膜蛋白结构研究方法综述,生物化学论文.docx

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1、膜蛋白结构研究方法综述,生物化学论文膜蛋白是生物膜功能的主要承当者，根据膜蛋白的分布，膜蛋白能够分为三类： 外周膜蛋白、整合膜蛋白和脂锚定蛋白。膜蛋白的功能具有多方面性，有些膜蛋白能够作为载体而将物质转运出细胞；有些膜蛋白是激素或者其他化学物质的专一受体；有些膜蛋白作为专一的酶催化专一的化学反响。因而细胞的很多功能是通过细胞膜上膜蛋白构造的改变来实现的，而研究膜蛋白的构造便成为了研究膜蛋白功能的重要手段。 迄今为止电镜三维重构技术解析蛋白质构造技术主要分为两种： 单颗粒三维重构技术 singleparticle analysis 1,电 子 断 层 三 维 重 构 技 术 electron t

2、omography,ET2,以及基于这两种方式方法的其他方式方法3,4.对于具有全同性或高对称性的蛋白质复合物和病毒，能够在纯化分离后，采用单颗粒三维重构技术获得其三维构造，并可到达 0. 4 nm 或更好的分辨率5 9.但样品重构经过中需要平均大量的分子，因此单颗粒电镜研究方式方法并不适用于非均一构造的蛋白研究，而且蛋白纯化后脱离了完好的细胞环境，不可避免地会发生蛋白构造的改变10.电子断层技术作为一种从材料科学到生物学都行之有效的技术10,11,能够得到微观物体的三维密度分布图。在生物学应用中，电子断层技术旨在接近天然条件下研究具有独特构造的物体的三维形态，能够用来研究不具有全同性的超分子

3、体系和亚细胞体系以及研究膜蛋白在膜上的分布和膜蛋白与膜之间的关系，且电子断层成像技术被以为是用来原位研究膜蛋白构造的唯一方式方法。但断层成像方式方法的分辨率却远低于单颗粒方式方法。因而电镜单颗粒重构和断层成像在构造研究上有很大的互补性，将二者有机的结合起来12,是当前获得生物体系原位高分辨率三维构造很有潜力的研究方式方法。 1 成像原理技术简介 电子断层技术已经成为一种在纳米级分辨率下探寻求索细胞构造的新兴的有效方式方法。能够通过加权背投影方式方法从 2D 投影图像重构出样品的 3D 图像。通过获取同一物体的多个连续角度下的二维投影图反向重构出它的三维构造。简单之，电子断层技术就是将一个样品沿

4、着一个与电子束垂直轴旋转，每旋转一个角度，采集一个物体相对应方向的二维投影图像，通过计算机对这些 2D 图像进行处理，将不同角度的 2D 投影图像反向重构出样品的 3D 构造的技术。 样品电子断层的一个主要特征是分辨率的各向异性，x 轴和 y 轴的分辨率相对较高，而 z 轴的分辨率较差。另一个特征是 ET 的倾斜角范围为 65 70 ,最基本的原因是样品在高倾斜角时，样品的厚度迅速增加，远远超过电子穿透能力。因而会出现高角度投影缺失的现象，这个现象被称为 失踪楔 .由于失踪楔的存在导致 z 轴的分辨率降低。 为了减少失踪楔的影响，数据采集时能够采用双轴倾斜法13,14,第二个倾斜轴垂直于第一个

5、倾斜轴。尽管各向异性不能完全消除，但使信息丢失区域由 失踪楔 减小到 失踪角锥 ,提高了重构后构造的总体质量。 单颗粒方式方法是对分离的，非有序排列的，具有构造均一性的蛋白颗粒进行解析。其所用的原理是通过对一样的生物大分子某方向的投影电子显微图像在空间中进行调整后进行叠加平均，进而提高信噪比，使粒子同部分的构造信息得到加强，最后对各种不同投影方向的单颗粒电子显微图像在三维空间中进行重构，进而获得单颗粒大分子的三维构造信息。 2 制样方式方法 2. 1 CET 的冷冻制样 固然在过去的这么多年中传统制样方式方法已经证明了其在电镜领域的作用，但是在脱水和固定这样的关键步骤上仍然引起人们的关注。这使

6、得在 20世纪 80 年代构成了一种被称为冷冻制样的替代方式方法。在冷冻电镜中，样品仍然维持其含水状态，只是使液态水变成了非冰晶态的玻璃态。在整个实验经过中包括 TEM 成像，样品必须保持低于不透明的水温之下 -135 .在样品的制备中，由于冰晶会毁坏生物构造，所以可利用提高冷却率来阻止冰晶的构成。液体冷冻剂 液体乙烷 能够提供足够的冷却速率来实现水的玻璃化，冷冻深度大约可到达1 m.对一些厚度较大的样品，样品的玻璃化通常需要其他方式实现。最常用的是高压冷冻 HPF 方式方法： 压力在数毫秒之内到达 200 MPa.这种方式方法能够使样品外表下 100 300 m 内实现玻璃化15. 随后玻璃

7、化部分 25 100 nm 必须用冷冻超微切片机切割，并在冷冻电镜下观察，整个经过中样品必须保持在冷冻状态16.聚焦离子束铣削 focused-ion beam milling,FIB 是一种切割超薄切片的方式方法，在削薄冷冻样品中已经表现出其应用，这个方式方法是用聚焦离子去侵蚀样品直到到达所需的厚度17.但在铣削这个经过中大部分样品会丢失。FIB 最大的优势是能够得到足够薄的样品切片且没有由于切割而引起的构造损害。FIB 铣削在那些能够牺牲大部分样品且不影响研究结果的情况下能够取代冷冻切片。 冷冻固定后的样品可以以进行常规处理。冷冻置换 freeze substitute 是在低温下用包含固

8、定液和染色溶液的有机溶剂将冷冻组织的水逐步溶解的一个经过18.然后再进行传统的包埋、切片等步骤。这种方式方法在细致构造的保卫上也有较好效果，而且降低了冷冻切片和冷冻电镜下观察样品带来的技术要求。 2. 2 单颗粒制样 首先用溶剂溶解膜蛋白提取膜蛋白溶液，经太多次纯化后得到高浓度的膜蛋白溶液。快速冷冻制样方式方法是将含有生物大分子样品的溶液分散在含有微孔的碳支撑膜上，利用滤纸吸去多余的液体使得支撑膜外表构成一层非常薄的溶液，然后将其以非常快的速度浸入到被液氮冷却的冷冻剂如液态乙烷中。液态乙烷的高热容保证了样品温度快速下降并防止冰晶的产生，样品中的水构成了一种非晶态的冰，然后样品在低温条件下被送入

9、到冷冻电镜中观察。在样品进入电镜之前为了增加样品对电子的耐受性，样品能够进行负染或者进行冷冻制样。这两种方式方法都有自个的优缺点19,20. 3 三维重构。 3. 1 电子断层成像三维重构 在倾斜图像收集经过，倾斜角度通常到达最大，单轴倾斜角度为 75 的分辨率大约和双轴倾斜角度60 时的分辨率一样。但倾斜角在 60 70 时只要厚度较小的样品才能够使用，由于在高角度时由于样品的厚度迅速地增加导致图像的质量降低。因而在 60 70 时使用双轴倾斜能够提高图像的质量。冷冻样品采样经过是对同一个区域进行照射，而冷冻含水样品存在的一个问题就是对电子敏感性十分高，高通量的电子照射往往损害样品的超微构造

10、。因而为了防止样品细节丢失或者构造的变形，总电子剂量必须控制在 80 100 e-/ 2之下。 三维重构前的第一步是图像的对齐。图像的对齐是通过旋转、转换和放大修正等经过来实现。对齐中最常用方式方法是利用样品中的胶体金或者支持膜来定位，胶体金必须足够大以致于在图像中能清楚明晰看到，理想直径为 10 20 nm.但这也并不是唯一的标准，假如所要检测的蛋白颗粒接近胶体金直径，应该适当地调整胶体金颗粒。对齐经过中所选用的胶体金标记最少应在 8 10 个并且均匀分布在图像中。然而有时很少的胶体金也能产生较好的效果，对齐的准确度通常随着胶体金个数的增加而增加，理想的对齐是每个胶体金都能在整个倾斜系列中被

11、跟踪，但是大多数的对齐程序都能适应部分胶体金的缺失。总之，在对齐经过中，胶体金对于低电子密度图像极其重要，胶体金是倾斜图像跟踪的最明显特征。 分析电子断层重构数据的第一步是分析 z 轴的2D 倾斜图片，这个方向的图片特征愈加明显。体渲染和外表渲染是两种重要的断层数据展示方式方法。体渲染是把立体强度转换成透明值，然后转换成亮度。它的优点是利用了所有的数据，避免了主观分割。 透明化后的缺点来自于样品构造的重叠导致对其构造分析变得很困难。体渲染对于子构造的重构非常有用。而由于外表渲染减小了视觉上的物理差距，因而外表渲染愈加常用一些。 分割是重构数据展示经过中最重要且最耗时的一个经过，包括手动分割、自

12、动分割和半自动分割。最简单的方式方法是手动分割，但手动分割耗时多且主观性较强。半自动分割减少了实验者的工作量，但由于冷冻含水样品的低信噪比和低比照度增加了半自动分割的难度，当前很多软件正在克制这些难点。自动分割是利用密度阈值设置一个外表的等值面。 对于有较好比照度的样品时能够获得较好的效果，但背景较复杂和低比照度的样品时，通常需要设定多个阈值。模板匹配是基于对靶构造了解的基础上对目的进行分割21 23,X 射线晶体学或者单颗粒方式方法能够得到分辨率较高的细致构造，因而结合高分辨率的样品对断层进行分割是一种比拟实用的方式方法。 3. 2 子断层数据的单颗粒三维重构 单颗粒分析由三部分组成，分别为

13、子断层照片的提取，对齐 3D 旋转和转换的应用 和计算平均值。为了方便子断层照片后期的 3D 对齐经过，提取的子断层照片必须以立体的形式呈现。假如所选择的蛋白有一个较长的形状，必须选择一个包含多个膜蛋白的边界框。操作经过必须根据下面步骤进行，对于每一个坐标的三联体，计算左上角且提取子断层照片。在对齐之前，大部分断层照片需要逆转比照度和像素值。在对齐经过中，降低 3D 参考物的影响有： 1 在 3D 对齐经过中使用几种不同的参考直至出现的结果较稳定。 2 挑选的颗粒最好在中心位置。因而 3D 旋转对齐计算出的平均值能够作为下一次 3D 对齐的参考物。在对齐整个子断层照片经过中，为了修正子断层照片

14、的方向和位置需要进行一系列连续的旋转和对齐操作。每次 3D 对齐循环结束后计算出平均值作为下一次循环的参考。如今一些软件都能很好地处理单颗粒的三维对齐经过24 26. 3. 3 单颗粒的三维重构 单颗粒的三维重构主要包括下面几方面： 评估图像； 反差转换函数 contrast transfer function,CTF校正； 颗粒的选择； 2D 分析； 生成初始模型； 模型精修。 1 评估图像。在选择颗粒之前，首先要对图像质量进行初步评估，最少要保证有 30 50 张图像能够使用。尽管低分辨率的重构对散光和漂移的要求并不是很高，但为了避免假象出现，还应该尽量选择高质量的图像。有经历体验的实验者

15、能够根据经历体验直接选择高质量的图片，而客观的评估方式方法能够通过检测每张图片的傅里叶变换参数来进行判定。评估的第一步是观察颗粒在图像中的比照度。颗粒清楚明晰并且互相分离的最好，但不可避免会出现颗粒的重叠； 颗粒不清楚明晰和远离焦点的图像不能使用。 2颗粒的选择。在颗粒选择之前，需要统一调整原始图像平均值和标准差，并且反转图像的比照度。选择颗粒方式方法包括手动选择和半自动选择。在高质量的电镜图片中比照度较高的颗粒至少应在1 000 2 000个之间。 3 2D 分析。在 2D 分析中能够使用初始分析方式方法来挑选或者进一步的缩减样本量，然后再进行颗粒的归类平均，假如效果不好能够重新进行颗粒选择

16、。低分辨率的重构应该保持在2 000 3 000个颗粒，非均一的颗粒应该在5 000个。 4 生成初始模型。有很多方式方法能够生成最初的颗粒模型，而生成初始模型的方式方法也存在很多争议。各种方式方法都有自个的优缺点，但一个模型经过几次细化以后，往往都能生成让我们满意的初始模型。假如一种方式方法并不能得到初始模型，有可能是由于蛋白颗粒中包含不均一的构造。在这种情况下能够考虑使用其他实验方式方法进行验证。 5 模型精修。初始模型生成后，基本重构已完成，但精细模型还是一个耗时较多的经过。在生成低分辨率的三维重构时，能够不进行 CTF 矫正经过，固然会存在一定的扭曲，但并不会影响颗粒的总体构造。如今已

17、经有很多软件包能够完成单颗粒三维重构经过，如EMAN,Direx,Xmipp,Relion,Frealign. 4 瞻望 膜蛋白作为生物蛋白中一种重要的构造蛋白，由于其所具有的重要位置，这些年已成为蛋白构造研究的重要领域。单颗粒方式方法和电子断层成像是研究膜蛋白的两种主要的方式方法，电子断层成像技术与其他的构造分析技术相比，最大的优点是能够对非均质的蛋白复合物、细胞器、细胞以及镶嵌在膜上的膜蛋白原位精细构造研究，被以为是研究原位构造的唯一方式方法。但电子断层成像技术作为一个新兴的学科，还处于发展和完善阶段，无论在理论上还是实践中仍有很多工作需要完成，华而不实自动化数据收集和处理以及提高重构分辨

18、率是电子断层成像两个重要发展方向。单颗粒方式方法主要研究具有全同性或对称性的蛋白构造，其通过大量的平均化能够得到高分辨率的构造蛋白。但由于蛋白脱离细胞环境，其构造和原位构造相比不可避免会发生改变。随着冷冻断层成像技术的不断改善，通过这两种方式方法互相结合的使用，膜蛋白的构造研究将获得一个宏大的进步。 以下为参考文献： 1 Frank J. Single-particle reconstruction of biologicalmacromolecules in electron microscopy-30 yearsJ. Q Rev Biophys,2018,42: 139 -158. 2 L

19、ucic V,Forster F,Baumeister W. Structural studies byelectron tomography: From cells to moleculesJ. AnnuRev Biochem,2005,74: 833 - 865. 3 Bartesaghi A,Subramaniam S. Membrane proteinstructure determination using cryo-electron tomographyand 3D image averaging J. Current Opinion inStructural Biology,2018,19: 402 - 407. 4 Eibauer M,Hoffmann C,Plitzko J M,et al. Unravelingthe structure of membrane proteins in situ by transferfunction corrected cryo-electron tomographyJ. Journalof Structural Biology,2020,180 3 : 488 - 496.