一种可同时检测PCV2、PRV、PRRSV的mPCR方法,畜牧兽医论文.docx

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1、一种可同时检测PCV2、PRV、PRRSV的mPCR方法,畜牧兽医论文随着我们国家养猪业向集约化、当代化方向发展,猪 群之间互相接触的几率大大增加,给疾病传播创造了大量的时机。多病原混合感染给疾病的防控带来很大的困难,要想从根本源头上防控疾病传播,需要建立一种快速、准确的诊断方式方法用于病原体的检测。 采用常规病毒分离诊断方式方法固然准确,但费时费力,并且对人员的要求较高。多重PCR(multiplex pol-ymerase chain reaction,mPCR)是在常规PCR基础上发展起来的新技术,在同一个反响体系中参加2对或2对以上引物,分别扩增不同病原微生物的模板,可获得不同的目的片

2、段,这种方式方法既保存了常规PCR方式方法的特异性和敏感性,又减少了操作步骤及试剂用量,能够在同一反响中检测多种病原微生物的特异基因,同时检测鉴别出多种病原体,无论在致病微生物引起的传染病诊断方面,还是在环境中致病微生物的检验领域,mPCR技术都具有较广阔的应用前景。在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和极高的实用价值。猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁衍与呼吸综合征病毒(PRRSV)既和猪繁衍障碍和呼吸道疾病有关,又和猪免疫抑制性疾病相关,它们都能够不同程度地损伤机体的免疫功能,降低机体对外界的抵抗能力,为继发或并发其他病原微生物创造了条件,这可能也是混合感染多发的

3、原因。本研究拟建立一种能够同时检测PCV2、PRV、PRRSV的mPCR方式方法,以期对临床样品进行早期、快速、准确的诊断,为猪病的防制提供科学根据。 1 材料与方式方法 1.1 病毒和细胞PCV2、PRV、PRRSV和PK-15细胞、Marc-145细胞均由沈阳出入境检验检疫局检验检疫局保存。 1.2 主要试剂克隆宿主菌TP10、蛋白酶K购自天根生物工程有限公司。 TRIzol试剂、Taq DNA聚 合 酶、RNase Inhibitor、dNTP、DL2000 DNAMarker、AMV反转录酶、pMD18-T载体DNA提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司;胶回收(小量)试剂盒购自杭州爱

4、思进生物科技有限公司;无水乙醇等分析试剂均为国产分析纯。 1.3 引 物 设 计参 照GenBank登 录 的PCV2、PRV、PRRSV基因组序列,查阅相关文献,借助Oligo 6.0引物设计软件,设计3对特异引物,用于扩增PCV2、PRV、PRRSV目的基因片段,引物的序列见表1。引物由大连宝生物工程有限公司合成,用双蒸水稀释为20mmol/L,-20保存备用。 1.4 临床样品收集收集来自辽宁省的30份猪呼吸道综合征肺脏样品,吉林省50份保育仔猪脾脏和淋逢迎样品,黑龙江省40份断奶仔猪脾脏和淋逢迎样品,山东省50份猪流产胎儿样品,福建省30份保育猪病料。所有样品均提取DNA和RNA,用于

5、多重PCR和单一病毒PCR临床样品的检测。 1.5 样品DNA和总RNA的提取将临床样品利用DNA提取试剂盒(根据天根生化科技有限责任公司生产的DNA提取试剂盒讲明书进行)和RNA提取试剂盒(根据杭州爱思进有限责任公司生产的DNA提取试剂盒讲明书进行)进行核酸提取。将提取的DNA和总RNA于-80保存。 1.6 RT-PCR反响逆转录反响在20 L体系中进行,包括提取 样品 总RNA 5 L,反转 录溶液 50mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、75 mmol/L KCl、3mmol/L MgCl2、10 mmol/L DTT4 L、dNTP 6 L、50pmol/L PRRSV反

6、转录引物1 L、AMV反转录酶(200U/ L)1 L和RNA酶抑制剂(40U/ L)1 L,用DEPC水补足至20 L,42水浴1h,705min。将反转录的cDNA于-20保存。 1.7 PCV2、PRV、PRRSV的PCR扩 增PCV2、PRV、PRRSV的PCR反响在25 L体系中进行,包括10 PCR缓冲液2.5 L,dNTP 2 L,20pmol/L的PCV2、PRV、PRRSV特 异 性 引 物 各1 L,TaqTMDNA聚 合 酶1U,DNA或cDNA模 板 各1 L。反响程序:945min;9445s,55(PCV2、PRRSV、PRV)1min,721min,最后72延伸1

7、0min。取10 L PCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。 1.8 mPCR反响条件的优化及mPCR对mPCR反响条件,包括退火温度(4558),引物浓度(520 mol/L),Mg2+浓度(1.5500mmol/L),dNTP浓度(150500 mol/L),TaqTMDNA聚合酶浓度(0.54U),反响体积(2540 L)进行优化,以确定最佳反响条件。 mPCR反响在50 L反响体系中进行,包括30mmol/L MgCl22.5 L,10 PCR缓冲液(500mmol/LKCl,100mmol/L Tris-HCl,pH 8.3)4 L,2.5mmol/L dNTP 4 1

8、0pmol/L的 特 异 引 物 各0.5 L,TaqTMDNA聚合酶1.5U,PRV、PCV2、PRRSV DNA或cDNA各1 L,用双蒸水补足至50 L。反响条件为:945min;941min,5530s,721min,35个循环;最后72延伸10min。取10 L PCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。 1.9 mPCR的敏感性试验mPCR反响及每种病毒PCR反响的敏感性参照文献的方式方法进行。将提取的病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后,用双蒸水做5倍系列稀释,取每个稀释度的病毒模板进行mPCR反响,同时将经10倍系列稀释的病毒核酸用于单病毒的PCR反响。 1.10 mPC

9、R的特异性试验以猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、PCV2、PPV、PRV、PRRSV、大肠杆菌(E.coli)为模板分别进行mPCR反响。 1.11阳 性 样 品 的mPCR检 测将 已 知 含 有PCV2、PRV、PRRSV的阳性病料,提取病毒核酸,分别进行PCV2、PRV、PRRSV的mPCR反响,PCV2、PRV多重PCR反响、PCV2、PRRSV多重PCR反响以及PRV、PRRSV的mPCR反响,每个反响重复进行3次。 1.12 mPCR对临床样品的检测对来自吉林、辽宁、黑龙江共200份临床样品进行mPCR检测,并且与各自的单PCR同时对这些样品

10、进行重复检测,每个样品均重复检测3次。 2 结果 2.1 PCR产物的鉴定 PCV2、PRV、PRRSV的PCR扩增片段经胶回收连接到pMD18-T载体上,经TP10转化后,送大连宝生物工程有限公司测序,结果表示清楚,扩增片段分别为各自病毒的特异性条带如此图1所示。 2.2 敏感性试验 在mPCR反响中,各种病毒的最低检测量分别为32.5pg(PRV)、25.2pg(PCV2)、35.9pg(PRRSV)(图2)。在单一病毒的PCR反响中,各病毒的最低检测量分别为1.0pg(PCV2)、3.2pg(PRV)、2.5pg(PRRSV)(图3)。 2.3 特 异 性 试 验 CSFV、SIV、PC

11、V1、BVDV、PPV、E.coli均 未 扩 增 出 条 带,而PCV2、PRV、PRRSV均扩增出各自病毒的特异性条带(图4)。 2.4 阳性样品的mPCR检测 各病毒的特异性引物均能很好地扩增出各自病毒的特异性目的条带(图5)。 2.5 mPCR对临床样品的检测 PCV2感染率为80%(160/200),PRV感 染 率 为21%(42/200),PRRSV的感染率为78%(156/200)。200份临床样品主 要 为PCV2和PRRSV混 合 感 染,阳 性 率 达56.0%(112/200);此 外,有14份 样 品 为PRV和PRRSV混合感染,阳性率为7%(14/200)(表2)

12、【表2】 3 讨论 本研究建立的mPCR诊断方式方法能够对临床样品中PCV2、PRV、PRRSV单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定,结果表示清楚,该诊断方式方法敏感性好、特异性高,具有广阔的应用前景。 在mPCR反响中,引物的设计至关重要,它决定着mPCR反响的成功与否。本研究设计的引物是针对3种猪病病毒各自相对保守的基因序列的,它们分别是PCV2ORF2基因、PRV gB基因、PRRSV N基因,这些基因具有高度的保守性,因而能够用作PCR扩增的目的基因。在这3种病毒中,由于PRV属于疱疹病毒科,其(G+C)含量较高,达73%,因而,在设计引物时,将扩增PCV2、PRV、PRRSV这4

13、对引物的(G+C)含量控制在45%60%,这样能确保所有的引物在相近的退火温度进行多重PCR扩增,为成功进行多重PCR反响奠定了基础。 另一方面,在考虑退火温度时,将退火温度调整为55,能让病毒各自的目的条带都得到很好的扩增,结果表示清楚,多重PCR均能够得到很好的扩增,同时避免了引物间的非特异性扩增。建立一种多重PCR诊断方 法 不 是 件 容 易 的 事 情,需 要 对 引 物 浓 度、Mg2+浓度、dNTP浓度等反响条件进行优化,以确定最 佳 反 应 条 件,从 而 建 立 起 检 测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR反响。在对多重PCR敏感性进行分析时,为了更准确地测定多

14、重PCR反响的敏感性,病毒核酸经5倍系列稀释进行多重PCR反响,以测定其核酸最低检测量。同时,将单一病毒PCR的敏感性与病毒多重PCR的敏感性进行比照,结果表示清楚,多重PCR的最低核酸检测量与单一病毒的最低核酸检测量相比,均相应减少了101102个数量级,但仍然具有很强的敏感性,到达了pg级,结果表示清楚,建立的mPCR反响具有很好的敏感性。通过对临床样品进行检测,能够看出,PCV2在猪场中存在普遍感染,这与PCV2的血清学流行病学调查结果相一致。除此之外,PCV2和PRRSV在保育猪中的检出率很高,并且混合感染现象相当严重,这应成为今后猪病防制的重点。 近年来,随着规模化养猪的不断发展,PCV2、PRV、PRRSV对养猪业造成的危害正日益加剧。本研究建立的PCV2、PRV、PRRSV多重PCR诊断方式方法能够快速、准确地对这3种病毒的临床感染样品进行检测,为病原体的诊断提供了一种新的方式方法。【图略】