监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表达,病理学论文.docx

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1、监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表达,病理学论文细胞红蛋白是由个氨基酸组成的蛋白。它的三级构造具有经典的珠蛋白个螺旋至，这个螺旋折叠成三明治构造。与肌红蛋白、血红蛋白不同，细胞红蛋白是一个六配位蛋白。哺乳类动物的细胞红蛋白广泛分布于肝脏，心脏，脑，肺，视网膜，食管，肠等各个器官。在大部分器官中，它分布在纤维母细胞及间充质细胞的细胞质，而在脑神经元中，它在细胞质及细胞核中均有分布，提示着它在脑中具有某种特殊的生理功能。自年发现细胞红蛋白以来，越来越多的研究结果表示清楚它在缺氧应激状态时时扮演着保卫组织、细胞的重要角色。神经细胞是大脑的基本功能单位，承载着大脑的感觉，运动，记忆，思维等各种生理

2、功能。临床上治疗时，我们最关心的是神经元的存亡，这和病人的预后有很大的关联。但迄今为止，关于细胞红蛋白在体外培养的原代神经元缺氧时表示出的研究尚无。本实验通过及监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表示出，为研究细胞红蛋白在缺氧应激神经细胞中的调节通路提供实验基础，进而进一步为缺氧缺血性脑病中的治疗奠定基础。 材料和方式方法 实验动物、主要试剂与仪器 孕的大鼠，由汕头大学医学院实验动物中心提供。，培养基，神经营养因子， ，多聚赖氨酸 ，试剂盒大连宝生物工程有限公司，即用型免疫组化试剂盒福州迈新，烯醇化酶一抗福州迈新及兔抗鼠二抗福州迈新， 一抗武汉博士德，胞红蛋白一抗，羊抗兔二抗博奥森，倒置相差显

3、微镜日本公司，培养箱苏州净化设备，荧光定量仪，全能显微镜，测氧仪上海华光，酶标仪。 方式方法 细胞的培养冰上取孕的胎鼠大脑皮层，用 消化后，加用含胎牛血清的培养基吹打成悬液，用台盼蓝染色进行细胞计数，以万种植于预先用多聚赖氨酸包被的六孔板及免疫印迹试验用及孔板内用，置于，的培养箱中进行培养，细胞贴壁后换 继续培养，每换液次，培养至第天用神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学方式方法神经细胞进行纯度鉴定。 神经元纯度鉴定吸净培养基，用多聚甲醛固定，甲醇双氧水浸泡，加山羊血清封闭，加一抗对照组用代替，置 冰箱过夜。第天浸洗后，加二抗，加辣根过氧化物酶，浸洗后，滴加显色约显微镜下观察显色情况，冲洗，晾干，

4、树胶封片。显微镜下随机选取个视野计数。 细胞缺氧。实验前将培养基和的气体中过夜。实验时，将细胞随机分为组，华而不实组作为正常组，其余组培养基换为预缺氧的培养基，然后充入和的气体的真空袋中，分别缺氧，缺氧后用测氧仪监测气体的氧浓度，氧气浓度在之间的进行下一步实验。 荧光定量。用、氯仿、异丙醇、乙醇裂解细胞分离沉淀，适当的水 溶 解，紫 外 分 光 光 度 计 测 定浓度和值，在逆转录酶作用下，将逆转录成。采用荧光染色技术进行实时定量多聚酶链反响 ，获取各组标本标准曲线，计算机分析值。系 统 的的 反 应 条 件：第 一 阶 段；第二阶段，个循环；第三阶段 ， ，引物设计如下。基因，引物为上游，下

5、 游。 内 参基因，引物为上游，下游。 免疫印迹试验加 孔单去污剂裂解液含于六孔板内，超声波震荡，置冰上裂解 后，移至 离心管中，下 离心，取上清并分装于离心管中，保存于冰箱中备用。总蛋白质抽提上样，分离后电转移至膜上，用脱脂牛奶封闭液室温封闭后，参加鼠抗人的多克隆抗体和 ，孵育过夜，洗膜 次，后参加辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗 ，水平摇床中晃动，室温孵育，洗膜 次，暗室曝光。用 图像分析系统对分析系统对 结果进行分析。 细胞活力实验每个缺氧组设置三个复孔神经元，缺氧前吸静培养基，洗净后每个孔加试剂 ，培养，酶标仪测量值。 缺氧后再吸静培养基，洗净后每个孔加试剂 ，培养，酶标仪测量值。算出各

6、组的相对值：，分别用、与组比拟计算出缺氧后各组细胞的生存率。 统计学方式方法所有数据以 表示，多组计量资料采用单因素方差分析，两两比拟采用检验。为差异有统计学意义。 结果 神经元纯度鉴定及细胞缺氧 大鼠大脑皮层神经元培养及鉴定 培养的海马神经细胞生长状态良好，胞体饱满，多呈梭形、锥形，少数呈多边形，胞浆丰富，核大，核仁隐约可见，突起联合成网，神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学方式方法纯度鉴定结果显示神经元纯度大于。见图。细胞缺氧后，测氧仪监测的氧浓度波动于 之间。 荧光定量 相对于正常组，缺氧组随着缺氧时间逐步升高：，分别是组的 倍， 倍， 倍，且每组之间差异有统计学意义。见图。各组比值见表。

7、免疫印迹试验 相对于正常组，缺氧组随着缺氧时间逐步升高：，分别是组的 倍， 倍， 倍，且每组之间差异有统计学意义。见表、图。 细胞活力实验结果 随着缺氧时间延长，生存率降低：，分别是组的 倍， 倍， 倍，且每组之间差异有统计学意义。见图，见表。 讨论 本实验神经元纯度到达以上，氧浓度在，确保了试验的准确性。细胞活力试验结果显示缺氧后神经元并没有大量死亡损伤最严重组仍有存活率，这或许和老鼠神经元长期处于一种低氧压的环境有关。众所周知，活细胞是产生核酸和蛋白的基础，因而缺氧后神经元的高存活率保证了有足够的神经细胞产生和蛋白，进而能真实反映在神经细胞缺氧时怎样表示出。本实验荧光定量及结果初次证实了低

8、氧使神经细胞在核酸水平和蛋白水平都过表示出。这与前人在其他组织及细胞上做的实验结果相符， 等证实了在缺氧的心、肝、肌肉、脑中，含量升高。在体外缺氧实验中，多种癌细胞包括神经肿瘤细胞株、支气管上皮癌细胞株、宫颈癌细胞株、多形胶质细胞瘤细胞株中的含量均增高。增高的程度与缺氧的时间和严重程度成正比。有趣的是，在本试验中，相对于正常组，核酸的升高倍数与蛋白的升高倍数并不平行，蛋白每个时间点的升高倍数都略高于核酸组，这或许与翻译经过和翻译后的加工、修饰有关。细胞红蛋白是在高等脊椎动物上发现的第四种珠蛋白，它广泛分布于人体各个组织器官。有学者揣测它同样具有储氧和运输氧的功能。 等揣测缺氧环境下、等复原性物

9、质的存在使产生变构而易于释放氧，进而使其能够有效的行使储氧及运输氧的功能。有研究证实了具有过氧化物酶和超氧化物歧化酶的作用，它能够利用亚铁原卟啉和硫醇残基去除活性氧 。人 为 的 使过表示出能在氧化应激是保卫细胞，去除活性氧，脂源性活性物质，降低的损伤，提高细胞的生存率。敲除则会使去除速度减慢，细胞凋亡率增高。 围生期缺氧缺血性脑病一直是新生儿致畸和致残的重要原因，足月新生儿的发病率约为 ，早产儿的发病率更高层次。脑损伤是不可逆的疾病，有着大脑性麻木，精神发育延迟缓慢，学习障碍，癫痫等多种严重的后遗症。缺氧使脑细胞线粒体功能失调，能量代谢障碍。随之而来的是氧自由基、脂质过氧化物的产生进而导致胞

10、内蛋白，的损伤，细胞的坏死，凋亡。因而，及时的去除氧自由基，脂质过氧化物酶能够更好的保卫脑细胞。近十年来，尽管人们做了大量的研究，但是还没有一套对行之有效的治疗方式方法，开发一些新的治疗方式方法势在必行。 的功能和它在脑内的广泛分布使它成为了治疗缺氧缺血性脑病的候选者之一。在缺氧应激的情况下，人为的增加表示出和敲除分别能提高细胞的生存率和降低细胞的死亡率以及减少和增加脑组织的死亡面积。但是，之前的试验之前的实验虽有证实了与大脑缺氧之间的关系，但是大脑中细胞种类繁多，并不能直接讲明在缺氧情况下与神经元的直接关系。然而临床上治疗时，我们最关心的正是神经元的存亡，这和病人的预后有很大的关联。本试验表

11、示清楚神经元在缺氧时确实会上调，结合证实的在缺氧时对细胞的保卫作用和缺氧后绝大部分神经细胞存活，我们揣测在缺氧应激能够通过去除自由基，脂源性活性物质等作用中保卫神经细胞，加强神经元对缺氧的耐受能力，提高神经细胞缺氧时的生存率。因而，或许可能成为治疗的新途径。 然而，与缺氧应激的关系及它的功能尚存在着一些争议。 等将神经母细胞瘤细胞株置于的氧中，并未 发 现升高。这或许和实验设计的氧压过高有关，正常情况下哺乳类动物大脑皮层的平均氧压，而神经母细胞瘤是神经细胞来源的。因而，的氧对于细胞株可能并不算 缺氧 刺激。有学者结扎大脑中动脉后发现梗死区的并未增高。但是他们在检测时，梗死区域细胞已经完全坏死，

12、而且检测是在之后，并不能排除在细胞未完全坏死时的之 内已经开场升高。 早期细胞未完全坏死，因而 的结论并不能讲明的表示出与无关。综上所述，神经细胞在缺氧时将会上调，这种的上调或许是神经细胞的一种自我保卫机制，因而，可能成为改善预后的潜在途径之一。当然，这还有很长的一段路要走。首先，本实验并未在神经细胞内敲除和过表示出来测试它能否真的具有保卫作用。其次，本实验并未讨论它的上下游基因，并不了解它的作用机制。将来的实验需要进一步验证这些问题。 以下为参考文献 ， ， ， ，： ， ， ， ，： ， ，： ， ， ， ： ，： ， ， ， ！ ，： ， ， ， ，： ， ， ， ： ，： ， ， ， ， ，： ， ， ， ， ，： ， ， ， ，： ， ， ，： ， ， ， ，： ， ， ， ： ，： ， ， ， ： ，： ， ， ， ，： ， ，： ， ， ，： ， ， ，： ， ， ， ，： ， ， ， ，： ， ， ，： ， ， ， ，： ， ， ， ，： ， ， ， ，： ， ， ， ，：.