研究复方丹参方全方对老鼠心脏CYPs亚型mRNA表达的作用,中医内科学论文.docx

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1、研究复方丹参方全方对老鼠心脏CYPs亚型mRNA表达的作用,中医内科学论文复方丹参方Composite Salvla Recipe,CSR由丹参、三七、冰片3味药材组成，具活血化瘀、理气止痛之成效，在治疗冠心病、心绞痛方面疗效确切.有研究表示清楚，复方丹参方能够抗大鼠心肌缺血，使心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死面积减少，加强超氧化物歧化酶SOD的活性，降低丙二醛MDA的量，有保卫心脏的作用. 细胞色素P450酶CYPs是一种多功能酶系，是生物体内介入内源性化合物激素、脂肪酸和外源性化合物药物、前致癌物和前毒物主要生物转化的酶系.CYPs是存在于多酶系统中末端结合于膜的氧化酶，决定酶系底物的专一性，

2、在整个酶系功能中起着尤为关键的作用，多表示出于肝脏，当前已经知道约1000种CYPs,主要分为17个家族，可进一步分为很多亚族与亚型。人体内约有75%的药物通过CYPs代谢.近年来很多CYPs家族在心脏、血管内皮细胞和平滑肌细胞中得以鉴定，同时很多证据显示内源性物质经CYPs的代谢产物在维持心血管内环境稳态中发挥重要作用.如花生四烯酸可被CYPs环氧酶代谢为环氧二十碳三烯酸EET或被CYPs -羟化酶代谢为20-羟基二十碳四烯酸20-HETE.研究表示清楚，CYPs已经确定存在于心脏和血管内，通过抑制选择性CYPs能够对心肌缺血和再灌注损伤产生防护作用. 以往对于复方丹参方的药理机制研究主要集

3、中于执行心血管重要功能的靶点或指标，如氧化损伤、自由基去除、心肌细胞Ca2+变化、脂质代谢及血液流变学和对心肌细胞的保卫等方面，未见复方丹参方对心脏CYPs调控的研究，鉴于复方丹参方是治疗心血管疾病的临床常用药物，同时CYPs在心血管功能中具有重要作用，其对心肌CYPs影响和机制仍不是特别清楚，因而本研究选择在心血管中表示出并且执行重要功能的CYPs第1家族2种亚型、第2家族4种亚型和第6家族6种亚型的CYPs同工酶，利用Real Time PCRRT-PCR方式方法考察连续、长期使用复方丹参方及其单药对上述亚酶的影响。以评价复方丹参方及其单药对心脏CYPs亚型的影响，为进一步深切进入研究复方

4、丹参方以心脏CYPs为靶点的心血管药理效应的机制提供线索，同时为指导临床合理联合用药提供实验根据。 1、材料 1.1 仪器 DY89-1匀浆机宁波新芝生物科技有限公司，制冰机ManitowocQM20，PCR仪GeneAmp2400，核酸蛋白分析仪BeckmanDU640，超低温冰箱Sanyo MDF-U53V，高速低温离心机HeraeusLabofuge400R，Step One Plus TM Real Time PCR仪Applied Biosy stems。 1.2 药品与试剂 丹参、三七、冰片药材均购自安徽绿源公司，并经军事医学科学院放射医学研究所药理毒理研究所马百平教授鉴定为唇形科

5、植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的枯燥根和根茎，五加科植物三七PanaxnotoginsengBurk.F.H.Chen的枯燥根和根茎，合成龙脑。1000粒复方丹参滴丸的组成：丹参90g、三七17.6g、冰片1g,参考(中国药典2018年版一部复方丹参滴丸煎煮方式方法，以上3味药，丹参、三七加水煎煮，煎液滤过，滤液浓缩，参加乙醇，静置使沉淀，取上清液，回收乙醇，浓缩成稠膏，参加冰片细粉，再浓缩成1g/mL稠膏，备用. 丹参、三七和冰片的煎煮方式方法和复方丹参方的煎煮方式方法一致，浓缩成1g/mL.各水煎液用时以蒸馏水配制。超纯总RNA快速提取试剂盒北京博迈德生物技术有限公司

6、；Trans Script TM One-Step RT-PCR Super Mix北京全式金生物技术有限公司；Fast SYBR Green Master MixApplied Bio systems。其他试剂均为市售分析纯。 1.3 动物 雄性SD大鼠，清洁级，体质量180220g,军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-军-2007-004.动物常规喂养，自由饮水；饲养室光照10h,黑暗14h,温度2125，湿度30%70%. 2、方式方法 2.1 动物分组及给药 40只SD大鼠随机分为5组，每组8只。分别为对照组、复方丹参方组、丹参组、三七组、冰片组。 按(中国药典20

7、18年版一部规定的临床剂量及相关文献按体外表积折算为大鼠给药剂量，详细剂量为复方丹参方0.32g/kg d、丹参0.27g/kg d、三七0.05g/kg d、冰片0.003g/kg d，ig给药，对照组给予同等剂量的生理盐水。天天给药1次，给药时间为(中国药典2018年版规定的1个疗程，即28d. 2.2 心脏CYPs mRNA水平测定 给药28d后取各处理组大鼠心肌组织，液氮速冻后？80保存备用。实验时取适量心肌组织按试剂盒讲明提取心肌组织总RNA,电泳分析表示清楚18S和28S条带清楚明晰可见，A260/A280值在1.72.0,总RNA片段完好未降解可用。取2.0 gRNA根据Tran

8、s Script TM One-Step RT-PCR Super Mix讲明进行逆转录反响，42、30min;85、5min.用ABI Step One Plus TM Real Time PCR 仪进行PCR反响，取2.0 L逆转录反响产物作为PCR反响模板，参加上下游引物20 mol/L各0.5 L,Fast SYBR Green Master Mix 10 L,补充Rase-free water至20 L.反响参数：95、20s预变性，95、3s变性，6030s退火，共40个循环。每次扩增设置 -actin内参照，进行PCR扩增产物的实时定量分析，用2?Ct方式方法分析。特异性引物序列

9、见表1. 表1 2.3 统计学分析 所有数据重复3次，每次设置3个复孔。实验数据用x s表示，采用SAS统计学软件，两组间比拟采用t检验。 3、结果 3.1 复方丹参方对大鼠心脏CYP1家族中CYP1A1和CYP1B1亚型mRNA水平的影响 复方丹参方及其单味药对大鼠心脏CYP1家族代表亚型mRNA水平的影响结果见图1.与对照组比拟，丹参组、三七组和冰片组对CYP1A1都有下调趋势P 0.01；复方及其单味药组对CYP1B1都具有下调趋势P 0.05、0.01。 图1 3.2 复方丹参方对大鼠心脏CYP2家族CYP2B1、CYP2C11、CYP2E1和CYP2J3mRNA水平的影响 对大鼠心脏

10、CYP2家族来讲，与对照组比拟，复方丹参方组、丹参组、三七组和冰片组对CYP2B1有抑制作用P 0.05、0.01；丹参组、三七组和冰片组对CYP2C11有下调趋势P 0.01；而复方丹参方组、丹参组和三七组对CYP2E1有抑制趋势P 0.05、0.01；丹参组和三七组对CYP2J3有下调作用P 0.01，而复方丹参方组对CYP2J3有上调趋势。结果见图2. 图2 3.3 复方丹参方对大鼠心脏CYP4家族CYP4A1、CYP4A3、CYP4F1、CYP4F4、CYP4F5和CYP4F6mRNA水平的影响 与对照组比拟，复方丹参方组对CYP4A1和CYP4F4的mRNA表示出有抑制作用P 0.0

11、5；丹参组对CYP4A1、CYP4F4和CYP4F5亚型的mRNA表示出有下调作用P 0.05、0.01，对CYP4A3、CYP4F1和CYP4F6的mRNA表示出有上调趋势P 0.05；三七组对CYP4A1、CYP4A3、CYP4F4、CYP4F5和CYP4F6的mRNA表示出均有不同程度的抑制趋势P 0.05、0.01；冰片组对CYP4A1和CYP4F4的mRNA表示出有下调趋势P 0.01。结果见图3. 图3 4、讨论 CYPs最初发现于肝微粒体，其在生物转化、药物代谢、解毒等方面研究进行较早且较广泛，而AA经CYPs途径的代谢产物对心血管系统的影响近年来日益遭到重视，其代谢产物中EET

12、s和20-HETE在调节血管张力和高血压的发展中有重要影响.大鼠血管内皮、心肌组织和平滑肌细胞等富含CYPs表氧化酶如CYP2C11、CYP2J3等和羟化酶如CYP4A1、CYP4F1等，代谢AA分别产生EETs和20-HETE.EETs由血管活性物质如乙酰胆碱、缓激肽、AA促进内皮细胞释放，通过激活钙敏感性钾通道Ca2+-sensitivepotassiumchannel,Kca使内皮下的平滑肌细胞发生超级化反响而产生扩血管效应.20-HETE在大鼠中主要由CYPs4家族代谢，这是一种强有力的缩血管物质，对血压调节有重要影响. 复方丹参方及其单味药连续ig诱导处理28d后，发现复方丹参方及其

13、单味药对CYP1A1和CYP1B1有不同程度的抑制作用。有文献报道，在一定程度内，吸烟者的CYP1A1的基因变异体增加了心血管疾病的风险性，同时可能提高动脉粥样硬化的发病率;心力衰竭时，CYP1B1的表示出会上调,这讲明复方丹参方及其单味药一定程度上减少心血管疾病发生的概率。CYP2J2/3主要表示出于心脏，且主要合成具有心脏保卫作用的EETs.大鼠心脏CYP2J3与人类心脏CYP2J2具有70%的同源性。复方丹参方对大鼠CYP2J3有诱导趋势，而单味药组对其是抑制趋势，复方对心脏的保卫作用强于单味药，有增效作用。Bhatnagar研究发现CYP2J对心脏表现为保卫作用，而CYP2C则表现为加

14、重损伤，提出CYPs不同亚型可能产生氧自由基不同，而表现为加重或拮抗心肌缺血/再灌注损伤。本研究中复方丹参方及其单味药组对CYP2B1、CYP2C11和CYP2E1都有不同程度的下调作用，从一个侧面支持了Bhatnagar的观点。复方丹参方及其单味药组对大鼠心脏CYP4A1、CYP4A3、CYP4F1、CYP4F4、CYP4F5和CYP4F6亚型mRNA水平，有不同程度的诱导或者抑制趋势，这讲明复方丹参方及其单味药对血压的调节可能是一个双向的作用，进而支持中药复方对机体是双向调节的作用，维持机体的平衡。复方丹参方和单味药对心脏CYPsmRNA表示出影响的奉献度不同，例如丹参、三七和冰片对CYP

15、1A1和CYP2J3都有抑制趋势，而复方丹参方对其是诱导趋势，讲明复方及其单味药对这两种亚型CYPsmRNA表示出影响的奉献度不同。丹参、三七和冰片对CYP1A1和CYP1B1都有抑制作用，但配伍后，复方对这两个的亚型的抑制作用减弱。三七对这12种亚型都有不同程度抑制作用，而丹参和冰片对12种亚型有不同的诱导或者抑制作用，从结果来看，初步揣测出对CYPs抑制作用的奉献度主要来自三七，而对其有诱导作用的奉献度主要来自丹参和冰片。另外，配伍后，复方丹参方全方对心脏CYPsmRNA表示出影响弱于方中各单药对心脏CYPs的影响，显示复方对心脏CYPs影响可能是各单味药作用的综合和叠加。 复方丹参方及其单味药的成分复杂，对大鼠心脏CYPs酶不同的亚型有不同程度的诱导或者抑制作用，而不同的亚型对心脏血管有不同的收缩或者舒张作用，复方丹参方及其单药对心脏有一定的保卫作用，并且其保卫可能是双向的调节作用，以到达机体的平衡。图标略