鸟苷酸结合蛋白的分子结构与生物学活性,病毒学论文.docx

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1、鸟苷酸结合蛋白的分子结构与生物学活性,病毒学论文干扰素(interferon,IFN)具有广谱抗病原微生物与抗增殖的生物学效应。干扰素通路的激活能够引发上百个干扰素诱导基因的表示出,进而引发细胞一系列的生物学效应。鸟苷酸三磷酸酶蛋白家族为干扰素诱导的一类蛋白,包括4个亚蛋白家族:MX蛋白亚家族 (Myxovirus-resistant proteins)、VLIG蛋白亚家族(Very large inducible GTPase)、IRG蛋白亚家族(p47immunity-related GTPases)及GBP蛋白家族 (p65 guanylate-binding pro-teins)。干扰

2、素诱导及病原微生物感染都能够诱导这四类蛋白大量表示出。研究表示清楚,MXs蛋白能够抑制多种病毒复制,IRGs和VLIGs具有抑制多种病原微生物的功能。GBPs也被发现广泛地介入着抗病原微生物和抗肿瘤等多种生物学反响。 GBP家族蛋白是分子量约为6567kD,蛋白构造由N端球状GTP酶活性区、C端 调节区及连接N端 与C端的连接区组成。GBPs具 有GTP水解酶活性,能够水解GTP为和GMP。如今已经发现的人类GBP蛋白有7种(hGBP1hGBP7),小鼠GBP蛋白有11种 (mGBP1mGBP11)。GBP1作 为研究最为透彻的一类GBP,已经被报道在机体的多个生物学效应方面发挥着重要功能。

3、1、 GBP1的分子构造与生物学活性 鸟苷酸结合蛋白1(Guanylate-binding protein1,GBP1)为一类发动蛋白,但是GBP1与其他发动蛋白相比具有着不同的特点,其为单体蛋白,能够与GTP、和GMP结合,并且与三者的结合能力一样。GBP1能够通过两个连续的经过将GTP分别水解为和GMP。人类GBP1基因位于1号染色体上,ORF全长为1 779bp。GBP1蛋白由593个氨基酸构成,蛋白分子量为67kD;华而不实1278位为球状GTP酶活性区,279312为连接区,313593位为GTP酶效应区。 hGBP1的181184氨基酸被鉴定为TLRD序列,介入鸟苷酸结合。由于TL

4、RD序列的存在,hGBP1能够水解GTP形 成和GMP,华而不实GMP为主要的水解产物。这与GBP家族中的hGBP2不同,hGBP2可以以将GTP水解为和GMP,但是主要水解产物为。而hGBP1蛋白在法尼基化后与脂质物结合后,其水解特性也会发生变化。 hGBP1在特定的条件下被法尼基化后能够与胞内膜互相作用。细胞在利用铝氟化合物处理后,hGBP1在脂修饰后能够与其他干扰素诱导蛋白一同存在于高尔基体区。研究人员对法尼基化hG-BP1的作用及其与脂质体膜对GTP酶功能的影响进行了研究。为了获得法尼基化的hGBP1,法尼酰基转移酶 和 与hGBP1质粒被同时转染到细菌内进行表示出。法尼基化的hGBP

5、1与未法尼基化的hGBP1能够被显著的分开,进行特性比拟。脂质修饰的hGBP1在*AlFx(模拟转运状态)的存在下能够与脂质体结合,未经脂质修饰的hGBP1即便在具有*AlFx的条件下也不能与脂质体结合。这表示清楚hGBP1与胞膜结合同时需要脂质修饰和转运状态两种条件。经过修饰和未经修饰的hGBP1均具有二聚体化和多聚体化构成的特点和能力。但是在存在有脂质体的环境中,修饰化的hGBP1具有比未修饰的hGBP1两倍高的二聚体构成能力。修饰化的hGBP1与未修饰的hGBP1最高GTP酶活性是一样的。然而在有脂质物存在的情况下,修饰化的hGBP1催化的GMP构成率由85%下降了到30%,这是由于脂质

6、物对hGBP1进行了修饰而改变的。因而脂质修饰或者与脂质膜作用能够改变hGBP1的酶活性,其水解GTP的主要产物将会变为。 基于认识到GMP与均为hGBP1的水解产物,而且在所有的GBP蛋白中GTP结合区域极为保守,因而推论所有的GBP均能够水解GTP同时构成GMP和。但是后期人们发现hGBP5却只能将GTP水解为而不能构成GMP。不同GBP家族蛋白的水解特性见表1。hGBP1具有迅速解离的特点,和其他GTP水解酶相比,其与GTP的亲和力要显著小于其他GTP水解酶 与GTP的亲和力,例如Ras酶和Ga酶。游离的未结合核苷酸状态下的hGBP1晶体构造已经被解析出来。在hGBP1的N端具有一个致密

7、的球形LG构造域。 LG构造域之后为狭长延伸的 螺旋。 LG构造域与C末端通过一个 螺旋和两个 折叠的短的中间区连接在一起。 螺旋构造域能够被分为两个 螺旋亚构造域。5个 螺旋依次位于LG构造域的远侧。这些 螺旋通过一个转角区使得 12螺旋构造域重复靠近LG区。hGBP1整体构造类似棒状,蛋白长度约为130。hGBP1构造示意图见图1。 对游离状态下不与GTP结合的hGBP1构造解析完成后,研究人员进一步对与GTP结合状态下的hGBP1构造进行了研究。hGBP1与GTP类似物GppNHp(5 -鸟苷酰亚氨基二磷酸)在共存状态下,hGBP1的构造具有了新的特点,固然其Mg2+配位方位和P环方位与

8、Ras及异源三聚体G蛋白类似,但是其与鸟苷酸基团的结合的方位和角度则与Ras等蛋白截然不同。其他的GTP酶中的N端鸟苷酸糖苷键均具有一致保守的角度,而hGBP1则与这些GTP酶不同。 2、 hGBP1抗病原微生物的特性 型干扰素在抑制多类病毒的复制经过中发挥着重要功能,型干扰素则在发挥抗胞内菌和寄生虫方面发挥着不可缺少的作用。IFN- 、IFN- 、IFN- 、IL1 、IL1 、TNF- 和LPS均能够诱导GBP1的表示出。而这些细胞因子均在宿主抗病原微生物中发挥着重要作用。因此深切进入研究GBP1能否介入宿主抵御病原微生物感染由此开展开来。 hGBP1最早被报道具有抑制负链RNA弹状病毒水

9、泡性口炎病毒(VSV)及正链小RNA病毒科的脑心肌炎病毒(EMCV)。而小鼠的GBP1(mGBP1)也被发现具有同样的抗病毒效应。介于hGBP1的具有抗病毒效力,其被以为是一个重要的干扰素诱导蛋白。过表示出hGBP1,能够显著抑制丙肝病毒(HCV)复制子的复制,抑制效率能够到达40%。而且HCV复制子在Huh7细胞中复制时能够抑制hGBP1的酶活性。 hGBP1在HEK-293T细胞中能够与HCV NS5B直接结合,HCV NS5B与hGBP1的结合直接抑制了hGBP1的酶活性,这或许是HCV拮抗hGBP1所发挥的抗病毒能力的一种表现,但是hGBP1详细怎样发挥抑制HCV的机制仍不是很清楚。G

10、BP1同时被报道具有抑制柯萨奇病毒、流感病毒和登革热病毒复制的能力。我们前期研究发现,流感病毒的感染能够显著引发hG-BP1的表示出,hGBP1过表示出能够抑制流感病毒的复制,而GBP1的GTPase活性是其发挥抗流感所必需的。流感病毒NS1蛋白能够与hGBP1蛋白相结合,抑制GTPase活性,进而拮抗hGBP1介导的抗病毒能力。登革热病毒感染经过中,GBP1同样大量表示出沉默下调表示出GBP1后,登革热病毒在细胞内的复制能力显著上升,而且NF B的活性显著下降,GBP1可能是通过影响NF B的活性而发挥着重要的抗病毒作用。这些结果表示清楚GBP1能够通过不同方式发挥抗病毒作用,在不同病毒感染

11、经过中机制可能不同,而其GTPase在其发挥抗病毒作用经过中具有重要意义。 hGBP1的抗病毒能力是当下研究的一个热门,其在抗细菌和寄生虫以及衣原体方面的研究也同样获得了很大的发现。hGBP1被报道具有抑制单核细胞增生李氏杆菌复制的能力。单核细胞增生李氏杆菌是一种重要的人畜共患和食源性疾病的病原菌,可引发宿主动物发生脑膜炎、败血症、流产或局部感染等疾病。李氏杆菌主要寄生于宿主细胞为肠内上皮细胞。李氏杆菌在感染经过中首先通过吞噬体进入细胞,为了逃脱溶酶体发挥的杀菌效应,其后续通过特定途径进入细胞质进行复制。而在李氏杆菌复制的经过中,研究同样发现小鼠肝脏和脾脏内的GBP1mRNA的表示出显著升高,

12、而对巨噬细胞进行小RNA干扰下调表示出GBP1后发现李氏杆菌的复制能力显著上升;同样构建GBP1基因缺失小鼠,感染李氏杆菌后,李氏杆菌在GBP1缺失小鼠体内的感染能力及病变情况显著高于GBP1野生型小鼠。这讲明GBP1在介入机体抵御李氏杆菌的经过中发挥着重要的作用。进一步研究发现GBP1发挥抗李氏杆菌的机制是加强氧化杀伤能力及促进运送抗菌肽至自噬体内发挥杀菌效应。而且该机制使得GBP1具有广谱抗胞内菌的能力。 hGBP1同样被发现具有抑制衣原体复制的功能。衣原体是一种在自然界分布广泛的革兰氏阴性专性胞内寄生菌。衣原体中不同的血清型感染宿主时具有不同的特点,有些血清型的衣原体单纯感染眼部组织,有

13、些血清型的衣原体单纯感染生殖系统。衣原体广泛寄生于哺乳动物和鸟类,绝大多数无致病性,仅少数有致病性。致病性衣原体感染可引起沙眼、结膜炎、生殖道系统炎症、不孕不育及肺炎等病症。hGBP1被报道具有抑制衣原体复制的能力,其抑制的机制主要是通过IFN- 诱导hGBP1而发挥效应的。在HeLa细胞内转染过表示出hGBP1后,感染衣原体,结果发现hGBP1分布于衣原体构成的空泡囊膜区域,这种定位并不需要hGBP1的GTP结合区域,而是需要hGBP1的C端 螺旋构造,该构造中包含有与脂质物作用的CaaX位点。 hGBP1和hGBP2均具有抑制衣原体复制的能力,这种抑制能力不需要hGBP1发挥其GTP酶活性

14、。这些发现证明了hGBP1在IFN- 介导的抗衣原体经过中发挥着重要作用。hGBP1还被发现具有抑制刚地弓形虫在胞内生长的特性。刚地弓形虫是一种胞内寄生原生动物,其能够引起人和动物的弓形虫病,可造成孕妇流产、早产、畸胎或死胎,畸胎发生率明显增高。新生儿出生后构成畸形发育及病死率可达12%。 研究发现弓形虫感染小鼠后,能够显著上调mGBP1的表示出。小鼠细胞在感染弓形虫30分钟后,在纳虫空泡附近能够发现大量的GBP1聚集。 ROP16、ROP18和GRA15三种虫体蛋白能够影响mGBP1在纳虫空泡的聚集,GBP1的法尼基化和GTP酶活性在这种聚集经过中并不是必须的,由于GBP1的48位突变和51

15、突变均不影响GBP1的这种定位,而GBP1中仅有15%的GBP1被法尼基化。研究同时发现GBP2和GBP5可以以定位于纳虫空泡附近。GBP1的这种聚集有可能增加了纳虫空泡被细胞吞噬和降解,促进细胞的本身免疫。 3、 GBP1在内皮细胞中发挥的作用 GBP1在内皮细胞中发挥的生物学活性研究引起了很大关注,由于GBP1在内皮细胞的生长分化及细胞迁移等多个生理学经过中发挥着重要功能。 固然GBP1在内皮细胞中发挥着重要作用,但是通常情况下,正常皮肤的内皮细胞中却检测不到GBP1的表示出,只要在皮肤上构成了卡波西氏肉瘤或者皮肤遭到炎性疾病等各类应激后,GBP1的表示出量才会显著上升,如皮肤遭到有害药物

16、刺激或者构成皮肤癣后,皮肤内皮细胞中的GBP1则会大量表示出。介于上述研究结果,研究者提出GBP1能够作为一类皮肤炎性疾病的预警指示分子。 IFN- 处理培养的人脐静脉内皮细胞和表皮微血管内皮细胞时可以以诱导大量的GBP1的表示出。 IFN- 在人脐静脉内皮细胞中诱导GBP1的能力弱于IFN- 对GBP1的诱导能力。利用IFN- 处理人脐静脉内皮细胞5h,GBP1mRNA在诱导2h后开场表示出,然后在5h内不断持续表示出,但是在18h后GBP1的mRNA表示出水平降低到未诱导前的水平。而用IFN- 对人脐静脉内皮细胞处理5h后,GBP1的mRNA持续诱导能力能够持续长达96h。 内源性IFN-

17、 刺激或外源其他刺激能够促进人脐静脉内皮细胞中GBP1的大量表示出,GBP1的大量表示出能够促进脐静脉内皮细胞对血清和生长因子的获得。但是在含有血清和生长因子进行体外培养的脐静脉内皮细胞培养液中参加IFN- 能够促进细胞的衰老。基于以上的研究结果,研究者以为IFN- 的抗血管构成能力是由IFN- 诱导内皮细胞的衰老而导致的,而并非通过诱导细胞凋而发挥抗血管构成能力。 4、 GBP1抗肿瘤构成的能力 鉴于GBP1具有抑制血管构成的能力,以及抑制生长因子诱导的内皮细胞的增殖,而且有研究发如今结肠直肠癌组织中会有大量的GBP1表示出。这暗示了GBP1或许与癌症之间具有一定的联络。而有研究结果证实了这

18、种潜在的联络,证明了GBP1所介导的抗肿瘤构成能力。研究通过对388份结肠直肠癌组织进行了检测,结果发现32%的样品中GBP1都具有大量的表示出,GBP1主要表示出在基质中,而并非主要表示出于癌症细胞中。16.2%GBP1高表示出患者生存时间比GBP1低表示出患者平均可长达5年之久。这预示了GBP1潜在的抗肿瘤能力,因而GBP1或许能够被用来作为结肠癌发生的一种预警信号。 为了进一步研究GBP1与癌症的关系,Karo-line等人将GBP1构建到一个不依靠于IFN诱导的表示出载体中,然后将重组载体转染小鼠乳腺癌细胞(TS/A细胞),通过整合挑选获得了可特异性诱导表示出GBP1的TS/A细胞系。

19、将该特异性诱导GBP1的TS/A细胞系移植入同品系Balb/c小鼠。 结果发现,利用特异性刺激(多 西环素)诱导使GBP1大量表示出后,受体小鼠体内的肿瘤构成明显被抑制,而不加刺激的则很快构成肿瘤。这充分表示清楚了GBP1具有抑制肿瘤构成的能力。免疫组化分析结果证实了受体小鼠体内GBP1的大量表示出。 同时研究发如今GBP1诱导表示出的经过中,浸润淋巴B细胞和T细胞的数量并无明显变化,这表示清楚GBP1介导的肿瘤抑制并不是通过特异性T细胞免疫反响或B细胞免疫反响来完成的。而进一步检测发现GBP1大量表示出组小鼠肿瘤组织内血管内皮生长因子A(VEGF-A)的表示出量显著低于对照组,这表示清楚GB

20、P1或许通过抑制旁分泌的方式抑制肿瘤构成。而因而GBP1也被认定可能是机体先天性抗肿瘤系统中的重要一员。这也讲明IFN- 对肿瘤的抑制有一部分经过可能是通过诱导GBP1表示出来发挥的。 5、 GBP1的其他特性 GBP1除了上述抑制多种病原体复制、抑制弓形虫复制、抑制内皮细胞分化和迁移及抑制肿瘤构成的功能外,还具有一些其他的特性。GBP1具有抑制细胞增殖的能力,GBP1通过促进碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的结合来发挥抑制内皮细胞增殖的作用。这个抑制经过仅依靠hGBP1的C末端 螺旋,而不需要球状GTP结合功能域。GBP1能够抑制内皮细胞基质金属蛋白酶1的表示出。 GBP1或许是IL

21、-1 、TNF- 及IFN- 发挥抑制细胞基质金属蛋白酶1表示出的效应分子。GBP1的GTP酶活性区是其发挥这种抑制能力所必需的。与抑制内皮细胞细胞基质金属蛋白酶1作用一样,在以胶原酶和胶原酶为底物的条件下,表示出GBP1能够显著抑制内皮细胞的迁移。这表示清楚GBP1能够抑制这些细胞的迁移。在高浓度的胶原酶作用下,GBP1高表示出的内皮细胞其向四周的侵袭能力明显下降。 GBP1(D184N)突变体丧失了GTP酶活性,研究发现该突变体的高表示出并不能抑制脐静脉内皮细胞中基质金属蛋白酶1的表示出,而且该位点突变后,GBP1也丧失了抑制血管构成的能力。GBP1还能够抑制脐静脉内皮细胞通过纤连蛋白移动

22、,调节肠上皮细胞屏障功能,保卫细胞不发生凋亡的作用。 6 、结束语与瞻望 GBP1作为一类重要的干扰素诱导蛋白,在宿主细胞内发挥着重要的生物学功能。通过对其抗病毒、抗细菌、抗寄生虫等方面的研究证实其具有广泛抑制外来病原微生物复制的能力。在不同病原微生物的感染经过中,其发挥抗感染作用的机制也不近一样,较为复杂。GBP1能够通过促进氧化杀伤能力、或促进抗病毒或抗菌肽类蛋白进入自噬体内,抑制病原微生物的复制。而通过对GBP1在内皮细胞与肠上皮细胞中的研究,以及通过在小鼠内过表示出GBP1的实验,研究发现了GBP1的抗肿瘤能力。 尤其是通过对388份结肠直肠癌患者组织的分析,表示清楚其在癌症临床表现上

23、具有着重要的指示作用,或许能够被用作为结肠癌发生的一种预警信号。同时,Matthias Hammon等人研究发现GBP1在炎性疾病中,如风湿性免疫疾病中发挥着重要的作用,能够抑制炎性疾病的加剧。因而GBP1可以以作为炎性疾病的一个潜在分子标记。 GBP1在抵抗微生物感染及抑制肿瘤构成中发挥的重要作用,使得其近年来成为了基础研究领域中的一个热门。而其功能的广泛性也使得如今对GBP1的研究越来越深切进入。如今已经对GBP1的功能和特性有了很大的认识和进展(表2)。但是至今对于GBP1详细发挥的抗病毒机制及GBP1与内皮细胞分化和迁移的互相关系和具体机制仍不是十分清楚,有待于进一步深切进入研究。说明GBP1发挥的这些功能机制,或许能够为宿主抗病毒、抗细菌、抗寄生虫以及抗肿瘤药物的研发提供新的视角和方式方法。