对心脏成纤维细胞是否在表型上具有多样性的研究,细胞生物学论文.docx

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1、对心脏成纤维细胞是否在表型上具有多样性的研究,细胞生物学论文Abstract:Objective To explore the multiple phenotypes in cardiac fibroblasts CFs . Methods CFs of neonatal rats were isolated from twelve 1-3-day neonatal SD rats and cultured using combined type I collagenase w/v, 0. 1% trypsin w/v, 0. 25% digestion method. Morphologic

2、al characteristics were observed between primary and subcultured CFs. Common molecular markers for fibroblasts such as vimentin, fibroblast specific protein FSP1 and discoidin domain receptors 2 DDR2 were detected by immunohistochemical staining. Nanog, c-kit, sca-1, CD73 and CD90 recognized as stem

3、 cell markers were evaluated in CFs by immunofluorescence staining, and co-expression of those markers was investigated by three-color immunofluorescence technology. Results By the combined enzyme digestion method, the isolated fibroblasts had large volume. Passage 3 cells exhibited good biological

4、activity, fast proliferation and high purity. Vimentin, FSP1 and DDR2 were all expressed and DDR2 was strongly expressed in CFs. Nanog, c-kit, sca-1, CD73 and CD90 were detected in some CFs. Interestingly, CD73, CD90 and sca-1 were co-expressed with nanog positive CFs respectively and the result sho

5、wed the positive expression rate of nanog+/CD73+was the highest than other three groups 59. 02% 8. 39% . It had significant different P 0. 01 . while the positive rate of nanog+/CD90+in CFs had no different with the rate of nanog+/sca-1+ P 0. 05 . And the rate of nanog+/CD90+and nanog+/sca-1+ had ex

6、tremely significant different with the rate of CD90+/sca-1+ P 0. 01 . But the positive rate of CD90+/sca-1+ was significantly lower than that in the other three groups P 0. 01 . Conclusion CFs have several subpopulations with stem cell characteristics and multiple phenotype. Keyword:Cardiac fibrobla

7、st; Stem cell marker; Cell culture; Immunohistochemical staining; Neonatal rat; 心脏成纤维细胞 cardiac fibroblasts, CFs 占心脏细胞总数的50%70%, 是心肌组织重要的支持细胞， 抗缺氧损伤能力强， 即便是在长期纤维化状态下， 仍具有较高的增殖和代谢活性1.传统观念以为， 成纤维细胞是一群均一的细胞， 在不同的器官组织中， 发挥其支持和分泌功能。最近研究发现， 成纤维细胞具有显着异质性， 表如今细胞形态大小2、增殖特性3, 胶原合成4, 分泌细胞因子和细胞外表受体等5.前期研究发现， 不同

8、器官成纤维细胞在细胞形态、生长增殖和外表受体表示出等方面具有显着异质性， 且成纤维细胞具有间充质干细胞样特性， 表现出多向分化潜能6,7.但CFs能否存在干细胞分子标记的表示出差异， 以及干细胞标记的重叠表示出等， 当前尚鲜见报道。 本研究拟采用体外分离培养技术和免疫细胞化学技术， 讨论CFs表示出干细胞标记nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90及其共表示出情况， 进一步确定CFs的不同亚群， 为进一步开发利用成纤维细胞提供可靠的实验支持， 为组织损伤原位修复提供更丰富的种子细胞来源奠定实验基础。 材料和方式方法 1. 实验材料 13 d SD新生大鼠12只， 体重 7.1 0

9、.31 g, 雌雄不限， 由新乡医学院实验动物中心提供， 动物合格证号：SCXK 豫 2018-0002. 2. 方式方法 2.1 CFs分离培养和传代： 新生大鼠称重后处死， 无菌条件下取心脏， 预冷PBS冲洗， 剔除心房， 大血管和结缔组织， 用眼科剪将组织剪成约1 mm3小块， 参加0.1%胶原酶I Roche公司 和3倍体积的0.125%胰蛋白酶 Sigma公司 , 3710 min, 吸管充分吹打， 上清参加等体积含低糖完全培养基DMEM Hyclone公司 +10%胎牛血清 Hyclone公司 终止消化， 直到组织小块完全消化为止， 1200 r/min离心5 min, 完全培养基

10、重悬沉淀， 接种至25 cm2培养瓶中， 40 min, 弃上清， 参加完全培养。48 h后初次更换完全培养基， 以后每2 d换液， 待细胞汇合约85%时， 胰蛋白酶细胞消化液 含0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA , 37， 2 min, 消化贴壁细胞， 以13接种传代扩大培养， 细胞汇合近70%时， 4%多聚甲醛固定备用。 2.2 细胞免疫组织化学染色： 经固定过的细胞爬片， PBS冲洗， 3%H2O2孵育510 min, PBS冲洗， 山羊血清室温封闭1015 min.分别滴加山羊抗大鼠盘状构造域受体2 discoidin domain receptor 2, DDR2 多克隆抗体

11、1300, 美国Santa Cruz公司 、兔抗大鼠成纤维细胞特异性蛋白1 fibroblast specific protein, FSP1 多克隆抗体 1200, 美国Abcam公司 和兔抗大鼠波形蛋白 vimentin 多克隆抗体 1500, 美国Abcam公司 , 4过夜， PBS冲洗， 滴加相应的生物素化二抗工作液， 37孵育20 min, PBS冲洗， 滴加HRP标记链霉卵白素工作液 S-A/HRP , 室温孵育12 min.空白对照为PBS代替一抗， 其余一样。DAB显色， 苏木素复染细胞核， 自来水返蓝， 光学显微镜下观察， 图像采集和分析。 2.3 细胞免疫荧光染色： 经固定

12、过的细胞爬片， PBS冲洗， 0.3%Triton透膜10 min, PBS浸洗3次， 每次3min.正常山羊血清室温封闭20 min, 分别滴加兔抗大鼠sca-1多克隆抗体 1200, 德国Merck公司 、兔抗大鼠c-kit单克隆抗体 1300, 美国Santa Cruz公司 、兔抗大鼠nanog多克隆抗体 1200, 美国Santa Cruz公司 、小鼠抗大鼠CD90单克隆抗体 1500, 美国Abcam公司 和小鼠抗大鼠CD73单克隆抗体 1300, 美国BD公司 , 4过夜， PBS冲洗， PBS漂洗3次， 每次5 min;滴加相应二抗， 37孵育40 min, PBS漂洗3次， 每

13、次5 min;5 mg/L DAPI室温孵育5 min, 抗荧光淬灭封片剂封片， 荧光显微镜下观察并摄片。空白对照为PBS代替一抗工作液， 其余步骤一样。荧光显微镜下行图像采集。 2.4 细胞免疫荧光三标染色： 经固定过的细胞爬片， 除分组参加一抗 详细分组见表1 外， 其余步骤同上。 2.5 数据统计学处理： 免疫荧光数据均采用SPSS17.0软件进行统计学分析。随机各取30个视野， 按以下公式计算：共表示出率=共表示出细胞数/有核细胞总数。结果以均值 标准差 s 表示， 两样本均数比拟采用独立样本t检验， 多个样本均数的比拟采用单因素方差分析， 检验标准 =0.05, P 0.05为差异有

14、统计学意义。 结果 1.体外培养不同代次CFs形态学比拟 酶联合消化法体外分离培养的CFs活力好， 增殖能力强， 传211代 P2P11 后的CFs增殖能力与原代细胞比拟， 均显示出同样的增殖能力。传代后的CFs, 尽管遭到细胞消化液中酶的作用， 但在增殖期内仍表现出很强的适应性， 增殖能力继续保持稳定。在光学显微镜下观察， CFs形态多样， 大小不一。呈三角形、梭形、星形和多边形， 胞核较小， 双核细胞约占40%, 偶见3核细胞 图1 .57 d细胞铺满培养皿底部， 约有85%CFs聚集， 呈现出漩涡状或放射状分布 图1 .培养7 d后， 细胞大部分穿插重叠， 构成 编织状 外观。 原代 p

15、rimary, P0 CFs细胞边界较为清楚明晰， 折光度好， 但经初次差速贴壁后， 纯度不够， 除CFs外， 还有少量小而圆的心肌干细胞， 内皮细胞， 偶见跳动的心肌细胞。经传代培养后， 成纤维细胞纯度大增。经细胞免疫荧光检测， P0纯度为95%, P1为99%, P2代为99.8%, P3P11CFs纯度到达100%.但从形态上观察， P0P9细胞， 胞核明显， 胞体较大， 有数量不等的短突起， 细胞折光度高， 无自发性搏动。但P10和P11 CFs, 细胞核变形， 染色质分布不均， 胞质所占比例减少， 内有颗粒状分布， 细胞边界愈加模糊不清， 符合细胞衰老的形态学特征。综合考虑， P3P

16、5 CFs是用于后续实验的最佳代次。 2.成纤维细胞常见标记的免疫组织化学表示出鉴定 将分离培养第3代CFs分别行vimentin、DDR2和FSP1细胞免疫组织化学染色， 结果显示， 形态各异的成纤维细胞对这3种成纤维细胞标记物均呈阳性染色 图2 .如此图2 A中所示， 构成细胞骨架的中间纤维蛋白-波形蛋白， 棕黄色颗粒分布于胞质中， 其他部位无非特异性染色；而作为膜受体的DDR2蛋白， 主要分布于胞膜及胞质近膜处， 但也有少部分呈现出胞核分布 图2B , 约有97.5%细胞呈DDR2阳性表示出；FSP1则在胞质中呈均匀分布， 在胞核和胞膜中染色较淡 图2C . 3. CFs的干细胞表示出标

17、记检测 将分离培养第3代CFs经胚胎干细胞标记nanog, 心肌干细胞标记c-kit和sca-1, 间充质干细胞标记CD90和CD73, 及其内皮细胞标记CD31的细胞免疫荧光检测， 发现CFs不表示出CD31 图3F , 而有部分细胞则表示出这五种干细胞标记。c-kit主要表示出于胞膜， 少量分布于胞质 图3A ;nanog主要分布在胞质， 呈强阳性表示出 图3B ;sca-1主要分布于胞核和胞质中 图3C , CD90和CD73主要在胞膜中呈强阳性表示出 图3D, 3E . 4. CFs的干细胞标记共表示出检测 为检测CFs能否存在干细胞标记的共表示出现象， 采取细胞荧光三标技术进行观察分

18、析。结果显示， 部分CFs中nanog分别和CD73、CD90和sca-1存在共表示出 图4 .同时， 对nanog+/CD73+、nanog+/CD90+、nanog+/sca-1+和CD90+/sca-1+共表示出阳性率进行统计分析， 结果显示， nanog+/CD73+共表示出阳性率最高 59.02% 8.39% , 与其他3组相比差异均有极显着性 P 0.01 ;而nanog+/CD90+共表示出CFs阳性率与nanog+/sca-1+之间差异没有显着性 P 0.05 , 但这两组与CD90+/sca-1+相比差异均有极显着性 P 0.01 ;CD90+/sca-1+共表示出CFs阳性

19、率均低于其他3组 29.35% 3.7%vs59.02% 8.39%, 43.55% 3.92%, 43.78% 10.88% , 差异具有极显着意义 P 0.01, 图5 . 讨论 CFs是心脏中数量最丰富的一种间质细胞， 分布广泛， 增殖迅速。其主要功能是合成和分泌细胞外基质 extracellular matrix, ECM , CFs与ECM共同构成复杂而精妙的三维网络构造， 支持并连接心肌细胞， 调节心肌细胞机械、电生理活动， 在心脏正常发育和病理性损伤修复中发挥重要作用8,9. 当前， 成纤维细胞尚缺乏特异性外表标记， 对成纤维细胞的鉴定也存在众多争议。只要确保成纤维细胞鉴定准确后

20、， 才能保证对其研究的精准性。Vimentin是最常见的成纤维细胞分子标记， 但该蛋白可以标记内皮细胞和神经元10;FSP1曾经被以为是成纤维细胞的特异性标记， 但淋巴细胞和肿瘤细胞也呈阳性表示出11;DDR2可以标记成纤维细胞， 但白细胞和肿瘤细胞中也有表示出。有研究显示， 在心脏组织中， 心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中未检测到DDR2表示出12.本研究对体外分离培养新生大鼠CFs, 采用免疫组织化学分别检测vimentin、FSP1和DDR2表示出。根据我们先前的研究以为， 除了根据以上这些标记物作为鉴定成纤维细胞之外， 还应该结合细胞来源、形态、分布等特征进行判定， 比方来自正常心肌组

21、织的成纤维细胞不可能含有肿瘤细胞。另外， 根据细胞的形态特点能够明确地区别于心肌细胞 有横纹 和白细胞等13.综合分析， 本研究采用3种标记综合判定， 挑选出的成纤维细胞纯度是达标的、可信的。 CD90为一种细胞外表黏附分子， 在细胞的黏附、凋亡、增殖和迁移等信号转导中发挥重要作用。有研究证明， 体外分离培养肺成纤维细胞中存在CD90+和CD90-亚群， 它们在炎症反响和纤维化进程中发挥不同作用14.Rege等15证实， CD90+成纤维细胞更易转化为肌成纤维细胞 myofibroblast, MFB .心肌球来源 cardiosphere-derived cells, CDCs 的CD90-

22、细胞在心肌梗死模型中则具有更大的修复潜能16.Ali等17证实， Thy1+、CD45-、CD31-、CD11b-、Ter119-是心肌成纤维细胞中的主要亚群。 C-kit又称CD117, 酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一， 是干细胞因子 stem cell factor, SCF 的受体， 它与SCF结合作为重要的受体配基复合物， 通过激活下游信号分子复合物， 产生强大的连锁反响， 进而在细胞分化、增殖中发挥重要作用18.与c-kit类似， 干细胞抗原1 stem cells antigen-1, sca-1 也是一种造血干细胞标记物， 在调控造血干细胞和c-kit表示出中发挥重要作用1

23、9.移植分离培养心脏sca-1+/CD31-可实现对心肌梗死损伤的有效修复20.nanog是一种胚胎干细胞转录因子， 在维持干细胞多能性中发挥重要作用， 调控基因的转录并保持干细胞的未分化状态21,22.CD73在细胞生长发育、纤维蛋白合成及免疫应答等方面均发挥重要作用23, Boiret等24证实， CD73在细胞增殖方面具有一定的促进作用。前期我们研究发现， 表示出nanog蛋白的心脏成纤维细胞可能更具有干细胞样特性13, 且nanog在CD73+脂肪间充质干细胞 adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs 中呈现强阳性表示出

24、25, 且CD73+ADMSCs具有更强的向心肌分化能力26. 为比拟CFs在干细胞表示出方面差异， 结合我们前期工作基础， 细胞免疫荧光对nanog、c-kit、sca-1、CD90和CD73表示出情况进行分析， sca-1+所占比例最大， 其次为nanog+, 而c-kit、CD90和CD73阳性细胞所占比例下降。为检测CFs能否存在干细胞标记的共表示出现象， 采取细胞荧光三标技术进行观察分析。结果显示， nanog+/CD73+共表示出阳性率最高， 与其他3组相比差异均有极显着性；而nanog+/CD90+共表示出CFs阳性率与nanog+/sca-1+之间差异没有显着性， CD90+/

25、sca-1+共表示出CFs阳性率均低于其他3组， 差异具有极显着意义。固然这些干细胞标记物在成纤维细胞的表示出存在差异， 但足以提示成纤维细胞具有显着的干细胞特性， 且干细胞标记存在重叠性表示出现象， 至于它们在细胞增殖、心肌分化、心肌损伤修复等经过中的详细作用， 有待进一步讨论。 以下为参考文献 1Van Tuyn J, Pijnappels DA, Vries AA, et al.Fibroblasts from human postmyocardial infarction scars acquire properties of cardiomyocytes after transduc

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