细胞外囊泡对卵母细胞发育的影响分析,发育生物学论文.docx

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1、细胞外囊泡对卵母细胞发育的影响分析,发育生物学论文摘 要： 为了探究外泌体在卵泡中调控卵母细胞生长发育以及后续受精中的调控作用及机制，首先总结了外泌体的组成和功能，在这里基础上选择重点阐述外泌体在卵泡中怎样调控卵母细胞与卵泡体细胞的互作机制，然后进一步分析了外泌体介导精卵结合的调控机制，进而得出了外泌体在卵泡中通过华而不实包含的蛋白和RNA等物质调控卵母细胞生长发育的结论，建议在研究卵母细胞生长发育调控的研究方面应该重视对于外泌体的研究。最后指出了外泌体研究中存在的问题。 本文关键词语： 外泌体; 卵母细胞; 卵泡; 外囊泡; 卵丘细胞; Abstract： The objectives ar

2、e to explore exosomes (EXs) regulating oocyte development in the ovarian follicle, and the regulation and mechanism in the subsequent fertilization. Firstly, the composition and function of EXs were reviewed. On this basis, we discussed how EXs regulated the interaction mechanism of oocytes and foll

3、icle somatic cells in follicles. And then, we further analyzed the regulation mechanism of EXs mediating sperm-egg binding. Thus, the conclusion was obtained, indicating that EXs regulated the oocyte growth and development through the protein and RNA contained in the follicles, and the research on t

4、he regulation of oocyte growth and development should be focused on the study of EXs. In the end, we pointed out problems in EXs research. Keyword： exosomes; oocyte; ovarian follicle; extracellular vesicles; cumulus cells; 0、 引言 细胞间通信是多细胞生物体的必要标志，并且能够通过直接细胞-细胞接触或分泌的分子的转移来介导。在近期二十年中，出现了牵涉细胞外囊泡 (Extra

5、cellular Vesicles, EVs) 的细胞间转移的第三种细胞间通讯机制，由细胞释放的各种具有膜构造的囊泡构造统称，这些囊泡的直径能够从3040 nm到89 m1,2。是尽管凋亡小体在细胞凋亡经过中的释放早已为人所知3，但是完全健康的细胞也从其质膜上脱落囊泡的事实近期才被认识。华而不实外泌体 (Exosomes, EXs) 的大小比拟统一，一般在30100 nm之间，一般以为，EXs通过与质膜融合的方式外排出去，与一般的细胞外囊泡不同。近来研究发现，在马4和不同年龄的人5卵泡液中，存在这种EXs，如多囊卵巢综合症的病人的卵泡液中就存在2；后来在奶牛的某些阶段的卵泡液中也存在1。EXs

6、在细胞与细胞之间的联络方面有着非常重要的作用，这种细胞之间的联络一般以细胞外表表示出的配体直接链接或通过转运生物分子的方式进行。EXs内部包含有蛋白、便于辨别靶细胞的细胞辨别分子6。它们是编码和非编码RNA的天然运输者7，而且这种运输能够通过血液循环系统长距离作用于靶细胞，并且调控靶细胞的转录和翻译经过4,7,8。这些研究同样也讲明，其EXs包含独特的方式来转运蛋白或者具有基因调控功能的RNA (mRNA和miRNA) 。细胞外囊泡在临床医学中也有特别光明的应用前景，主要是由于它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反响，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因而它们还有发

7、展成临床药物递送载体的潜力9,10,11。 下面就EXs在卵泡中调控卵母细胞发育的研究进展予以综述，分别从EXs组成及功能、介导体细胞与卵母细胞作用和调控卵母细胞受精等方面予以阐述，期望对于该领域的研究有一定的意义。 1、 EXs组成及功能简介 已有研究发现miRNAs不仅存在与细胞中，而且在不同的流体介质中也大量存在如血浆、血清、尿液、唾液、牛奶和精液中，这些存在的miRNAs一般称之为细胞外miRNAs或循环miRNAs12,13。而且有研究发现，这些细胞外miRNAs在核糖核酸酶活性很高的血浆中大量并且稳定的存在12，由此揣测可能这些miRNA存在能够躲避这些外在环境影响的某种保卫装置。

8、进一步的研究发现，这些保卫装置就是前面提到的不同的流体介质中存在的EXs14。EVs通常是细胞持续分泌或在某一刺激条件下产生的几种不同的囊泡构造，能够分为外泌体 (Exosomes, EXs) 、微囊泡 (Microvesicles, MVs) 、凋亡囊泡 (Apoptotic vesicles, AVs) 和病理碎片 (Necrotic debris, NDs) 3,15,16。一般EVs根据其大小进行分类，EXs (30100 nm) 、MVs (1001000 nm) 和AVs (15 mm) 3；里面包含有大量的生物活性分子物质如蛋白，mRNA和miRNA，这种构造能够能够从细胞里向外

9、通过从细胞质膜以出芽和裂变的方式释放出来，发挥其生物功能17。尤其是外泌体，它来自管腔内的多囊小体 (multivesicular bodies, MVBs) 内陷构成的，然后与质膜融合外排，以向外运输载体的方式释放到细胞18,19。值得注意的是外泌小体和微囊泡与细胞膜融合释放的方式是不是一样，到当前为止还不清楚。为方便后面的表述，把分泌到细胞外的分泌小体称之为 外泌体 ，这种EXs愈加小，一般在30100 nm之间7。 不仅这些不同的EVs的大小不同，而且其包含的蛋白成分和构成也大不一样。微囊泡是在细胞守到激活或应激刺激下直接由于质膜内陷包裹构成囊状构造释放出来，但是外泌体是在细胞内的内质网

10、内在囊状构造与之在分离开，然后通过转运通过细胞质膜释放出来，而凋亡囊泡是在细胞收到凋亡信号的刺激后以细胞出泡的方式释放出来16,20,21。当前还没有特殊的标记能够区分这些不同类型的EVs。微囊泡中一般含有与转运有关的内质网分选复合体 (endosomalsorting complexes required for transport, ESCRT) -Alix、TSG101蛋白和四跨膜蛋白超家族如CD63, CD81和CD9，但是这些蛋白也不只是唯一无二在微囊泡中表示出，利用这些蛋白加上大小的标志基本能够鉴别微囊泡构造8,15,17,22。当前定量和定性研究EVs的方式方法主要有下面集几种：

11、酶联相关免疫吸附实验、流式细胞技术、电子显微镜技术和WB技术，近来，很多新技术也应用在EVs的研究，如冷冻电子显微镜技术和纳米颗粒追踪技术等16,23。 2、 EXs介导卵泡体细胞与卵母细胞的互相作用 卵泡从外到内的构造简述如下：卵泡壁细胞，其上被缠绕毛细血管；在卵泡壁内周上是颗粒细胞；然后是环绕在卵母细胞上的卵丘细胞；最里面就是卵母细胞24,25,26,27,28,29。在卵母细胞上卵丘细胞与卵泡壁上的颗粒细胞之间的卵泡腔中，存在大量的卵泡液。而且卵泡液的数量随着卵泡的生长不断增加，同时能够与血液进行物质的交换，尤其与其围绕的颗粒细胞和卵丘细胞发生大量的物质交换30,31,32。当前研究发现

12、，主要以EXs为载体进行细胞信号的传导，调控卵母细胞的发育成熟33。其卵泡中各种细胞之间的相互作用关系可见以下图图1。 卵泡中存在卵母细胞与卵丘细胞、颗粒细胞和卵泡壁颗粒细胞有着密切联络，这些联络对于卵母细胞的生长发育至关重要24,25,26,27,28,29,34,35,36，尤其是包围在卵母细胞周围的各种体细胞其合成的相关激素等物质会以EXs的形式包裹以来，运输通过卵泡液的特殊液体环境到达作用的靶标-卵母细胞，发挥相应的调控作用，比方促进卵母细胞的发育成熟和启动减数分裂37,38。尤其在卵母细胞生长经过中，EXs是怎样协调各种不同细胞之间的联络对于卵母细胞的生长、成熟和后续排卵以及受精有着

13、非常重要的作用。华而不实，各种内分泌激素如FSH和LH对于卵泡从腔前卵泡生长到有腔卵泡阶段，起着必不可少的作用。同时，来源卵母细胞的细胞因子如GDF-9和BMP-15，也能影响邻近的颗粒细胞生长发育39,40，尤其是卵泡腔中积累的卵泡液来源于卵泡壁上血管里面的血液系统，这些卵泡液把这些细胞相互分隔开28,31。这种特殊的卵泡构造，通过EXs的介导，使得卵泡能够与通过毛细血管与血液系统发生充分的物质交换，同时这些围绕的体细胞和卵母细胞分泌的各种物质可以以进入血液系统，发挥其精到准确调控功能，使得卵母细胞能够在其生长历程中根据预定的方式进行发育41,42。可见卵泡这个特殊的复杂构造中EXs为卵母细

14、胞的成熟发育提供了唯一无二的条件。 图1 卵泡体细胞细胞与卵母细胞的互作构造图 3、 EXs对卵母细胞受精的调控作用 研究发现，EXs对于细胞之间的联络发挥重要的作用，能够相互之间传递蛋白质、RNA和miRNA等分子，通过运输能够到达作用的靶细胞17。在卵泡生长伴随的卵母细胞成熟的经过中，miRNAs能够以一种时空作用的方式协调调节各种基因的表示出43。同时，细胞外的miRNAs也在一些没有EXs的流体介质中发现了，如AGO2 (Argonaute 2) ，它是miRNA诱导基因沉默的效应器，会引起细胞中mRNA表示出沉默44。 精子与卵母细胞的融合是受精的一个必要环节。华而不实，CD9在受精

15、中发挥重要的作用，有研究表示清楚CD-9敲除小鼠的卵母细胞不能与精子完成受精经过45,46。利用转基因小鼠作为动物模型进行实验，发现卵母细胞通过类似于 外分泌体 的囊泡方式把CD9转移到精子的头部47。这些富含CD9的EXs主要定位在卵母细胞的卵周膜 (Perivitelline space, PVS) 的位置，直径大小在50250 nm，而且还表示出外分泌体的2个标记蛋白-神经节苷脂GM3和热休克蛋白9024,25,26。同时也有研究发现，在卵母细胞的PVS区域存在大小50150 nm的EVs，这些EXs与CD9密切相关48。但是有关积累在PVS中的EXs是由于CD9突变引起的，还是CD9的

16、突变依靠于卵母细胞分泌的EXs不是很清楚47,48。总之，这些在不同流体介质中EXs含有的各种miRNAs，有可能为揭示各种不同生理或病理状态下的各种生物标记，为后续的疾病早诊断和预防提供了新的思路49。 4、 瞻望 当前，已发现所有细胞均可释放包括EXs在内的各种细胞外囊泡，能够向近端和远端细胞递送脂质、蛋白质和核酸，发挥重要的生物学功能。但是有感EXs的研究也还存在下面的问题：1) EXs鉴定的颗粒大小标准不统一，其范围只是报道在30100 nm之间；2有关提取EXs的方式方法主要采取传统差速离心的方式方法，难以保证每次提取的获取EXs的成功率，而且难以做到百分之百的纯度；3有关后续EXs

17、的分子鉴定标记也没有统一；4有关EXs后续进一步RNA实验和蛋白检测等实验方式方法没有建立，需要进一步的研究予以拓展。尽管还存在上述的问题，但是当前关EXs在疾病的液体分子检测和诊断方面已经获得了很大的进展，尤其是在疾病液体诊断和靶向药物治疗等方面50，相信在不久的将来，将会进一步掀起EXs在各个研究领域的高潮。当然在有关卵母卵母细胞发育的研究，可以以利用EXs作为载体进行离体卵泡体外培养研究，进一步阐述卵泡中体细胞与卵母细胞的相互作用机制。 以下为参考文献 1 Sohel M M H, Hoelker M, Noferesti S S, et al. Exosomal and nonexos

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