有机镓对卵巢切除大鼠骨折愈合的作用研究,骨伤科论文.docx

《有机镓对卵巢切除大鼠骨折愈合的作用研究,骨伤科论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《有机镓对卵巢切除大鼠骨折愈合的作用研究,骨伤科论文.docx（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、有机镓对卵巢切除大鼠骨折愈合的作用研究,骨伤科论文骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观构造退化为特征的，致使骨脆性增加而易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。骨质疏松通过改变愈合组织的质量和速度影响骨折愈合的全经过。骨折愈合的质量对于骨质疏松骨折病人的预后至关重要。 然而对于骨质疏松骨折的药物治疗至今仍未获得可喜的进展。骨质疏松会使骨折发生延迟，并且20% 的骨质疏松病人死于骨折。一个新的研究热门是能否有药物既能够治疗骨质疏松又对骨质疏松骨折有治疗作用。镓是一种有效的骨吸收抑制剂，能够用来保持或重恢复骨量。镓的某些理化性质与骨生理相关。镓能够吸附到骨组织羟基磷灰石上并快速结合到成骨中心，进入代谢活泼踊

2、跃的细胞中。 治疗剂量的镓能够在骨中构成痕量级蓄积。由于具有这些生物效应，因而镓化合物能够用来治疗多种骨量丢失疾病。当下，已经证实有机镓通过降低血清矿物质含量及增加骨矿物质含量防治卵巢切除大鼠骨量丢失。有机镓不仅能够降低重金属的毒副作用，同时能够发挥其抗骨质疏松作用。 但是对于有机镓能否促进骨质疏松骨折愈合方面还是空白，本研究目的是有机镓对卵巢切除大鼠骨折愈合的作用。 1 材料和方式方法 1. 1 动物 40 只 雌 性 Wistar 大 鼠 ( 2 月 龄，体 重 225 25g) 。由中国医学科学院实验动物中心提供。 动物合 格 证 号 为: 北 京 市 实 验 动 物 质 量 合 格 证

3、 明0077412。动物饲养场地在中国医科大学实验动物中心。嗜盐杆胞菌( 中国科学院微生物研究所提供) 。订单编号: 20180487; 硝酸镓( Betapharma 有限公司。上海，中国) 。 1. 2 检测仪器 Micro-CT ( SCANCO Medical AG，Switzerland ) ;高精 度数显光栅位移传感器 ( Instron Corporation，AM) ; 阿波特 300i 化学分析仪 ( Abbott Diagnostics，Abbott Park，IL，USA) ; Microscope( Olympus) ; Zwick-Z010 生物力学检测仪( Z010

4、; Zwick GmbH，Ulm) 。 1. 3 有机镓制备 酵母菌株( 中国科学院微生物研究所提供) 接种于 125mL 的三角瓶内，瓶内含 30mL YEPG( 每升:10g 酵母膏，10g 蛋白胨，20g 葡萄糖，3g 硝酸镓 ) 液体培养基。28 ，摇床( 200r/min) 孵育 20h。测定酵母细胞中镓含量，结合在酵母细胞中的镓即为有机镓。 1. 4 动物分组 40 只雌性 Wistar 大鼠被分为 2 组: ( 1 ) 假手术组( 对照 n = 10 只) ，( 2) 卵巢切除组 ( n = 30 只) ，无菌条件下腹侧入路行完好双侧卵巢摘除; 假手术组摘除与卵巢重量一样的卵巢周

5、围脂肪组织各 1块。12w 后随即选取每组各 5 只大鼠的胫骨，以双能 X 线吸收仪进行骨密度测定，两组测定结果进行比照0. 2261 0. 198g/cm2( 假手术组) VS0. 209 0. 205g / cm2( 卵巢切除组) ，已确认骨质疏松造模成功。对 40 只大鼠制造开放性骨折并予克氏针内固定。术后对卵巢切除组大鼠重新分组: 一个卵巢切除组( n = 15) 用 PBS 治疗，另外一个卵巢切除组( n = 15) 用有机镓治疗。治疗共持续 4w，取骨折愈合的大鼠股骨分别进行 micro-CT 测定骨小梁组织构造; 组织形态学测定骨组织愈合面积; 生物力学测定愈合股骨的最大负荷载力

6、; 骨矿含量检测评价钙盐含量。 1. 5 方式方法 1. 5. 1 骨折造模及内固定 将 40 只大鼠麻醉后在无菌条件下，于右侧股骨近端处截断。截断方式方法为应用三点应力实验测量器，将股骨近端制造骨折模型，股骨近端造模有利于减少骨膜及周围软组织损伤。将股骨骨折大鼠于无菌条件下行克氏针固定，术后 3d 青霉素钠预防感染。在骨折造模后药物治疗经过中，卵巢切除组( OVX + PBS) 有 3 只大鼠死亡，卵巢切除组( OVX +有机镓) 有 2 只大鼠死亡，假手术组( Sham + PBS)没有大鼠死亡。在骨折愈合阶段没有大鼠骨折断端出现感染。 1. 5. 2 药物治疗 大鼠分 为 3 组，分 别

7、 制 成 两 个 卵 巢 切 除 组( OVX) 和一个假手术组( sham) 。假手术组( n = 10，sham) 和一个卵巢切除组 ( n = 15，OVX ) 用 PBS 治疗，另外一个卵巢切除组用有机镓治疗( OVX + 有机镓 120 g/( kg day) ) 。治疗期为 4w。治疗结束后，取右股骨愈合处进行组织形态学检查、生物力学测试、矿物质含量检测。 1. 6 检测项目和方式方法 1. 6. 1 Micro-CT 利用台式 micro-CT 对所有试验动物的股骨进行检测分析 ( SCANCO Medical AG，Switzerland) 。 沿着整个股骨的长轴，扫描 600

8、 层，层厚 40 m，已通过骨折愈合部分的区域作为选定区域，包括骨折区域在内的上下各 100 层进行数据统计。三维骨小梁 结 构 参 数 可 以 直 接 测 量 出 来: Bone volume( BV) : 骨小梁体积; Tissue volume ( TV) : 被测样品总体 积; BV/TV: 骨 体 积 分 数; trabecular thickness( Tb Th) : 骨 小 梁 厚 度; trabecular separation ( TbSp) : 骨小梁间距; trabecular number ( Tb N) : 骨小梁数目。 1. 6. 2 骨组织形态计量学观察参数 利

9、用 10% EDTA( 乙二胺四乙酸) 将股骨脱钙，石蜡包埋后，纵切。利用显微镜上的投影描绘器和分析软件( Image-Pro 4. 0 analysis software) 对组织形态测定结果进行分析。每个切片厚度为 5 m，均选择 10个松质骨骨折愈合区域，放大 200 倍进行检测。每个区域中选择愈合组织 3 5 处切片位置，使实验更具有一致性，并减少误差。愈合组织的总面积，愈合组织的骨愈合面积，愈合组织的软骨面积被测量。 1. 6. 3 大鼠离体股骨颈生物力学测试 应用三点应力载荷测量股骨机械强度。( Zwick-Z010 testing systems( Z010; Zwick Gmb

10、H，Ulm) 室温条件下，股骨缓慢融化后，除去附着在股骨上的软组织，并将股骨头端浸润水泥，以防止股骨发生旋转，产生旋转方向应力，影响测量结果。将股骨放置在三点应力测试器上，跨距为 40mm，2mm/min 的速度匀速运动，直至股骨愈合处发生再次骨折。记录股骨骨折时，骨折载荷的最高值( 牛顿，N) 。 1. 6. 4 骨矿物质含量测定 为了测定骨矿含量，将股骨 620 ，48h 条件下矿化并测重。矿化骨溶解于 6mol/L 盐酸溶液中，比色法测定骨矿含量中钙的含量( Pointe Scientific 标准试剂盒) 。 1. 7 统计学处理 数据收集在 Excel ( Microsoft) 文件

11、里。micro-CT 检测所得骨小梁构造数据，组织形态测定术所得数据，骨机械性能检测所得数据以及骨矿物质含量均进 行 均 数 和 标 准 差 统 计。组 间 差 异 统 计 利 用ANOVA 和 Post hoc Tukey s test 检验用于组间差异统计。( SPSS 版本 13. 0) 。全部统计分析，P 值小于 0. 05 时，差异具有显着性。 2 结果 2. 1 酵母中镓含量 酵母中镓的含量用中子活化分析方式方法检测，酵母细胞中金属镓的浓度为 463. 2 + 16. 6 g/g 。由于镓 达 到 饱 和 时 的 浓 度 为 0. 3%，因 此 选 择0. 3% 的浓度参加酵母的组

12、织液中。 2. 2 Micro-CT 经过 4w 的治疗，有机镓治疗组愈合组织百分比比假手术组增加 15. 8% ，有机镓治疗组愈合组织百分比显着高于卵巢切除组( 表 1) 。有机镓治疗组骨小梁厚度高于假手术组骨小梁厚度 18. 1% ，比卵巢切除组高 40. 8% 。但是，有机镓治疗组骨小梁数比假手术组低。有机镓治疗组骨骨小梁间距比假手术组增加 4. 9% ( 表 1) 。【表1】 2. 3 骨组织形态计量学观察参数 组织形态测定术检测骨质疏松骨折的愈合面积。卵巢切除组织全部愈合组织面积比假手术组低12. 7% ，有机镓治疗组明显增加了全部愈合组织面积( 图 1a) 。卵巢切除组的愈合组织骨

13、面积较假手术组降低 9. 2% 。有机镓治疗组比卵巢切除组高34. 9% ( P 0. 05) ( 图 1b ) 。 卵巢切除组的愈合组织软骨面积较假手术组有显着升高( 图 1c) 。组织形态学检测同样揭示了有机镓对于破骨细胞的影响。有机镓治疗组破骨细胞数量比卵巢切除组低 2 倍( P 0. 05) ( 图 1d) 。【图1】 2. 4 大鼠离体股骨生物力学测试 大鼠离体股骨颈生物力学测试有机镓治疗组股骨骨折愈合强度显着高于卵巢切除组，最大负荷载力增加 50. 6% ，构造强度增加 36. 5% ，能量吸收增加 90. 9% 。然而最大负荷载力、构造强度、能量吸收均低于假手术组( 图 2).【

14、图2】 2. 5 骨矿物质含量测定 卵巢切除组骨矿物质含量显着低于假手术组。与卵巢切除组相比，有机镓治疗组显着提高骨矿物质含量( 表 2) 。【表2】 3 讨论 骨质疏松症是以骨组织元素持续丢失，导致骨质变脆，增加骨折风险为特征的一种全身性代谢病，是中老年人中常见的一种代谢性骨病，主要发生在绝经后妇女和老年人，由于易诱发骨折，可致畸、致残，给中老年人带来莫大的痛苦，并严重影响生活质量。因此，重视骨质疏松症的防治对提高中老年人的生活质量至关重要。据估计，我们国家大于等于 60 岁的人群在将来 30 50 年中将达总人口的 20% 30% ，骨质疏松症与其诱发骨折的患病人数将明显增加，防治骨质疏松

15、症及降低骨折发生率是我们所面临的严峻挑战。因而预防骨折发生成为治疗绝经后骨质疏松的总体目的。 元素镓能够改变骨矿物质含量，骨基质和细胞的性质。关于镓的作用机制，当前以为 3 价金属镓离子在体内极易与转铁蛋白受体( Transferrin简写为 Tf) 构成 TF-Ga( ) 复合物，阻止铁进入细胞，致细胞内铁缺乏而导致核糖核昔酸复原酶铁依靠 M2 亚单位活性降低，进而抑制细胞内 DNA 合成。国外学者则对硝酸镓治疗骨疾病进行了全面的研究，他们以为镓能够通过某种未定的机理，可能是影响了成骨细胞或 /和破骨细胞的细胞因子 IL-6 分泌，使得骨代谢趋于正常化。除此之外，镓的某些理化性质与骨生理相关

16、。镓能够吸附到骨组织羟跃的细胞。治疗剂量的镓能够在骨中构成痕量级蓄积。由于具有这些生物效应，因而镓化合物能够用来治疗多种骨丢失疾病，如绝经后骨质疏松症。然而，与镓相关的副作用限制了它成为一种好的骨质疏松症治疗因子。不良反响有胃肠道反响( 如恶心、呕吐、粘膜炎、口内金属味) 、骨髓抑制和肾脏毒性。有机镓是一种有潜力的方式，其在保持治疗作用的同时能够降低镓相关的毒性。 酵母有富集能力，能够将无机物转换成有机状态，能够作为镓的载体。 根据对镓治疗骨质疏松症的研究，已经证实有机镓通过降低血清矿物质含量及增加骨矿物质含量防治卵巢切除大鼠的骨量丢失。然而，当前对镓能否促进骨质疏松骨折愈合还是未知，因而本课

17、题的研究目的是证实有机镓对卵巢切除大鼠骨折愈合的作用。这篇研究证实镓能够增加愈合组织的总面积。 骨折愈合的面积包括两大部分，研究发现，同卵巢切除组相比，有机镓能够增加骨折愈合组织中骨小梁的厚度，骨小梁的数目，并且降低了骨小梁的间隙。生物力学检测的结果也符合骨显微构造发生的变化。这些发现充分的证明了有机镓是通过改善骨小梁的显微构造促进骨质疏松骨折愈合的。 有机镓同样能够降低破骨细胞的数目。在绝经导致的骨质疏松症中，由于缺少雌激素，破骨细胞的数目增加，活性加强，并且它能够增加骨吸收、抑制骨构成。这篇研究证明了有机镓治疗组破骨细胞的数目要显着低于卵巢切除组大鼠。这个发现讲明有机镓作为一种抗骨质疏松药物不但能够减少破骨细胞数目，而且还能够影响破骨细胞的活性。然而，Cournot-Witmer 等发现镓能够提高破骨细胞的数目。因而，有必要进一步研究镓对于破骨细胞的作用及影响。 我们的研究结果证明，有机镓在骨质疏松性骨折发生后不仅具有良好的抗骨质疏松作用，同时有利于促进骨质疏松性骨折愈合组织的构成及生长，对骨小梁的显微构造、骨组织的形态学变化、骨生物力学强度的提高均有显着作用，并且未发现有害于骨质疏松骨折愈合的影响。因而，本实验研究结果提示，有机镓能够作为人类严重骨质疏松骨折的防治手段。