蛋白质与纳米金颗粒的相互作用分析,生物化学论文.docx

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1、蛋白质与纳米金颗粒的相互作用分析,生物化学论文随着纳米科技的飞速发展，人们对纳米材料的研究也越来越深切进入。纳米材料由于其粒径大小的特异性，具有独特的物理及化学性质，例如大的比外表积、量子效应以及界面效应等Zhuetal.,2020，使其在工业、科学技术及生物医学等领域均有广泛的关注及应用，现已经成为全世界各国发展最快的科学及技术开发领域之一。纳米金颗粒AuNPs是研究最早的纳米材料之一，也是研究的热门之一Prashantetal.,2007。AuNPs除了具有良好的生物相容性、强的稳定性、高电子密度和催化作用等性质之外，还有很多独特和具有吸引力的特性：例如良好的导电性、尺寸依靠性、光学性、无

2、毒等特点Shietal.,2020，这使得AuNPs在催化、医药和生物传感等方面展现了卓越的应用前景，也使得AuNPs成为了解纳米材料与蛋白质互相作用的自然起点Evertsetal.,2006。最近几年来，两亲性聚合物AP包裹的AuNPs得到了人们的广泛关注。由于AP包裹的AuNPs既能够在有机相可以以在水溶液中存在。这一特点拓宽了AuNPs的研究领域。如今功能化的纳米颗粒已经在常见重大疾病如心脑血管疾病、癌症、糖尿病陈尔飞等，2020的治疗中得到了应用。蛋白质是具有非常复杂的多层次的三维构象，这种高度复杂的三维构象是使得蛋白质具有生物活性和免疫活性的重要保证。当蛋白质与纳米颗粒互相作用时，会

3、在不同程度上来扰乱蛋白质的构象。相反，蛋白质与金颗粒互相作用时，由于蛋白质结合在金颗粒的外表，会对AuNPs的光学性质及其稳定性造成影响Goleetal.,2001，同时可以能会影响AuNPs预先设计的功能。因而对于AuNPs与蛋白质互相作用机制的深切进入理解与研究，对高效利用功能化纳米颗粒在生物体内充分发挥作用理论基础。牛血清蛋白BSA是研究得最为广泛的一种生物体内的蛋白。人们已经对BSA的氨基酸序列及其空间构造进行了透彻的分析。而且BSA在很多重要的生理功能中起着重要的作用，并且能够很容易的使其构造和构象发生改变。AP-AuNPs与BSA的生物连接所构成的复合物AuNPs-BSA已作为细胞

4、内的载体和显像剂得到广泛的应用Jeyachandranetal.,2018。因而，我们选用BSA为研究模型，来研究蛋白质与AuNPs的互相作用。1结果与分析1.1BSA与AP-AuNPs的物理吸附结果电泳检测蛋白质能够通过物理作用吸附在纳米颗粒外表。从图1能够看出，从左至右，随着BSA浓度的增加，BSA与AP-AuNPs的吸附量也随之增加。通过与纯的AP-AuNPs相比拟我们以为，图中与AP-AuNPs在同一水平位置的条带为没有吸附上BSA的AP-AuNPs,图中微滞后的条带为吸附上一条BSA的AP-AuNPs.选取吸附1个BSA的样品进行分析。1.2蛋白酶K酶切AuNPs-BSA的电泳检测结

5、果本文中选取蛋白酶KproteinaseK,ProK对吸附在AP-AuNPs外表的BSA进行酶切。与AP-AuN-Ps-BSA相比照，随着ProK浓度的增加，AP-AuNPs-BSA的迁移率逐步的增大，但最终还是小于AP-Au-NPs的迁移率，讲明吸附结合在AP-AuNPs外表的BSA片段随着ProK浓度的增加而减少，但是还是有部分BSA的片段吸附在AP-AuNPs的外表，没有遭到ProK的酶切图2。1.3SDS洗脱及吸附在AP-AuNPs外表肽段的PAGE胶鉴定十二烷基硫酸钠SDS是一种阴离子外表活性剂。用10%的SDS对AP-AuNPs-BSA酶进行处理。通过2%的琼脂糖凝胶电泳我们看出，

6、10%的SDS能够将吸附在AP-AuNPs外表的蛋白片段洗脱下来图3A。然后将洗脱后的样品进行SDS-丙烯酰胺PAGE凝胶电泳，来对洗脱下来的蛋白多肽片段进行鉴定。从图3B中我们能够看出，经过SDS洗脱的后的样品中，在分子量约26kD处，有一条带出现，经与其它的样品比拟，我们以为，该条带则为吸附在AP-AuNPs外表的BSA片段。2讨论本实验选取BSA与AP-AuNPs通过简单的物理吸附作用结合在一起，通过琼脂糖凝胶电泳结果能够看出，BSA能够稳定地吸附在AP-AuNPs的外表。在经过蛋白酶K酶切的电泳结果能够揣测，BSA稳定的吸附在AP-AuNPs的外表是BSA中的一段氨基酸序列吸附在AP-

7、AuNPs的外表所导致的。在经过SDS洗脱及SDS-PAGE电泳结果证明，BSA与AP-AuNPs是通过BSA的一段固定的多肽序列结合在AP-AuNPs所到导致的。该实验结果的发现，对于功能化的纳米颗粒在生物体内高效、稳定的应用奠定了坚实的基础。3材料与方式方法3.1AP合成AP合成的方式方法参照文献Zhangetal.,2018。扼要概述：称取3.084g15mmol/L的聚异丁烯马来酸酐置于500mL的圆底烧瓶中，2.7g15mmol/L的十二胺干粉溶于100mL的四氢呋喃后与聚异丁烯马来酸酐混合，超声，使得溶液完全澄清。将混合液5560加热、搅拌1h.用旋转蒸发仪将溶液浓缩到3040mL

8、后搅拌、过夜。次日，将溶液完全抽干，参加40mL的氯仿重新溶解。最终得到单元构造浓度Cmononier为0.5mol/L的两性聚合物。3.2有机相AuNPs的合成合成方式方法参照文献Linetal.,2008。扼要描绘叙述：称取2.17g四辛基溴化铵溶于80mL的甲苯中。称取300mg氯金酸溶于25mL的超纯水中。将两者混合至分液漏斗中，稍微震荡后弃水相，将有机相转移到圆底烧瓶中。称取334mg硼氢化钠溶于25mL的超纯水中，并迅速的参加到有机相中，搅拌60min后转移到250mL的分液漏斗中，分别参加NaCl、NaOH洗涤3次，弃水相后在转移到250mL的圆底烧瓶中，磁力搅拌，过夜。参加10

9、mL十二烷硫醇，65水浴加热，搅拌3h.分装在40mL的小瓶中，2000r/min离心5min,收集上清。参加等体积的甲醇，2000r/min离心5min,弃上清，晾干，参加氯仿重新溶解。3.3AP包裹AuNPs包裹的方式方法参照文献Zhangetal.,2018。扼要概述：根据每个AuNP的有效外表积每平方纳米含有200个polymer单元构造比例混合。每个AuNP的有效外表积的计算方式方法为：Aeff=4仔deff2-12,华而不实的deff为油相纳米金颗粒的有效动力学直径。由于AuNP和polymer的体积小，密度大，使得它们在溶液中分布比拟密集。由于氯仿挥发的太快，在进行真空抽气时不能

10、够将polymer均匀的包裹在AuNP外表。在进行包裹时，先参加少量的氯仿有利于将polymer均匀的包裹在AuNP外表，真空抽气直到将氯仿全部抽干。参加适量的SB12缓冲液进行搅拌，直到混合物完全溶解且澄清。这样就将油相的AuNP转移至水相中AP-AuNP。3.4BSA与AP-AuNPs的物理吸附实验取PCR管分别编号110,按表1中比例参加AP-AuNPs与BSA混匀，反响体系为30滋L,缺乏由超纯水补齐。室温下反响30min.3.5经过酶切后AP-AuNPs外表肽段的回收将经过酶切后的样品用高效液相色谱法仪HPLC进行纯化，在紫外检测波长520nm处将样品回收，用超滤管4000r/min离心，浓缩。将浓缩后的样品根据体积比1:1的比例参加10%的SDS,混合静置1h.用5%的浓缩胶、电压20V/cm电泳70min,在用15%的分离胶，电压为60V/cm进行聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE的检测，电泳100min.由于水相纳米金颗粒AP-AuNPs太大以致于不能够进入到胶里，而肽链能够直接进入到胶里进行检测。1;