FAK在机械压力诱导的气道黏液分泌的信号传导通路中的作用,病理学论文.docx

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1、FAK在机械压力诱导的气道黏液分泌的信号传导通路中的作用,病理学论文临床中多种慢性气道炎性反响疾病( 如 COPD、哮喘等) 往往伴有支气管收缩及重塑产生的气道狭窄，由此引发气道内压力增高，气道壁上皮细胞受压增加。而黏液高分泌作为这类疾病的突出病理表现，是疾病发生、发展及预后的重要影响因素。 黏蛋白5AC( MUC5AC) 是气道上皮尤其是病理状态下的主要黏蛋白表型，在气道黏液高分泌疾病中最具代表性。黏着斑激酶( focal adhesion kinase，FAK) 能介导机械牵拉所导致的 EK1 /2 活化。而 EK1/2 是已经知道的多种刺激因素诱导 MUC5AC表示出和杯状细胞化生的关键

2、性酪氨酸激酶。那么，FAK 能否在机械压力诱导的气道黏液分泌的信号传导通路中起作用呢? 该研究中以 FAK 为切入点，研究机械压力作用于气道上皮细胞所产生的对气道黏液分泌的调控作用及信号传导机制，以期探明机械压力在气道黏液高分泌调控机制中作用及其分子机制，为控制疾病状态下气道收缩狭窄状态提供新的思路。 1 材料与方式方法 1. 1 主要试剂及材料 正常人气道上皮 NHBE 细胞和 BEBM 培养基( 均 Clonetics 公司) ; DMEM 培养基( Mediatech 公司) ; Transwell 培养板( Corning 公司) ; PMI 培养基、胎牛血清、TIzol 试剂和抗 -

3、肌动蛋白的单克隆抗体( Sigma 公司) ; 脂质体 Oligofectamine( Invitro-gen 公司) ; 鼠抗 MUC5AC 45M1 单克隆抗体 ( Neo-marker 公司) ; 鼠抗 FAK 单克隆、鼠抗 FAK 磷酸化位点多克隆( 抗 FAK Tyr397) 抗体、鼠抗磷酸化细胞外信号调节激酶 1/2( p-EK1/2) 单克隆抗体、表皮生长因子受体( EGF) 阻断剂 AG1478、p-EK1/2抑制剂 PD98059( Cell Signaling 公司) ; PrimeScriptT 试剂盒 ( 大连宝生物公司) ; FastStart UniversalSY

4、B Green Master( ox) ( 德国罗氏公司) ; 引物由( 上海生工公司合成) ; FAK siNA 和对照 siNA( Dharmacon 公 司) ，FAK siNA 序 列 为: FAK1，NNGCAUGUGGCCUGCUAUGGA; FAK2，UUUGGCGGUUGCAAUUAAATT。 1. 2 方式方法 1. 2. 1 细胞培养: NHBE 细胞接种于组织培养瓶中，参加支气管上皮细胞培养液，置于 37 、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育，常规换液培养，当细胞汇合达 70% 80% 时传代，将培养好的 2 代或 3代细胞接种到 Transwell 培养板中的多微孔聚碳酸酯

5、膜上。Transwell 培养板插入配套 6 孔板中，构成上、下室，参加 1: 1 混合的支气管上皮细胞培养液/达尔伯克必需基本培养基混合培养液继续培养，上、下室培养液一样。每 2 天更换培养液至细胞长满纤维膜并融合，去掉上室培养液，建立气液相界面供试验使用，继续每 2 天更换下室培养液。 1. 2. 2 压力实验装置及分组: 参照文献7 8。Tr-answell 培养板上室加上带进气口的硅胶塞构成密闭小室，进气口连接气泵，通过向上室内输送湿化的37 、5% CO2的空气，控制上室气压，而下室仍处于大气压，进而使得多微孔聚碳酸酯膜上的NHBE细胞遭到跨细胞压力。参照文献1，8，气液相界面培养1

6、4 d开场，采用 30 cm H2O 压力作用于 NHBE 细胞，天天1 h，连续7 d，模拟慢性气道炎性性疾病中气道收缩时气道上皮细胞遭到的慢性机械压力。 1. 2. 3 细胞分组: 将构成气液相界面的 NHBE 细胞分组处理: 1) 空白对照组: 无血清培养基继续培养，不予任何刺激; 2) 机械压力组: 细胞天天予以 30 cmH2O 压力作用 1 h，连续 7 d; 3) 转染 FAK siNA 对照组; 4) 机械压力 + 转染 FAK siNA 组。 在讨论 EK1/2 在机械压力诱导的 MUC5ACmNA 及蛋白表示出中的作用实验中，采用 EK1 /2特异性抑制剂 PD98059

7、作为干涉因素，将细胞分为下面 4 组: 空白对照组、机械压力组、PD98059 对照组和 PD98059 + 机械压力组。 在讨论 FAK siNA 联合 EGF 特异性抑制剂AG1478 对机械压力诱导的 MUC5AC mNA 和蛋白表示出的影响的实验中，将细胞分为下面 6 组: 空白对照组、机械压力组、AG1478 对照组、AG1478 + 机械压力组、FAK siNA + AG1478 对照组和 FAK siNA+ AG1478 + 机械压力组。 1. 2. 4 FAK siNA、对照 siNA 转染: 在转染前 1天将处于指数增长期的 NHBE 细胞按( 1 2) 106个/mL的浓度

8、在无血清条件下接种到培养板中，待细胞融合至 40% 50%时进行转染。操作步骤根据脂质体 Oligofectamine 讲明书进行。参照文献【9】，将 FAK siNA 与 Plus eagent 在 Opti-MEM 培养液中结合。用 Opti-MEM 培养液稀释的脂质体以10 g / mL 的浓度进行转染。转染 6 8 h 后，将0. 5 倍容积的含 20% 血清的 PMI 培养液参加到细胞中继续转染 48 h。转染后 24 48 h 于荧光显微镜下观察荧光，以此鉴定转染能否成功及转染效率。 1. 2. 5 实时荧光定量 PC 检测 MUC5AC mNA 的表示出: 细胞总 NA 提取及浓

9、度、纯度鉴定按以下为参考文献10方式方法进行。cDNA 反转录根据 PrimeScript 反转录试剂盒讲明书进行。人 MUC5AC( AF015521)引物序列为: 上游5 -CTGGACATGACCTGTTACAGC-3 ，下 游 5 -AGCTGGCCTTCTTGTGCACGC-3 。 人GAPDH ( NM _ 002046 ) 引物序列为: 上游 5 -TGTTCGTCATGGGTGTGAACC-3 ，下游 5 -CATGAGTCCTTCCACGATACC-3 。根据试剂盒讲明建立 10 LPC 反响体系，反响参数为 95 变性 10 min，95 变性 15 s，55 退火 30

10、s，40 个循环。采用 2 Ct的方式方法分析目的基因 mNA 的相对表示出量。Ct 是到达荧光阈值所需的循环数， Ct = 实验组( Ct 目的基因 Ct 管家基因) 对照组( Ct 目的基因 Ct管家基因) 。 1. 2. 6 ELISA 法检测细胞分泌的 MUC5AC 蛋白含量: 按以下为参考文献11方式方法进行。 1. 2. 7 Western blot 检测 FAK、p-EK1 /2 蛋白表示出: 步骤按以下为参考文献11方式方法进行( 鼠抗 FAK 单克 隆、鼠 抗 FAK 磷 酸 化 位 点 多 克 隆 ( 抗 FAKTyr397) 抗体、鼠抗 p-EK1 /2 单克隆抗体终浓度

11、均为 1 1 000) 。 1. 3 统计学分析 采用 SPSS17. 0 统计软件包，所有数据均以均值 标准差( x s) 表示，两样本均数间比拟采用 t 检验，多样本均数间比拟采用单因素方差分析。 2 结果 2. 1 FAK siNA 转染对 NHBE 细胞合成 FAK 蛋白的干扰效率 FAK1 和 FAK2 siNA 转染组细胞表示出 FAK 蛋白相对含量分别为( 0. 28 0. 03) 和( 0. 32 0. 04) ，均显着低于对照 siNA 组的( 0. 68 0. 06) ( P 0. 01) 和未转染对照组的( 0. 74 0. 07) ( P 0. 01)( 图 1) 。由

12、于 FAK1 siNA 和 FAK2 siNA 均有显着干扰效率，故在后续实验中采用两者结合的一个siNA 来进行 NA 干扰。 2. 2 机械压力对 FAK 磷酸化的影响 机械压力组细胞表示出 FAK 磷酸化位点 Tyr397蛋白相对含量( 0. 39 0. 03) 较空白对照组的( 0. 25 0. 02) 有显着提高( P 0. 05) ( 图 2) 。 2. 3 FAK 在机械压力诱导的 MUC5AC mNA 及蛋白表示出的影响 与空白对照组相比，机械压力能显着升高MUC5AC mNA 及蛋白含量( P 0. 01) ; FAK siNA转染则可显着降低由机械压力所诱导的上述指标的升高

13、( P 0. 05) ; 但是，机械压力 + 转染 FAK siNA组细胞表示出 MUC5AC mNA 及蛋白水平较转染 FAKsiNA 组仍然是增加的( P 0. 05) ( 表 1) 。 2. 4 FAK 在机械压力诱导的 EK1 /2 磷酸化中的作用 与空白对照组的( 0. 43 0. 07) 相比，机械压力组细胞 p-EK1/2 蛋白表示出相对含量( 0. 79 0. 05)显着增加( P 0. 01) ; 与机械压力组相比，机械压力+ 转染 FAK siNA 组细胞表示出 p-EK1 /2 蛋白相对含量( 0. 60 0. 04) 显着减少( P 0. 05) ; 但是，与转染 FA

14、K siNA 对照组的( 0. 41 0. 02) 相比，机械压力 + 转染 FAK siNA 组细胞表示出 p-EK1/2 蛋白相对水平仍然是增加的( P 0. 05) ( 图 3) 。 2. 5 EK1 /2 在机械压力诱导的 MUC5AC m-NA 及蛋白表示出中的作用 PD98059 + 机械压力组细胞 MUC5AC mNA 及蛋白相对表示出水平与机械压力组相比显着降低( P 0. 01) ( 表 2) 。 2. 6 FAKsiNA 联合 EGF特异性抑制剂AG1478 对机械压力诱导的 MUC5AC mNA 和蛋白表示出的影响FAK siNA 联合 AG1478 能够显着抑制单纯机械

15、压力诱导的 MUC5AC mNA 和蛋白表示出( P 0. 01) ; AG1478 单独作用可显着降低由机械压力所诱导的上述指标的升高( P 0. 05) ，但与 AG1478对照组相比差异仍具有显着性( P 0. 05) ( 表 3) 。 3 讨论 FAK 在机械牵拉所导致的 EK1 /2 活化中起重要介导作用。而 EK1 /2 是已经知道的多种刺激因素诱导 MUC5AC 表示出和杯状细胞化生的关键性酪氨酸激酶。因而，FAK 可能在机械压力诱导的气道上皮细胞 MUC5AC 表示出中起信号传导作用。 该研究发现，机械压力能够诱导人支气管上皮细胞 FAK 最重要的本身磷酸化位点-酪氨酸位点Ty

16、r397 的磷酸化水平增高。小干扰 NA( small in-terfering NA，siNA) ，能够序列特异性与靶 mNA序列结合，导致特异性 mNA 的降解，进而稳定持续地维持较长时间的基因沉默。该研究中所采用的 FAK siNA 质粒在实验中被证实可特异性地成功下调 NHBE 细胞 FAK 蛋白的表示出。研究同时发现，机械压力能够诱导 NHBE 细胞 MUC5ACmNA和蛋白及磷酸化 EK1 /2 蛋白的表示出显着增加，FAK siNA 则能够有效降低但却不能完全抑制机械压力诱导的上述效应，而 EK1/2 特异性抑制剂 PD98059 却能显着并完全抑制机械压力诱导的MUC5AC m

17、NA 和蛋白的表示出，提示机械压力诱导的 MUC5AC 高表示出的信号传导通路为 EK 依靠的，FAK 为 EK 的上游信号分子，但可能存在其他非 FAK 依靠的 EK 激活信号通路。 支气管收缩产生的气道压力增加可经表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor，EG-F) 信号通路完成细胞外机械信号向细胞内化学信号传导，并介入调节丝分裂原激活的蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信 号 通路。因而，EGF 可能是诱导 EK 活化并最终导致 MUC5AC 表示出增加的另一上游机械传导通路。 在后续的实

18、验中发现，EGF 特异性抑制剂 AG1478与 FAK siNA 一样单独作用于 NHBE 细胞时能够显着降低但却不能完全抑制机械压力诱导的MUC5AC mNA 及蛋白的表示出，而将两者联合作用于 NHBE 细胞则能完 全 抑 制 机 械 压 力 诱 导 的MUC5AC 的高表示出，同时，EK 传导通路上游部分的 EGF 的活化在各种因素诱导的气道黏液高分泌信号传导通路中居中心地位，因而，EGF 为另一重要的机械压力诱导的 EK 激活及 MUC5AC 表示出的上游信号通路。 研究结果初步证实了 FAK、EGF 所介导的机械压力促人支气管上皮细胞 MUC5AC 表示出效应，并进一步说明了 EK

19、信号传导通路在华而不实所起的作用，进而加深了对气道黏液高分泌的机械传导机制的了解，为慢性气道炎症性疾病防控提供一个新的研究思路。 以下为参考文献: 1Wiggs B，Hrousis CA，Drazen JM，et al On the mecha-nism of mucosal folding in normal and asthmatic airwaysJ J Appl Physiol，1997，83: 1814 1821。 2李琪，周向东 TNF- 与香烟烟雾在诱导气道上皮细胞系黏蛋白表示出的互相作用J 基础医学与临床，2018，29: 1139 1143。 3Chaturvedi LS，M

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