端，

10、 N-末端融合更利于两个蛋白互相作用。 这种融合蛋白组合的催化效率也受连接肽长度的影响，以14个氨基酸残基连接效果最好， 产氢效率提高近5倍， 延长至 46 个氨基酸残基几乎没有促进作用26. 与蛋白融合技术相比蛋白锚定支架技术可更自若地设计酶的空间分布和计量关系27,28. 仍以上述H2ase 与 FD 生物转化产氢途径为例： 将真核信号转导相关的 PDZpostsynaptic density protein of 95kilodaltons, disc large, zona occludens-1， SH3sarcoma homology 3和 GBDgelatin binding d

11、omain3 种构造域整合到支架蛋白上， 通过配体肽段将催化生物合成的酶特异性结合到支架蛋白的对应位置，这种设计能够通过调整 H2ase 和 FD 在支架上的结合位置、酶与支架配体间连接肽的长度、结合域数量等调整酶的空间分布与比例26. 结合域在支架上间距靠近时产氢效率高； 结合域相对位置一样， FD 与支架蛋配体白的连接肽长度分别为 10, 20, 40 个氨基酸时， 延长肽链长度可使氢气产量提高 35 倍； 通过调整支架蛋白上的 PDZ, SH3 和 GBD 结合域比例调整FD:H2ase 比率， 比率越小产氢效率越高26. 除了蛋白， DNA, RNA 等大分子可以作为蛋白锚定支架20,

12、29,30, 并且随着 DNA 合成技术发展及对DNA, RNA 构造预测能力的提高， 基于核酸的支架遭到更多重视。 利用 DNA 整合 NADPH: 黄素单核苷酸flavin mononucleotide, FMN氧化复原酶和荧光素酶， 复原力 NADH 经过 NADPH:FMN 氧化复原酶传递给 FMN, 然后传递给荧光素酶， 与分别连在两条不同 DNA 链上的游离状态相比， 连在同一 DNA链上时活性提高到 23 倍31. 支架能够是单个分子，可以以是可自组装的蛋白亚基。 如将前述 P450cam,PdX, PdR 和亚磷酸脱氢酶分别与 PCNA 融合时， 构建融合蛋白 PCNA-PdR, PCNA-P450cam 和 PTDH-PCNA-PdX, 3 个融合蛋白的 PCNA 亚基通过自组装构成三聚体将 4 个酶进行空间整合， 促进反响中的电子传递， 组装复合体比游离酶催化速率提高 2 倍22,32. 以上空间正交氧化复原体系的应用表示清楚， 通过减少天然氧化复原体系的干扰， 能够有效提高目的氧化复原体系的效率和可预见性。