不同剂量钙对染铅大鼠免疫损伤的保护机制,预防医学论文.docx

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1、不同剂量钙对染铅大鼠免疫损伤的保护机制,预防医学论文铅是严重危害危害人类健康的一种重金属元素，铅暴露对人体各组织均有毒害作用，十分是免疫毒性1.研究发现，铅暴露可导致免疫细胞数目锐减、生理活性及增殖能力降低，相关免疫蛋白合成速度降低，机体免疫功能受损2-6.钙作为机体所需的常量元素，有研究表示清楚摄入适量钙可干涉铅对机体的免疫损伤7-9,但是从细胞和分子角度调控机制不明确。本研究通过建立动物试验模型，从细胞和分子角度研究不同剂量钙对染铅大鼠免疫损伤的干涉作用，进而为进一步说明钙排铅的作用机制提供理论根据。 1 材 料 与 方 法 1.1 材料 1.1.1 试验动物：雄性 SD 大鼠出生 21

2、d,刚断乳幼鼠，平均体质量50 5g,共 60 只北京维通利华公司。 1.1.2 主要试剂：Trizol 试剂、兔抗鼠 Ig G 血清、大鼠 Ig G 标准品、血清 Ig G 试剂盒、总 RNA 提取试剂盒、Prime ScriptTMRT Master Mix 反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒南京建成。其它试剂均为国产分析纯。 1.1.3 主要仪器：D-3752 高速冷冻离心机德国赛唯斯科技Sigma,DNM-9606 酶标分析仪北京普朗新技术，HY-BM1160 分体式石蜡包埋机武汉汉谷医疗科技生物，Mx3000P 实时荧光定 量 PCR 仪美 国 安

3、捷 伦 Stratagene,Eppendorf AG 核 酸 蛋 白 检 测 仪 德 国 艾 本 德Eppendorf. 1.2 动物分组、饲养及样品采集 将 60 只 21 日龄雄性 SD 大鼠适应性喂养约 7d 后，按体质量随机分成五组：对照组去离子水+基础饲料；染铅组0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料；试验组0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料添加 0.5%碳酸钙；试验组0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料添加 1.0%碳酸钙；试验组0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料添加 2.0%碳酸钙。基础饲料山西医科大学动物中心提供中钙含量 4 g/kg,铅 0.02 mg/kg. 所有试验动物均自由摄食和饮水，连续

4、饲养60 d.喂养结束后，摘除眼球采集全血，一部分用于血细胞计数，一部分室温下倾斜静置半小时，4 、2000 r/min 离心 10 min,得血清，冷藏备用；断颈椎处死动物，取脾脏并称重记录用以计算脏器指数；一部分脾脏样品迅速在液氮中冷冻后转移至于-80 冰箱中保存，用于荧光定量 PCR 检测分析；另一部分保存于 40 g/L 多聚甲醛中固定，做切片备用。 1.3 脏器指数 脏器指数=脏器重mg/体重g 1.4 细胞计数 白细胞总数计数、白细胞分类计数、T 淋巴细胞计数方式方法参照文献10. 1.5 大鼠血清中 Ig G 含量测定 按试剂盒讲明进行测定。 1.6 脾脏切片制作及观察 采集的脾

5、脏组织固定 24 h 后，制备石蜡切片并进行常规 HE 染色，于显微镜下观察。 1.7 Real-time RT-PCR 法检测脾脏中 TNF- 、IL-1 、IL-6 m RNA 的相对表示出量 1.7.1 大鼠脾脏组织总 RNA 的提取及反转录：提取方式方法参照总 RNA 提取试剂盒，得到的 RNA 进行纯度分析之后参照试剂盒步骤进行反转录，c DNA于-80 下保藏。 1.7.2 引物设计：在 Gen Bank 中找到大鼠脾脏 -actin、TNF- 、IL-1 和 IL-6 的基因序列，通过 Primer5.0 pl s 软件设计试验所需引物，TNF- 上游引物 5 -ATGTGGAA

6、CTGGCAGAGGAG-3 ,下游引物 5 -CGAGCAGGAATGAGAAGAGG-3 ,产物大小 150bp;IL-1 上游引物 5 -TGTTTGAG-CAGCAAGGACAC-3 ,下游引物 5 -ACTAGGCGTAC-ATGGCAACC-3 ,产物大小 138bp;IL-6 上游引物 5 -AGGAAAGGAAGGGATCAAGG-3 ,下游引物5 -CAGCCTTAGCATGAGGGTTC-3 , 产 物 大 小96bp; -actin 上游引物 5 -AGCCACCAATCCACA-CAGAG-3 ,下游引物 5 -TACCCAGGCATTGCTGAC-AG-3 ,产物大小

7、 104bp. 1.7.3 RT-PCR 反响条件：95 10 min;95 15s,60 36 s,45 个循环；72 30 s,72 1 min;95 15 s,60 1min,95 15 s.产物保存于 4冰箱。 1.7.4 标准曲线的制作：取样品 c DNA 1 l 为模版，2 倍浓度梯度稀释，进行进行荧光定量 PCR反响。扩增结束后，MXPro-MX3000P 软件自动分析数据并绘制标准曲线。 1.7.5 数据收集处理和分析：软件自动收集数据并计算内参基因和目的基因的 Ct 值，然后利用公式相对表示出量=待测样品目的基因起始浓度/待测样品内参基因起始浓度/对照样品目的基因起始浓度/对照样品内参基因起始浓度，计算目的基因的相对表示出量。 1.8 数据统计与分析 全部数据采用 Graphpad Prism 5 软件进行处理，以 x s表示，并进行 t 检验，检验结果显示，若P 0.05,表示差异显着，若P 0.01,表示差异极其显着。 2 结 果 2.1 不同剂量的钙对染铅大鼠脾脏指数的影响图 1