昆虫酚氧化酶的研究进展综述,昆虫学论文.docx

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1、昆虫酚氧化酶的研究进展综述,昆虫学论文昆虫酚氧化酶phenoloxidase,PO是一种含铜离子结合位点的氧化酶1,可催化2类反响：一是催化单酚的加氧化作用，生成联苯酚；二是催化联苯酚的氧化作用，生成联苯醌。在昆虫体内酚氧化酶可催化天然底物-酪氨酸的氧化反响，产生二羟基苯丙氨酸即多巴dopa，多巴经脱氨或脱羧构成多巴醌dopaquinone或多巴胺dopamine，在一系列酶的作用下构成黑素melanin2. 1 昆虫酚氧化酶的功能 昆虫酚氧化酶在免疫应答、异源物包囊经过中起关键作用。昆虫存在2种不同类型的包囊作用：细胞型包囊cellular encapsulation和黑素型包囊melano

2、tic encapsulation3.细胞型包囊主要发现于血细胞数目较多的昆虫如鳞翅目中：首先由粒细胞granular cells和浆细胞plasmatocytes包裹外源物，构成一个由数层细胞组成的包囊，然后包囊内部发生黑素化并杀死被包裹的入侵有机体4.黑素型包囊主要发现于血细胞数目较少的双翅目昆虫中， 透明物质可能是活性酚氧化酶和黏性蛋白首先包被外源物质外表，然后酚氧化酶催化酪氨酸生成黑素，黑素再与包被物交联构成膜鞘5. 当昆虫受伤时，创伤处会出现深色色素区，这是由于酚氧化酶在伤口处将酚氧化成醌，最终构成黑素所致。黑素能够将血淋巴凝结作用coagulation产生的凝胶类物质进一步硬化、黑

3、化，堵塞伤口防止血淋巴流失，并阻止入侵的微生物乘机进入昆虫体内，由此对机体产生保卫作用6.酚氧化酶还介入昆虫外骨骼的鞣化和骨化。 该酶与乙酰化酶协同作用产生昆虫表皮鞣化、骨化的关键物质-N-乙酰多巴胺。N-乙酰多巴胺的芳香环和支链都可介入表皮蛋白质交联。鞣化是通过表皮蛋白质的氮原子与芳香环活化位点共价连接；而骨化则利用N-乙酰多巴胺活化的支链同表皮蛋白质连接7.酚氧化酶是昆虫应对外源物入侵的免疫防御屏障，也是黑素合成、伤口愈合与外骨骼硬化的关键环节，研究酚氧化酶对于阐释昆虫免疫防御机制，理解蝗虫体内的免疫和生理、生化经过具有重要意义。 2 昆虫酚氧化酶的激活 多数昆虫酚氧化酶以无活性的酶原形式

4、-酚氧化酶原prophenoloxidase,PPO，存在于昆虫血淋巴、中肠和表皮等组织。当病原微生物入侵时，昆虫免疫系统通过丝氨酸蛋白酶级联途径切除酚氧化酶原N-端50多个氨基酸，使其成为活化的酚氧化酶，介入机体的免疫防御反响。详细激活途径在几种形式生物假如蝇、烟草天蛾和赤拟谷盗中相对清楚明晰。下面以烟草天蛾酚氧化酶原激活途径为例介绍，见图1.首先革兰氏阳性细菌细胞壁内的肽聚糖或真菌的 -1, 3-葡聚糖与 -1, 3-葡聚糖辨别蛋白的复合物，可将血淋巴蛋白酶14前体激活为血淋巴蛋白酶14;接着血淋巴蛋白酶14又将血淋巴蛋白酶21前体剪切激活为血淋巴蛋白酶21;然后血淋巴蛋白酶21又将酚氧化

5、酶原活化蛋白酶2和3的前体水解为酚氧化酶原活化蛋白酶2和3. 革兰氏阴性细菌的细胞壁与C-型凝集素和 -1, 3-葡聚糖辨别蛋白结合后可以不经血淋巴蛋白酶21而直接激活酚氧化酶原活化蛋白酶2和3前体；最终，酚氧化酶原活化蛋白酶2和3剪切酚氧化酶原得到活化的烟草天蛾酚氧化酶。 3 昆虫酚氧化酶的调控 酚氧化酶的催化产物-醌衍生物不仅杀死寄生虫和病原菌，对本身细胞也有毒害作用。因而酚氧化酶原激活系统遭到严格的调控。丝氨酸蛋白酶抑制剂-4可抑制血淋巴蛋白酶21活化，丝氨酸蛋白酶抑制剂-1J、-3和-6则抑制酚氧化酶原活化蛋白酶2和3的激活，它们最终都抑制酚氧化酶原的激活9.实际上无论是激活途径还是抑

6、制效应都要归结为一点-酚氧化酶原N-端氨基酸的剪切调控。当前，不完全变态昆虫酚氧化酶原丝氨酸水解级联活化机制还不明了，蛋白酶剪切位点也无报道。昆虫酚氧化酶在黑素合成、体壁硬化和免疫应答反响中起关键作用，而酚氧化酶正常行使功能必须经过酶原激活步骤，但不完全变态昆虫相关机制研究几乎还是空白，从分子水平开展不完全变态昆虫酚氧化酶的激活机制研究对于理解酚氧化酶原怎样行使功能具有重要的理论意义。 4 昆虫酚氧化酶的研究现在状况 早期的昆虫酚氧化酶研究仅限于初步的酶活测定和基本理化性质研究。通常采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、分子排阻层析等方式方法纯化酚氧化酶原，再经胰蛋白酶或变性剂处理，得到活化的酚氧

7、化酶8.1999年，Lee 等从大黄粉虫Tenebrio molitor克隆得到了第一个昆虫酚氧化酶原基因9.翌年，Hatta等也报道了黑腹果蝇Drosophilamelanogaster酚氧化酶原基因。随后该酶的分子生物学研究得到长足发展，至今已有15种昆虫的酚氧化酶原基因被相继克隆。多数昆虫含有2类酚氧化酶原基因，即酚氧化酶原1prophenoloxidase 1,PPO1和 酚 氧 化 酶 原 2 prophenoloxidase 2,PPO2。但也有例外如：冈比亚按蚊Anophelesgambiae有6个酚氧化酶原基因，而瘤姬蜂Pimplahypochondria有3个。组织特异性表示

8、出方面，酚氧化酶原基因在冈比亚按蚊的头、胸、腹和马氏管10;成年雌性斯氏按蚊Anopheles stephensi的脂肪体和体壁11,棉铃虫Helicoverpa armigera的体壁、血细胞和中肠均有明显表示出12,但骚扰阿蚊Armigeres subalbatus只能在血细胞中检测到酚氧化酶原基因，而在脂肪体、中肠和卵巢中均未检测到13.这表示清楚不同物种间酚氧化酶原基因的组织表示出存在差异。 当前，昆虫酚氧化酶研究还主要集中在完全变态昆虫；而不完全变态昆虫的相关研究较少，且大多停留在注射病原或寄生虫后、观察酚氧化酶活性变化，缺少分子水平的证据。蝗虫仅3条基因序列报道：王世贵等从红褐斑腿

9、蝗Diabolocatantops pinguis获得 1 条 2 445 bp 的酚氧化酶原 2PPO2的cDNA序列；从飞蝗中获得2条2 143 bp和2 471 bp的酚氧化酶原PPO1和PPO2的cDNA序列。还没有关于这3个基因在mRNA及蛋白水平，不同部位和龄期间差异表示出的报道。Anas等经凝胶层析、离子交换层析、亲和层析3步从飞蝗血淋巴中得到分子量为 250 kDa 的酚氧化酶原，并揣测它是由 81kDa亚基组成的三聚体14;也有报道指出亚洲飞蝗酚氧化酶原是由78 kDa亚基组成的同源二聚体15. 遗憾的是文献并没有提供酚氧化酶原的氨基酸序列信息，因而还不清楚它们是由PPO1还

10、是PPO2组成的。2018年Li等成功解析了烟草天蛾酚氧化酶原的晶体构造，这是首例3-型铜蛋白家族酚氧化酶构造数据16.它的颁布为酚氧化酶的构造研究指明了方向。文章指出烟草天蛾酚氧化酶原为异源二聚体，含有一个标准的3-型双铜活性中心，每个铜离子由3个保守的组氨酸结合，N-端51位精氨酸残基为蛋白酶切位点，并揣测该酶原的N-端电荷和酶构造变化在激活经过中起关键作用。 5 总结 不完全变态昆虫是昆虫纲的重要成员，但不完全变态昆虫酚氧化酶原的研究还较为薄弱。根据果蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗等完全变态昆虫的酚氧化酶的生理功能与调控机制，进一步深切进入研究不完全变态昆虫的酚氧化酶原的激活与调控规律，对于人

11、类愈加全面的了解昆虫免疫系统的生理功能及调控机制具有重要意义。 以下为参考文献 1Kanost M R, Jiang H B, Yu XQ. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta J. Immunological Reviews,2004, 198: 97 - 105. 2Tang H. Regulation and function of the melanization reaction in Drosophila J. Fly Austin， 2018, 3: 105 - 111. 3吕鸿声。 昆虫

12、免疫学原理 M. 上海： 上海科学技术出版社， 2008. 4吴姗， 凌尔军。 昆虫细胞免疫反响中的吞噬、集结和包囊作用 J. 昆虫学报， 2018, 52: 791 - 798. 5刘守柱。 昆虫酚氧化酶免疫学功能及其对杀虫剂等外来干扰因子的响应 D. 泰安：山东农业大学，2008. 6Bidla G, Hauling T, Dushay M S, et al. Activation of insect phenoloxidase after injury: endogenous versus foreign elicitors J. J innate immune, 2018, 1: 301 - 308. 7王荫长。 昆虫生理学 M. 北京： 中国农业出版社，2004.