无血清培养基在CHO细胞培养中的应用进展,细胞生物学论文.docx

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1、无血清培养基在CHO细胞培养中的应用进展,细胞生物学论文随着生物技术的飞速发展，单克隆抗体、细胞因子、疫苗和各种生物活性蛋白等生物制品在诊断和治疗中应用日益广泛，其需求量大大增加，因而，通过体外大规模培养动物细胞生产生物制品技术的研究越来越遭到青睐。 CHO 细胞是生产蛋白类生物制品最重要的表示出系统，采用无血清培养 CHO 细胞相比含血清培养，能避免对实验动物的伤害、潜在的污染源影响、不同批次血清间的生物活性和因子的不一致及价格高等众多弊端，因此遭到生物制药领域的广泛关注。 1 CHO细胞 CHO 细胞即中国仓鼠卵巢 细胞 Chinese Hamster Ovary Cell，是最具代表性的

2、动物细胞表示出系统，被广泛应用于生物制药领域。 它建株于 1957 年，由美国科罗拉多大学 Theodore T. Puck 从一成年雌性中国仓鼠卵巢中分离得到，是一种连续细胞系，能传百代以上，具有永生性。 后来陆续又有很多科学家用药物加压、极端条件挑选和诱导突变等方式方法挑选得到了一系列不同表型的 CHO 细胞株1,如 DUKX-B11、DG-44 和 CHO-K1 等。 CHO 细胞能用于表示出各种复杂的重组蛋白。 据统计，70%以上的动物细胞表示出药物产品都是以 CHO 细胞为表示出宿主2. 2018 年 6 月批准的 27 种单克隆抗体中，华而不实 13 种就是通过 CHO 细胞表示出

3、的，占了约 50%的比例。 CHO 细胞之所以成为最受欢迎的宿主细胞， 主要在于其易于培养以及基因操作，而且相比其他表示出系统，它还具有很多优点3-4:具有准确的转录后修饰功能，表示出的糖基化药物蛋白在分子构造、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；具有外源重组基因的高效扩增和表示出能力；既可贴壁生长可以以进行悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和浸透压能力，外源蛋白表示出水平较高；CHO 细胞属于成纤维细胞，很少分泌本身的内源蛋白，利于外源蛋白的后分离。 2无血清培养基 无血清培养基是继天然培养基、 合成培养基之后的第三类培养基。 与传统的培养基

4、相比，无血清培养基不含动物血清或其他动物提取成分，但仍可知足细胞在体外较长时间生长、繁衍的一种培养基。无血清培养基由基础培养基和添加组分两部分组成。基础培养基含有各种营养物质，能维持组织或细胞的生长、发育、遗传、繁衍等一系列生命活动。 当前应用最广泛的是 MEM、DMEM、RPMI1640 等。 添加组分为各种代替血清的因子总称，主要包括促贴壁物质、生长因子与激素、酶抑制剂、结合蛋白以及微量元素等几大类。 这些因子既能知足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的众多不利因素5-6. 3无血清培养CHO细胞的研究进展 随着生物制品的需求加大以及无血清培养基众多优势，越来越多的生物制药公司开场

5、采用无血清培养基培养 CHO 细胞， 研制合适于CHO 细胞生长和产物表示出的低成本无血清培养基是生物制药领域关注的热门。 3.1 无血清培养基成分研究 无血清培养基的成分相比照较清楚，人们可根据培养目的及细胞种类的不同，对培养基成分进行调整优化，以到达更好地培养目的。 研究证明，在无血清培养基中添加蛋白水解物能够提高最大细胞密度和生产效率。酵母水解物可作为一种低成本的无血清培养基添加物，用以成产人血小板生成素hTPO7. 大豆水解物能较好地支持细胞生长和维持细胞活性8. Ballez 等9 研发出一种培养 CHO-320 细胞生产 IFN 的无蛋白培养基，该培养基中添加了大米水解物，最终最大

6、细胞密度能提高 25%,IFN 浓度能提高 60%. 还有研究评价激素、 脂类及微量元素等成分对无血清培养 CHO细胞的影响。 赵丽丽等10以表示出重组 TNFR-Fc 融合蛋白的 CHOK1 细胞为研究对象，确定大豆蛋白水解物和酵母提取物的混合物、地塞米松及脂肪乳剂这几种关键组分对培养基的影响，为合适于细胞生长和产物表示出的低成本无血清培养基的研制提供了参考。 张大鹤等11研制出两种适于重组 CHO-K1 细胞培养的无血清培养基。 微量元素完全能够替换无血清培养基中的蛋白，支持细胞生长和促进蛋白表示出。 通过优化调整其他营养物质，去除蛋白水解物，且不需添加任何小肽化合物后，仍能支持高密度的

7、CHO 细胞培养。 添加氨基酸有利于维持细胞活性与抗体合成； 添加 B 族维生素能促进细胞生长并延长培养时间；葡萄糖浓度较高时会抑制细胞生长，而浓度较低时又不能有效支持细胞的生长与抗体的合成， 因而需要维持适当的浓度。 通过合理调整这几类营养物的浓度配比构成的优化无蛋白培养基，可使培养的 CHO 细胞最高密度到达 52.6 105cells/mL,抗体产量到达 274mg/L,与初始培养基相比分别提高了 33%和 63%12. 通过对无血清培养基成分的适当调整和改良，能够实现对某一类细胞或细胞产物快速、专一的培养目的，怎样将这些改良应用到大规模生产中还需要进一步的研究。 3.2 适用于悬浮培养

8、的无血清培养基 悬浮培养是哺乳动物细胞大规模培养研究和应用的重要形式和首要选择13-14. CHO 细胞为贴壁依靠性细胞，进行悬浮培养面临 的最大问题就是细胞易集结成团使得细胞生长缓慢，且细胞团细胞因营养缺乏而容易凋亡。对于 CHO 细胞的悬浮培养而言，培养基是影响细胞生长和目的表示出产物生产的最重要因素之一。 当前已有适于CHO 细胞大规模悬浮培养的商业化无血清培养基，但存在成分复杂、不明确及知识产权问题，影响培养基的进一步优化，且价格昂贵成本高，因而开发基于悬浮培养工艺的个性化无血清培养基至关重要。 研究发现腐胺、 胰岛素及转铁蛋白对 11G-S 细胞的悬浮培养具有明显的生长促进作用，刘兴

9、茂等15选择商业化的 DMEM/F12 11, V/V 为无血清培养的基础培养基，并选取了腐胺、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、 -巯基乙醇等常用添加剂，得到 SFM-CHO-S 无血清培养基，培养效果优于商品化的同类无血清培养基。 郭纪元16从 CHO 细胞培养基库中挑选得到无血清基础培养基 BM, 在这里基础上调整酵母水解物、硫酸葡聚糖、柠檬酸铁及起始葡萄糖与氨代谢相关氨基酸浓度，获得其个性化无血清培养基 Opti-BM,并研发得到相应的流加悬浮培养基 FM 与 FM plus.孙亚婷17研制出 PFIA 无血清无蛋白培养基，比 HyQ 和 Ex-302两种商业无血清培养基效果好， 可作为后续流

10、加培养的初始培养基。 谢奎18获得自主知识产权的无血清培养基，经历体验证蛋白表示出结果优于商业化培养基 CD DG44,接近商业培养基 P8,且成本节约一半以上。 Zhang 等19以表 达重组 TNFR-Fc 融合 蛋白的 CHO-GS 细胞 为研究对象，以 DMEM:F12:RPMI16402:1:1为基础培养基，通过调整添加氨基酸、胰岛素、转运蛋白及 Pluronic F68,并结合流加培养工艺，研制出合适 CHO 悬浮培养的无血清培养基。 4结束语 随着重组蛋白、单克隆抗体及病毒疫苗需求量的加大，动物细胞无血清培养基的研究越来越多，也获得很大进展。 随着对细胞营养与代谢、细胞周期、细胞

11、凋亡、信号转导以及外源蛋白表示出机制等各方面机理的深切进入研究，以及蛋白质组学和代谢组学技术20在细胞培养基设计和研究上的应用，必将为进一步推进哺乳动物细胞无血清培养基的开发，进而使细胞培养技术在生物制备、基因工程、细胞移植等领域得到更安全、更低成本和更广泛的应用。 【以下为参考文献】 1Lee JH,Kim YG,?Lee GM. Effect of Bcl-xL overexpression on sialylation of Fc-fusion protein in recombinant Chinese hamster ovary cell cultures J. Biotechnol

12、Prog, 2021, 314： 1133-1136. 2Jayapal KP, Wlaschin KF, Yap MGS, et al. Recombinant protein therapeuticsfrom CHO cells-20 years and counting J. Chemical Engineering Progress, 2007,10310： 40-47. 3Ballez JS, Mols J, Burteau C, et al. Plant protein hydrolysates support CHO -320 cells proliferation and recombinant IFN-gamma production in suspension andinside microcarriers in protein-free media J. Cytotechnology, 2004, 44 3： 103-114.