Notch信号通路对小鼠胚胎干细胞向神经分化无影响,神经生物学论文.docx

《Notch信号通路对小鼠胚胎干细胞向神经分化无影响,神经生物学论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Notch信号通路对小鼠胚胎干细胞向神经分化无影响,神经生物学论文.docx（8页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、Notch信号通路对小鼠胚胎干细胞向神经分化无影响,神经生物学论文Notch 信号通路在生物进化中具有高度保守性，介入生物体内诸多重要生命经过，如细胞的增殖、分化、存活、凋亡等 蛋白 O-连接岩藻糖基转移酶 1( protein O-fucosyltransferase 1，Pofut1) 介入 Notch 受体蛋白中蛋白-O-连接岩藻寡糖的合成，Pofut1 基因缺失使得 Notch 受体蛋白构造发生改变而无法与相应配体结合，导致 Notch 信号无法传递在哺乳动物中 Notch 有 4 种受体( Notch1，2，3，4) 、2 种 Jagged 配体( Jagged1，2) 和 3 种

2、Delta 配体( Delta1，3，4) Notch 信号分子与相邻细胞外表配体结合，激活 ADAM 蛋白酶( A distintegrin andmetalloprotease) 使之水解，产生 Notch 的胞外区，在 分泌酶复合体介导下，释放 Notch 蛋白的可溶性胞内区( Notch intracellular domain，NICD) 并转 移 至 核 内，与 转 录 抑 制 因 子 CSL ( CBFl/Suppresor of Hairless / Lag1 ) 结合，诱导其下游靶基因如 Hes1、Hes5 等的表示出 有 研究证实，在胚胎干细胞、神经干细胞向神经细胞分化经过

3、中，Notch 信号转导通路的活化状态对细胞分化经过发挥重要作用本研究应用 Pofut1 基因敲除小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为神经细胞，研究 Notch 信号通路对小鼠胚胎干细胞向神经分化的影响 结果表示清楚，Notch 信号传递能力缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响，但对拟胚体的构成和向神经细胞分化起到促进作用 1 材料与方式方法 1. 1 材料 Pofut1 基因敲除胚胎干细胞 ( ESC) 和对照的野生型 ESC，以及饲养层 SNL2 细胞由美国爱因斯坦医学院 Pamela Stanley 教授惠赠 低粘附的 6 孔培养板( Cat #3471) 购自 Stem Cell 公司; 逆转录

4、试剂盒购自 TaKaRa 公司; 实时定量 PCR 试剂盒购自MJ 公司; 全反式维甲酸购自 Sigma 公司 抗 O4、GFAP ( glial fibrillary acidic protein ) 和 NFM( neurofilament medium) 单克隆抗体购自 Chemicon公司; 驴抗兔、抗山羊 IgG 购自 Jackson Immunology公司 其余用于 ESC 分化的常规培养用器材购自BD 公司 1. 2 细胞培养 饲养层细胞常规培养于含 10% 胎牛血清的DMEM 培养基中，将 3 105细胞铺在 10 cm 培养皿中进行培养 胚胎干细胞常规培养在铺有单层饲养层细

5、胞的培养皿中，培养基为含 10% 胎牛血清、1000U LIF / mL 的 DMEM，于 37 培养 1. 3 拟胚体的构成和神经细胞的分化 胚胎干细胞经胰酶消化成单细胞，并重新悬浮于 EB( embryoid body) 培养基( 含15% EB 级胎牛血清的 DMEM) ，以 5 104细胞接种于低粘附的 6 孔板中，应用 RA 4+4 悬浮培养 8 d 以构成拟胚体，前 4 d 培养基中含 5 107细胞全反式维甲酸，后 4 d 去除维甲酸 EB 继续在预先包被 poly-L-ornithine / laminin 的细胞培养板中继续培养 8 d，使EB 分化构成神经细胞，并于显微镜下

6、观察分化细胞的形态 1. 4 细胞免疫组化染色 用预先包被 poly-L-ornithine/laminin 的盖玻片培养生长分化的细胞，经 4% 多聚甲醛固定 30 min，0. 5% Triton X-100 / PBS 室温处理 5 min，参加 1 400兔抗 NFM 抗体，或者1100 羊抗 GFAP 或者1500 羊抗 O4 抗体，于 4孵育过夜，经 PBS 清洗 3 次，参加荧光标记( FITC 或者罗丹明) 1100 驴抗 IgG，37 孵育1 h，PBS 清洗 3 次，100 g/mL DAPI 染色 1 h，水洗后，以 Anti-fade goldTMmount Mediu

7、m 封片 1. 5 Real-time PCR 分析 用 Trizol 提取细胞总 RNA，根据 TaKaRa 反转录试剂盒操作讲明进行 cDNA 第一链合成，并以此为模板，进行实时定量 PCR 检测基因表示出，引物序列见 Table 1，根据操作讲明书进行 PCR 反响程序:95 预变性 30 s，95 变性 5 s，60 退火 30 s，共 45个循环 基因相对表示出量应用 2 Ct法计算，以GAPDH 作为内参基因 1. 6 统计分析本文统计分析 采用 Student s t 检验，使用GraphPad Prism 软件进行分析 2 结果 2. 1 Pofut1 缺失对 ES 细胞生长的

8、影响 研究表示清楚，Pofut1 负责催化 Notch 家族分子( 包括 Notch1 4) 细胞外段的 O-岩藻糖化，该基因的突变将导致 Notch 家族所有成员均无法与相应配体结合，进而不能启动和传递 Notch 信号 因而，Pofut1 基因敲除小鼠表型比单一 Notch 分子敲除小鼠更为严重 本文首先分析了 Notch 信号缺失对ES 细胞增殖的影响，Fig 1 结果显示，与对照组相比，在 Notch 信号缺失时，体外培养 ES 细胞本身的生长未见明显影响 2. 2 Pofut1 缺乏对拟胚体构成的影响 拟胚体的构成是 ES 细胞体外分化的必经经过，拟胚体在构造上能够模拟早期胚胎发育经

9、过，包括在内细胞团外表构成内胚层、柱状上皮细胞的分化，以及空腔的构成 Notch 信号缺失的 ES细胞构成的拟胚体( EB) 数量增加( Fig 2A) ，并且构成的 EB 体积增大，形状相对不规则，且大小不均一( Fig 2B) 2. 3 Pofut1 缺乏对神经细胞纤维的影响 经过维甲酸( RA) 诱导后的拟胚体在铺有 poly-L-ornithine / laminin 的培养皿中继续分化，部分贴壁生长的 EB 向外生长分化为具有分支的神经样细胞团，见 Fig 3B D，缺乏 Notch 信号的 EB 与正常对照的 EB 相比，产生具有神经样的细胞明显比对照组多( Fig 3E) ，表示

10、清楚 Notch 信号缺失有助于 ES 细胞经过 EB 向神经细胞分化 2. 4 Pofut1 缺乏对神经细胞标志分子的影响 为确认 Notch 信号传递系统对神经细胞分化的影响，应用神经细胞特异性的单克隆抗体，对贴壁生长的分化细胞进行免疫组化染色，结果如 Fig 4 抗神经纤维( neurofilament medium，NFM) 单克隆抗体在突变的 ES 分化细胞中被标记，神经纤维明显长于对 照 组; 星 形 胶 质 细 胞 标 记 物 GFAP ( glialfibrillary acidic protein) 和少突胶质细胞标记分子 O4的免疫组化结果表示清楚，在突变 EB 分化的神经

11、细胞中的表示出强于对照组 2. 5 Pofut1 缺乏对神经分化经过中 Notch 靶基因表示出的影响 进一步应用实时定量 RT-PCR 分析了 Notch信号缺失对靶基因 Hes1 表示出的影响 如 Fig 5 结果显示，无论在 ES 向神经分化前或后，Pofut1 基因表示出缺失对 Notch1 基因本身的表示出均没有明显影响; 在 ES 细胞分化前，Pofut1 缺失与对照组相比靶基因 Hes1 的表示出未见差异不同，但在 ES 分化后，Pofut1 缺失组 Hes1 基因的表示出则明显下降( P 0. 01) 3 讨论 Notch 信号系统几乎牵涉所有细胞的增殖和分化活动，普遍达到胚胎

12、发育期的各种组织及各种成熟组织中未分化并具有增殖能力的细胞，是影响细胞命运的保守而重要的信号通路之一 研究表示清楚，Notch 信号系统激活能抑制胚胎干细胞的分化，当Notch 与其配体结合后胚胎干细胞进行增殖，当Notch 活性被抑制时，干细胞进入分化程序，进而发育为功能细胞 Notch 受 体 胞 外 段 的 EGF ( epidemic growthfactor) 重复序列能被 Pofut1 所修饰 Pofut1 基因敲除小鼠具有其体内所有 Notch 信号通路被阻断的特点，并导致其体内全部 Notch 受体信号失活的表型 本文应用 Pofut1 基因敲除的 ES 细胞，讨论了 Notc

13、h 对 ES 细胞向神经分化的影响 结果表示清楚，Notch 信号缺失不影响 ES 细胞的增殖 但在诱导神经分化经过中促进拟胚体数量增加、体积增大; 分化后 Notch 信号缺失的 ES 细胞产生的神经样细胞明显增加，且神经细胞标志物如 NFM、GFAP 以及 O4等的表示出明显增加，讲明 Notch 信号缺失能够促进ES 细胞经 EB 向神经的分化 基因表示出分析表示清楚，在 Pofut1 缺失的分化细胞中，Notch1 表示出没有明显变化，但其下游靶基因 Hes1 转录水平明显降低，讲明 Pofut1 缺失不影响 Notch 基因本身的表示出但抑制Notch 下游靶基因的表示出 曾有研究结

14、果以为，在哺乳动物 ES 细胞中缺失 Pofut1 后，其细胞外表仍然具有与野生型一样水平的 Notch 受体，但是其不能与 Notch 配体相结合，并使 Notch 信号通路全部被阻断 这与本文利用 real-time PCR 检测 ES、EB 细胞中 Notch1 和 Hes1转录水平结果一致 某些研究显示，Notch 信号对于神经轴突抑制生长和维护具有重要作用 Sestan等和 Berezovska 等证实，激活 Notch 能够抑制神经轴突的生长或使神经轴突萎缩，而抑制 Notch1信号能够促进神经轴突的延伸 Tanigaki 等利用逆转录病毒将活化的 Notch1 和 Notch3

15、转入大鼠海马区，发现少突胶质细胞则减少 同时，Sdrulla等发现，在视神经中 Notch 也能够抑制少突胶质细胞分化的发生 本文结果表示清楚，在 EB 向神经分化经过中少突胶质细胞在 Notch 信号缺失下明显多于对照组，这与上述研究结果相符 Ramasamy 等研究表示清楚，在维持 ES 细胞生长经过中 Notch 不是必需的，这与本文在 Notch 信号缺失时不影响 ES 细胞本身生长的结论相符 Notch 信号通路在细胞分化经过中具有重要作用 大量研究表示清楚，Notch 信号通路在神经分化经过中具有多效性，其详细机制仍不特别明确，它的旁侧抑制方式可能是华而不实机制之一 对于 Notch 信号通路对于 ES 细胞向神经分化调控的研究较少，所以本文对该方面进行了初步讨论，这为进一步研究奠定了基础【文图.表.均略】