对银杏转录组学的研究探讨,药学论文.docx

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1、对银杏转录组学的研究探讨,药学论文内容摘要：银杏素有植物界的活化石之称，具有极高的药用价值。为培育高品质的银杏种质及说明其药用成分的生物合成机制，有关银杏的转录组研究不断深切进入。综述最近几年新出现并成功应用于植物转录组学研究的前沿技术，如单细胞转录组测序和空间转录组，并从前沿技术的视角对银杏转录组学的研究进行讨论与瞻望。 本文关键词语：银杏； 转录组学； 单细胞转录组测序； 空间转录组； 综述； Abstract: Ginkgo has long been known as the living fossil of the plant kingdom, with great medicina

2、l value. More and more transcriptome studies about Ginkgo are established to cultivate the Ginkgo germplasm with high quality and elucidate the biosynthesis mechanisms of its medicinal ingredients. Advanced technologies emerging in recent years and successfully applied in plant transcriptomics resea

3、rch are reviewed, such as single cell transcriptome sequencing and spatial transcriptome. And from the perspective of cutting-edge technology, the transcriptomics research of Ginkgo is discussed further with bright expectation. Keyword: Gingko biloba L.; transcriptomics; single cell transcriptome se

4、quencing; spatial transcriptome; review 银杏Ginkgo biloba L.为银杏科银杏属落叶乔木。传统药方记载银杏的药用部位为叶片，多用于治疗哮喘和支气管炎。当代药理研究证明，银杏叶提取物还具有扩张血管、保卫血管内皮组织、调节血脂、抑制血栓构成、去除自由基等成效1,可用于脑卒中、冠状动脉硬化性心脏病稳定型心绞痛等常见疾病的治疗2,3.银杏内酯和银杏黄酮是银杏叶及其提取物的主要药用成分。现行标准规定，银杏叶提取物中黄酮醇苷含量不少于24%、萜内酯含量不少于6%4 .随着银杏叶制剂的广泛应用，怎样培育优质的银杏种质以及银杏提取物的体外生物合成等问题遭到关注

5、。解决这些问题需要对银杏主要活性成分的合成通路以及关键的限速酶、基因功能进行全面解析。 转录组学已逐步成为基因功能研究的重要手段之一5,6,7.在过去的几十年里，RNA分析技术的不断发展也推动着生物学科的更新。当前，RNA转录能够对整个组织甚至是单个细胞进行辨别和量化。银杏作为一种单科单属的高等植物，其细胞直径大于常见的草本植物，这导致部分研究方式方法存在技术屏障；且新型的转录组学研究方式方法一般先用于形式动植物的研究，因而有关银杏的转录组学研究还处于基础阶段8,9,10.本文对新型的转录组学研究方式方法进行综述，并围绕银杏的转录组学研究进行讨论。 1 转录组学 基因组在生物体的生命历程中是相

6、对稳定的，有限的突变可能是DNA复制经过中发生的错配或在某些试剂、辐射作用下造成的。与转录组相比，基因组总体呈现一个稳定的状态。而转录组是指针对特定生理或病理状况下特定类型的细胞或组织表示出的所有种类的RNA及其功能。 转录组学的研究目的是解释某些关键基因的功能，确定基因表示出量的变化11,12,13.1977年，传统的Sanger测序法诞生，标志着基因测序技术成为可能，测序技术从表示出序列标记、微阵列、二代测序发展到如今最新的三代测序14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24.三代测序技术可对RNA进行直接测序，这一优势不但为探寻求索复杂的转录组提供了极大便利，也促进了

7、单细胞转录组测序和空间转录组等新型研究方式方法的发展25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. 2 转录组学前沿研究方式方法 2.1 单细胞转录组测序 当前，利用测序技术对转录方向的研究已经不再局限于组织或器官层面。在多细胞生物中，单个细胞间的差异可能造成同种组织产生深远的功能差异，这为转录组信息提供了一个新的研究维度。单细胞RNA测序scRNA-Seq方式方法旨在从单个细胞层面揭示组织构成、转录动力学和基因之间的调控关系，并且有望重塑当下的细胞分类系统37,38. 2018年，Tang等39研究者最先采用scRNA-Seq方式方法对小鼠囊胚的单个细胞进行无偏倚、

8、高通量和高分辨率的转录分析。首先分离组织，然后分离并捕获单个细胞，每个捕获的细胞都以一个特定的寡核苷酸条形码进行标记，进而使来自不同细胞的RNA均能够从其他细胞中被辨别；随后裂解细胞，再利用体外转录或聚合酶链反响进行逆转录，将扩增后的cDNA片段优化并连接到分子适配器，进而实现高通量测序；最后进行测序并计算分析，以获得细胞类型及其相关的转录组特征。需要注意的是，检测细胞的类型、所使用的捕获方式方法、文库构建和测序的选择、测序深度等均会对实验结果产生影响40,41,因而，特定的实验流程需根据实验需求进行设定。 单细胞转录测序研究多集中于动物细胞及肿瘤疾病方面。利用不同的单细胞转录组测序方式方法能

9、够鉴定细胞类型及其基因表示出形式和细胞功能区域特异性42,43.当前，对动物样本的单细胞转录组测序技术已较为成熟，但由于植物细胞具有细胞壁这一限制条件，要实现单细胞转录组测序还具有一定难度。华中农业大学严建兵团队对减数分裂后的四分体每个小孢子进行测序，实现了玉米的单细胞转录组测序44.该实验在显微镜下借助玻璃微管系统手工分离同一发育四分体的4个微孢子；由于细胞内浸透压高，在分离经过中，将细胞浸于27%D-山梨醇溶液并反复吹打，以毁坏细胞壁和四分体；后将4个独立的细胞放入PCR管进行裂解并测序。 随着技术的更新，Ryu等45采用10x Genomics技术一个商用的基于液滴的微流体技术高通量sc

10、RNA-Seq平台对超过10 000个拟南芥根细胞的原生质体进行单细胞转录组测序，进一步明确了不同亚群及罕见的细胞类型，集中阐述了根细胞转录组中单个细胞怎样分生根毛以及相关细胞分化的发展轨迹。该研究不仅证明了scRNA-Seq在植物研究中的可行性和实用性，还获得了拟南芥单细胞分辨率的基因表示出图谱。 2.2 空间转录组 进一步了解组织构造需要说明细胞群和基因表示出的空间关系。scRNA-Seq在一次实验中对成百上千个细胞进行测序，可无偏倚和系统地反映组织内的细胞群及其状态，但该技术并不能对组织中单个细胞的空间组织特征进行描绘叙述。空间转录组学技术为转录组学研究领域的新方向。St?hl等将小鼠大

11、脑的组织切片置于载玻片上，使DNA链与内置的标签连接在一起，进而对活性基因产生的RNA分子进行标记，当进行组织内的RNA分析时，标签会指明RNA分子存在于组织的哪个部位。利用这个方式方法，他们又对人类乳腺癌样品进行分析，并证明该方式方法不仅能提供有关疾病异质性的诊断信息，而且能用于所有类型的组织和疾病46. 与哺乳动物系统相比，植物组织和细胞存在很多特殊的构造和生理经过，包括植物细胞壁、液泡、叶绿体和次生代谢。这些差异特征使很多新型研究方式方法不能直接应用于植物领域，需要对物种或组织进行特定的优化。Giacomello等47对拟南芥、欧洲山杨和挪威云杉进行空间转录组实验，以验证该技术的可行性。

12、实验结果表示清楚，该技术在被子植物和裸子植物中均有良好的适用性。 然而，现有的空间基因表示出图谱主要是通过原位杂交这种低通量方式方法开创建立的，该方式方法不仅颇为复杂，也限制了多样本评估。近年来，一些新方式方法为空间转录组研究提供了便捷，如高级多重荧光原位杂交、成像切片或三维组织的原位测序48,49,这些研究手段在切片中定位RNA的一般工作流程如下。首先，设计目的基因的探针；其次，制备特殊的组织切片通常小于20 m，切片的制备是该技术的核心步骤，需在低温恒温器上进行，安装后置于低温中存放，玻片处理应注意避免探针的非特异性结合、组织脱水、探针杂交和扩增，以增加与杂交探针相关的信号；最后，通过显色

13、或荧光检测扩增探针信号以显示基因表示出。十分是前沿的单分子荧光原位杂交single molecule fluorescence in situ hybridization, smFISH方式方法，其采用连续多轮杂交、检测和剥离的流程，可在同一组织切片内检测到数百或数千个基因表示出目的。 当前空间转录技术多依靠于非线性的显色检测，通常从定性或半定量的角度进行分析，这掩盖了有关潜在RNA丰度的真实定量信息。对于新型的smFISH方式方法，其单个转录本可执行单分子定量，并映射到相应的宿主细胞。smFISH技术在基因表示出靶点数量上的增长为全基因组检测RNA提供了可行性，但在实践中仍具有较高的操作难度

14、，需要复杂的组织分离技术以及将基因表示出投影到现有空间信息上的量化运算方式方法。 3 银杏的转录组学研究 转录组研究能够从整体水平把握基因表示出与调控规律，开展药用植物的转录组研究有助于揭示中药有效成分的构成机制，规范入药标准，并为其育种提供参考。银杏是一种非形式植物，其相关的基因研究曾一度停滞不前，随着RNA测序RNA-Seq技术的发展，如今银杏的基因研究尤其是基因转录方面研究已获得较大进步。 3.1 基础转录研究 张楠等50最早对银杏细胞的转录组进行高通量测序，挖掘银杏内酯及紫杉醇的生物合成基因，共得到32 032个基因片段unigene。通过注释与功能分析发现，66个属于CYP450基因

15、家族，726个介入次生代谢物合成，华而不实与萜类合成相关的59个，与二萜合成相关的17个。除此之外，还从样本的叶、侧根、果实等其他组织中找到与银杏细胞CYP450同源的紫杉烷羟基化酶候选基因15个。 余洁等51对硒处理后的银杏进行测序分析，旨在挖掘银杏萜类合成的关键基因。研究得到6条与萜类合成密切相关的候选基因，但通过验证仅有DXS、MECT、HMGR这3条与转录组分析结果一致，讲明仅靠数据库分析进行转录组研究还存在一定缺陷。 随后，Han等52对银杏的无菌苗进行RNA-Seq的转录组研究，生物信息分析共得到39 941个unigene,华而不实24 645个片段均可在数据库中得到注释，并找到

16、一个新的黄酮生物合成关键酶基因GbCHI1. 路兆庚53采用高通量测序技术对银杏的叶片及胚珠进行数字基因表示出谱分析，共获得77 898个unigene,进一步丰富了转录信息。基因定量结果显示，银杏的胚珠与叶片间存在42 149个共同表示出基因，叶片和胚珠中分别有14 679和6 301个特有高表示出基因，叶片中高表示出基因编码的蛋白可能介入植物防御及光合作用，而胚珠中高表示出基因编码的蛋白主要介入细胞壁合成、黄酮类物质合成及分泌。这项研究为银杏叶片和胚珠的各种生理代谢以及胚珠的发育机制研究提供了参考。 转录是一个动态经过。He等54选取不同发育时期的银杏果作为研究对象，通过测序研究银杏果在整

17、个发育时期的转录变化，共得到68 547个unigene,整个发育经过中有3 869个基因的表示出量发生明显变化。该研究具体讨论了相关基因的注释和表示出情况，但并没有发现与黄酮合成相关的基因。刘伟等55对不同生长时期的银杏幼年树和成年树进行二代测序，分析银杏类黄酮物质合成的关键基因表示出。研究发现，有关类黄酮合成的基因中肉桂酸-4-羟化酶C4H、查耳酮合成酶CHS、花青素合成酶ANS、花青素复原酶ANR和类黄酮O-甲基转移酶FOMT基因的表示出量较高，类黄酮3 -羟化酶F3 H、类黄酮3 ，5 -羟化酶F3 5 H和黄酮醇合成酶FLS基因的表示出量则相对较低，但欠缺类黄酮物质含量的数据结果以及

18、验证实验。除此之外，Du等56尝试比拟银杏不同性别嫩芽的转录组差异，进而找到决定银杏性别的关键基因。尽管该研究共得到108 307个unigene,且华而不实51 953个unigene可在各大数据库得到注释，但并没有找到有关性别的关键基因。 3.2 深层转录研究 Parveen通过挖掘公共的RNA-Seq数据集，初次发现了可能编码与银杏萜类化合物生物合成相关的酶预测转录本，包括假定的萜类合成酶GbTPS1和GbTPS257.缺乏高质量的基因组阻碍了有关银杏的转录组研究。2021年，Guan等58对银杏的全基因组进行测序，共获得10.61 Gb的测序数据。密码子的形式分析是了解植物进化和遗传机

19、制的有效途径。但最近几年对被子植物的研究较多，而对裸子植物的研究较少。He等59基于银杏的转录组RNA-Seq数据，从68 547个候选基因中挑选出17 579个长度超过300 bp的unigene.分析发现，以A/U结尾的密码子使用频率较高，从裸子植物到双子叶植物再到单子叶植物有明显的梯度变化。同时对差异表示出的unigene分析表示清楚，高表示出的unigene倾向使用G/C结尾的密码子。而不同功能的unigene变化提示，介入环境适应的unigene使用G/C结尾的密码子频率更高层次。 银杏作为雌雄异株植物，在生长状态、生存习性等方面有很大差异。为探究性别与相关基因的关系，唐海霞等60利

20、用RNA-Seq技术对来源于同一家系的25年生银杏雌、雄花芽及大、小孢子叶球进行转录测序，共得到60 Gb的高质量序列，拼装后得到108 307个unigene,平均长度796 bp.生物信息分析以为，转录因子PYL、SNRK2、EIN3以及编码甲基转移酶的基因MET1和COMT1等可能介入了银杏的性别决定经过。 蔡雨蒙等61为阐述银杏开花的调控机制，对不同时期的银杏叶片进行转录组测序，通过比照开花前后的差异表示出基因，挑选出一个constans-like基因，对其cDNA进行克隆，得到完好的编码序列GbCOL。经深层次分析以为，该基因在银杏开花调控经过中发挥重要作用。同年该课题组通过鉴定银杏

21、花芽分化的关键基因，揭示了银杏花芽分化的主要分子机制62.收集银杏花芽3个不同分化时期未分化期、分化始期、分化盛期的RNA-seq数据，分析数字表示出谱，挑选关键基因并验证，最终得到gene.Gb_17618、gene.Gb_19790、gene.Gb_16301、gene.Gb_28337、gene.Gb_01884、gene.Gb_41704这6个花芽分化的关键基因。 Li等63近期采用RNA-Seq技术研究银杏珠心细胞的程序性死亡基因调控。KEGG数据库分析表示清楚，有72个差异基因牵涉植物激素信号转导，99个差异基因介入珠心细胞的程序性死亡，并从程序性死亡前期、开场阶段和执行阶段分别进

22、行阐述。 4 小结与瞻望 现前阶段银杏的转录组研究多为测序后与各大数据库进行比对与注释，通过GO富集、KEGG富集等手段对所关注的编码基因进行基础分析，但银杏叶内生物合成与相关基因表示出的关系、不同细胞的生物功能与互相作用、相关基因表示出的空间变化及其生物表征等问题还需进一步深切进入探寻求索。 已报道的有关银杏的转录组研究中，转录组与其他生物表征之间的对应关系均是通过间接方式获得的。无论是银杏的性别决定基因还是类黄酮成分的测序分析，均是对选定组织进行整体测序，再基于计算机软件挑选、分析关联基因。对实验结果的准确性以及能否存在假阳性无法进行客观判定，且很难实现对未知基因的探寻求索。对于这种表征被

23、 映射 到实验中而获得的结果，最常见的验证方式方法是对挑选的目的基因进行PCR检测，而空间转录组能够实现组织内目的基因表示出量的可视化，具有较好的应用前景。 若能将scRNA-Seq技术应用于银杏转录组研究，有望从分子、细胞和功能特征三方面实现全方位研究。在分子水平，scRNA-Seq技术能够获得染色体、甲基化、蛋白质抗原表位等构造变化；在细胞水平，该技术能够获得细胞的形态学特性，进而获取细胞内容物进行测序；在功能特征方面，该技术不再关注细胞群的平均状态，而是获得某一类细胞的个性特征，结合蛋白互作分析可更准确地研究其功能变化。这些结果综合银杏的药理研究与单细胞表型差异，可解释银杏药用成分大多富

24、集于银杏叶片的原因。同时，早期基因实时表示出可以作为检测细胞活性的新型手段，阐述银杏叶特定细胞类型的功能活动与转录组属性。 空间转录组与单细胞转录组测序有助于解决现前阶段面临的难题，scRNA-Seq和smFISH等前沿技术或将揭示银杏的新细胞类型、组织规则和功能特性。假使将单细胞转录组测序获得的高分辨率数据与空间转录组可视化的基因表示出相结合，或能产生愈加直观且丰富的实验结果，这有助于理解转录组学的结果是怎样反映组织内的生物合成，也为研究银杏酮酯在银杏叶内的生物合成提供一个新的思路。 以下为参考文献 1 李淑琴，朱嘉宝，武宇洲。银杏叶提取物防治心脑血管疾病的研究进展J.中国新药杂志，2021

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